短发夹结构RNA干扰新城疫病毒的增殖 被引量：8

1

作者 岳华 汤承 +2 位作者 李定霏 傅安静 马丽 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期154-159,共6页

以新城疫病毒(NDV)NP基因为标靶,构建3个细胞内表达发夹样结构小干扰RNA(shRNA)的质粒载体,在鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚上进行了RNAi试验,筛选出一个有效抑制病毒复制的小分子ndv1.用阳离子脂质体转染试剂Silent-fect将ndv1转染CEF,以... 以新城疫病毒(NDV)NP基因为标靶,构建3个细胞内表达发夹样结构小干扰RNA(shRNA)的质粒载体,在鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚上进行了RNAi试验,筛选出一个有效抑制病毒复制的小分子ndv1.用阳离子脂质体转染试剂Silent-fect将ndv1转染CEF,以不相关shRNA质粒载体HK为阴性对照,4h后接种NDV,与对照相比,干涉组在病毒感染后3hNP基因的表达量降低2.3倍,6h降低21.1倍,9h降低9.8倍;ndv1能在48h内完全阻断NDV在CEF中的增殖,延缓病变出现时间,减轻病变程度.将Silent-fect-ndv1混合物与NDV同时注入10日龄SPF鸡胚绒毛尿囊腔,能使105ELD50NDV感染后17h鸡胚尿囊液中病毒增殖量减少94.4%,使106ELD50 NDV感染后17h鸡胚尿囊液中病毒增殖量减少62.5%.实验结果证实,在CEF中存在RNAi机制,抑制ND VNP基因的表达能有效阻断该病毒增殖,说明NP基因在NDV复制过程中起重要作用.实验结果为进一步利用RNAi技术在CEF和鸡胚中研究病毒基因组功能及筛选抗病毒小分子奠定了基础. 展开更多

关键词 rna干涉 小发夹结构rna 新城疫病毒 鸡胚成纤维细胞 鸡胚

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生存素小干扰RNA对人腺样囊性癌ACC-2细胞移植瘤体生长的抑制作用 被引量：6

2

作者 杨军 汪欣 +1 位作者 许波 熊宇 《华西口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期433-435,共3页

目的观察生存素(Survivin)小干扰RNA(siRNA)在体内是否能抑制腺样囊性癌移植瘤体的生长。方法裸鼠体内注射稳定转染靶向Survivin基因的shRNA真核表达载体pGenesil-shRNA-Survivin后的人腺样囊性癌细胞株ACC-2,观察移植肿瘤生长情况,以... 目的观察生存素(Survivin)小干扰RNA(siRNA)在体内是否能抑制腺样囊性癌移植瘤体的生长。方法裸鼠体内注射稳定转染靶向Survivin基因的shRNA真核表达载体pGenesil-shRNA-Survivin后的人腺样囊性癌细胞株ACC-2,观察移植肿瘤生长情况,以空白对照组及阴性质粒对照组作为对照。处死裸鼠后测量移植瘤体积;采用苏木精-伊红染色病理证实移植瘤后,免疫组织化学法检测移植瘤的Survivin蛋白表达情况,半定量RT-PCR检测Survivin mRNA表达情况。结果处死裸鼠后测量移植瘤体积表明,pGenesil-shRNA-Survivin组移植瘤体积明显减小;其SurvivinmRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论siRNA能在体内明显抑制腺样囊性癌Survivin的表达,Survivin siRNA能有效抑制腺样囊性癌裸鼠体内移植瘤的生长。 展开更多

关键词 rna干扰 小发夹结构rna 腺样囊性癌

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c-myc靶向siRNA抑制人结直肠癌Colo320细胞的增殖及下调hTERT基因表达的研究 被引量：1

3

作者 黄浩 李秀 +4 位作者 肖宏 傅雷 余兰才 林世和 易艳东 《肿瘤防治研究》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期556-559,共4页

