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TNFR1BP/IgGFc融合蛋白载体的构建、表达及其生物学活性研究
1
作者 黄丽霞 尹丙姣 +4 位作者 王晶 梁慧芳 曾庆岭 姜小丹 李卓娅 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期561-564,F0002,共5页
目的构建肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)封闭肽与IgGFc融合蛋白的真核表达载体,检测其表达和生物学活性