目的探讨发夹状shRNA封阻c-myc基因,抑制人结直肠癌Colo320细胞增殖、生长的状况。方法针对原癌基因c-myc构建发夹状shRNA的真核表达质粒,并转染人结直肠癌Colo320细胞。荧光定量RT-PCR检测c-myc及细胞端粒酶逆转录酶的mRNA表达,Western... 目的探讨发夹状shRNA封阻c-myc基因,抑制人结直肠癌Colo320细胞增殖、生长的状况。方法针对原癌基因c-myc构建发夹状shRNA的真核表达质粒,并转染人结直肠癌Colo320细胞。荧光定量RT-PCR检测c-myc及细胞端粒酶逆转录酶的mRNA表达,Western-blot检测c-myc、hTERT蛋白表达水平。Southern blot检测端粒的长度,PCR-ELISE法检测端粒酶活性。3H-thymidine实验分析DNA合成和细胞增殖。结果转染细胞增殖、生长皆受到抑制。同时,c-myc和hTERT的mRNA和蛋白表达显著下降,端粒的长度明显缩短,端粒酶活性降低。结论c-myc的shRNA对人结直肠癌Colo320细胞的增殖、端粒长度、端粒酶活性有特异性抑制作用,并呈剂量依赖关系。 展开更多

关键词 C-MYC 小发夹结构rna 增殖 细胞端粒酶逆转录酶

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靶向siRNA下调人结直肠癌Colo320细胞端粒长度与端粒酶逆转录酶基因表达的研究

4

作者 黄浩 李秀 +4 位作者 肖宏 傅雷 余兰才 林世和 易艳东 《中国临床药理学与治疗学》 CAS CSCD 2008年第10期1134-1138,共5页

目的:探讨发夹状shRNA封阻原癌基因(c-myc),抑制癌细胞增殖、生长的作用。方法:针对c-myc的构建发夹状shRNA的真核表达质粒,并转染人结直肠癌Colo320细胞。荧光定量RT-PCR检测c-myc及细胞端粒酶逆转录酶的mRNA的表达,Western-blot检测c-... 目的:探讨发夹状shRNA封阻原癌基因(c-myc),抑制癌细胞增殖、生长的作用。方法:针对c-myc的构建发夹状shRNA的真核表达质粒,并转染人结直肠癌Colo320细胞。荧光定量RT-PCR检测c-myc及细胞端粒酶逆转录酶的mRNA的表达,Western-blot检测c-myc、端粒酶逆转录酶(hu-man telomerase reverse transeriptase,hTERT)蛋白表达水平。Southernblot检测端粒的长度,PCR-ELISE法检测端粒酶活性。3H-thymidine实验分析DNA合成和细胞增殖。结果:转染细胞增殖、生长皆受到抑制。同时c-myc和hTERT的mRNA和蛋白表达显著下降,端粒的长度明显缩短,端粒酶活性降低。结论:c-myc的shRNA对人结直肠癌Colo320细胞的生长增殖、端粒长度、端粒酶活性有特异性抑制作用,并呈剂量依赖关系。 展开更多

关键词 C-MYC 小发夹结构rna 增殖 细胞端粒酶逆转录酶

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靶向siRNA对人子宫颈癌细胞的抑制作用 被引量：1

5

作者 黄浩 余南才 +4 位作者 江俊 刘倩 马威 郝建军 易艳东 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期16-18,共3页

目的构建增殖细胞核抗原(PCNA)的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在人HeLa细胞表达,同时观察PCNA shRNA对HeLa细胞体外增殖及生物学特性的影响。方法将PCNA cDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil-1,构建真核表达质粒pGenesil-... 目的构建增殖细胞核抗原(PCNA)的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在人HeLa细胞表达,同时观察PCNA shRNA对HeLa细胞体外增殖及生物学特性的影响。方法将PCNA cDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil-1,构建真核表达质粒pGenesil-1-PCNA(1-4),并通过酶切和测序等方法进行鉴定,将真核表达质粒pGenesil-1-PCNA(1-4)转染HeLa细胞,运用Western blot方法检测PCNA蛋白的表达,流式细胞仪分析细胞周期变化。结果PCNA shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,阻滞细胞于G0/G1期,PCNA的蛋白表达同时受到抑制。结论PCNA shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现,实验结果为进一步研究PCNA shRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 子宫颈癌 增殖细胞核抗原 小发夹结构rna

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靶向HBs基因的shRNA表达载体的构建及其抑制HepG2.2.15表达HBVsAg的作用 被引量：1

6

作者 杨尚君 王亚平 +1 位作者 唐恩洁 张国元 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期75-78,82,共5页

探索用PGenesil-1(Pg)构建的靶向乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的shRNA表达载体PGenesil-1-HBs(简称Pgs),对体外培养HepG2.2.15细胞中的HBV基因及其抗原表达的抑制作用。设计、合成靶向HBVS区的3对DNA序列,分别插入PGenesil-1中构建3... 探索用PGenesil-1(Pg)构建的靶向乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的shRNA表达载体PGenesil-1-HBs(简称Pgs),对体外培养HepG2.2.15细胞中的HBV基因及其抗原表达的抑制作用。设计、合成靶向HBVS区的3对DNA序列,分别插入PGenesil-1中构建3个siRNA表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3,经限制性内切酶,DNA序列测定等技术鉴定确认。筛选并确定最佳细胞接种量及重组质粒转染量后,分别或按不同组合转染HepG-2.2.15细胞,48h后采用半定量RT-PCR检测HBVsmRNA转录水平,免疫细胞化学技术检测HBsAg表达水平,MEIA分别检测细胞裂解液和培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平。结果表明,HBV真核表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3均能不同程度地抑制HepG2.2.15细胞中的HBsAg、HBeAg合成和HBs-mRNA转录。成功构建的HBV真核表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3,其中PgS3能显著抑制HBsAg表达(P<0.01)。多种表达载体联合对抗原表达的抑制作用效率不同。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒 小发夹结构rna rna干扰 乙型肝炎病毒表面抗原

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PCNA的shRNA的真核表达载体的构建及对子宫颈癌细胞的干预性研究 被引量：1

7

作者 黄浩 凃欣 +5 位作者 余南才 吴文莉 刘倩 马威 郝建军 易艳东 《肿瘤防治研究》 CAS CSCD 北大核心 2006年第9期662-664,共3页

目的构建PCNA的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在Hela细胞表达,同时观察PCNA的shRNA对人Hela细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。方法将PCNA的cD-NA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil-1,构建真核表达质粒pGenesil-1-PCN... 目的构建PCNA的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在Hela细胞表达,同时观察PCNA的shRNA对人Hela细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。方法将PCNA的cD-NA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil-1,构建真核表达质粒pGenesil-1-PCNA1-4,并通过酶切和测序等方法进行鉴定,将真核表达质粒pGenesil-1-PCNA1-4转染子宫颈癌细胞,运用Westernblot检测PCNA的蛋白表达,流式细胞仪分析细胞周期变化。结果PCNA的shRNA能显著抑制人Hela细胞的生长,阻滞细胞G0/G1—S期,PCNA的蛋白表达同时受到抑制。结论PCNA的shRNA能显著抑制人Hela细胞的生长,其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现,实验结果为进一步研究PC-NA的shRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 子宫颈癌 增殖细胞核抗原 小发夹结构rna 子宫颈癌细胞

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Pkm2-shRNA真核表达载体的构建和对急性早幼粒细胞白血病耐药细胞株的作用研究 被引量：1

8

作者 孙明莉 王冠军 +5 位作者 李江 崔久嵬 张爱丽 王中南 李晓萌 李薇 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2010年第1期85-89,共5页

本研究旨在构建M2型丙酮酸激酶(M2-pyruvate kinase;PKM2)的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体,研究特异性沉默pkm2基因对急性早幼粒细胞白血病(APL)耐药性的影响。设计pkm2基因的3个特异shRNA序列,利用基因重组技术将其克隆到含有U6... 本研究旨在构建M2型丙酮酸激酶(M2-pyruvate kinase;PKM2)的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体,研究特异性沉默pkm2基因对急性早幼粒细胞白血病(APL)耐药性的影响。设计pkm2基因的3个特异shRNA序列,利用基因重组技术将其克隆到含有U6启动子的PBSU6载体上,通过酶切和测序等方法鉴定重组质粒的正确性。利用Western blot方法检测了pkm2-shRNA对急性早幼粒细胞白血病耐药细胞株NB4R2细胞内源性M2-PK蛋白表达的影响,通过NBT还原实验检测了pkm2基因沉默后NB4R2细胞分化情况。结果表明:成功构建了3个有效特异的pkm2-shRNA,在蛋白水平上证明了其对NB4R2细胞M2-PK基因沉默的有效性。发现干涉M2-PK基因后,可显著地促进耐药细胞NB4R2细胞的分化。结论:DNA载体途径的pkm2-shRNA能促进早幼粒细胞白血病细胞的分化,具有基因靶向药物开发前景。 展开更多

关键词 M2型丙酮酸激酶 小发夹结构rna NB4R2细胞 急性早幼粒细胞白血病

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针对HBs基因的shRNA表达载体的构建及鉴定

9

作者 杨尚君 唐恩洁 张大容 《川北医学院学报》 CAS 2009年第5期425-427,共3页

目的以PGenesil-1(Pg)为载体构建针对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的shRNA表达载体PGenesil-1-HBs(Pgs)。方法设计、合成针对HBs区的三对DNA序列,分别插入PGenesil-1中,并对重组质粒进行限制性内切酶谱和DNA序列测定分析。结果3个... 目的以PGenesil-1(Pg)为载体构建针对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的shRNA表达载体PGenesil-1-HBs(Pgs)。方法设计、合成针对HBs区的三对DNA序列,分别插入PGenesil-1中,并对重组质粒进行限制性内切酶谱和DNA序列测定分析。结果3个不同的重组shRNA表达载体经限制性酶识别和DNA序列测定完全正确。结论成功构建了3个针对HBs基因的shRNA表达载体。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒 小发夹结构rna rna干扰 乙型肝炎病毒表面抗原

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PCNA的shRNA对子宫颈癌细胞的抑制研究

10

作者 黄浩 凃欣 +5 位作者 余南才 吴文莉 刘倩 马威 郝建军 易艳东 《武汉大学学报（医学版）》 CAS 2006年第2期170-173,共4页

目的:构建增殖细胞抗原(PCNA)的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在HeLa细胞表达,同时观察PCNA的shRNA对人HeLa细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。方法:将PCNA的cDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil1,构建真核表达质粒... 目的:构建增殖细胞抗原(PCNA)的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在HeLa细胞表达,同时观察PCNA的shRNA对人HeLa细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。方法:将PCNA的cDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil1,构建真核表达质粒pGenesil1PCNA14,并通过酶切和测序等方法进行鉴定,将真核表达质粒pGenesil1PCNA14转染子宫颈癌细胞,运用Westernblot检测PCNA的蛋白表达,流式细胞仪分析细胞周期变化。结果:PCNA的shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,阻滞细胞G0/G1S期,PCNA的蛋白表达同时受到抑制。结论:PCNA的shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现,实验结果为进一步研究PCNA的shRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 子宫颈癌 增殖细胞核抗原 小发夹结构rna 子宫颈癌细胞

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TACE基因shRNA真核表达载体的构建及其对HeLa细胞生物学活性的影响

11

作者 章杰 闫媛 +1 位作者 杨渝珍 杨业金 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期426-430,共5页

目的构建靶向肿瘤坏死因子转换酶（TACE）的小发夹结构RNA（shRNA）的真核表达载体,观察干扰TA-CE表达对HeLa细胞增殖和凋亡的影响。方法设计针对TACE基因的4个shRNA序列,构建真核表达载体shR-NA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4。通过酶切和... 目的构建靶向肿瘤坏死因子转换酶（TACE）的小发夹结构RNA（shRNA）的真核表达载体,观察干扰TA-CE表达对HeLa细胞增殖和凋亡的影响。方法设计针对TACE基因的4个shRNA序列,构建真核表达载体shR-NA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4。通过酶切和测序等方法进行鉴定。转染HeLa细胞后,用Realtime PCR的方法检测其对HeLa细胞TACE基因表达的影响;用ELISA检测细胞分泌的sTNF-α,间接反映干扰TACE的效果;用MTT法检测细胞增殖活性;用DNA ladder和流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功构建和筛选出了针对TACE基因的3个有效的特异性真核表达载体,且均在不同程度上抑制了HeLa细胞TACE基因的表达。ELISA检测结果与Realtime PCR实验结果相符。同时发现干扰TACE基因后,HeLa细胞的生长受到抑制,凋亡率升高,与对照组相比差异有显著性意义（P〈0.05）。实验组转染shRNA1~3后72h可见特征性的基因组DNA ladder条带。结论所构建的TACEshR-NA真核表达载体能显著抑制TACE的表达。干扰TACE基因的表达可有效抑制HeLa细胞的增殖并诱导其凋亡。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子转换酶 小发夹结构rna HELA细胞 细胞凋亡

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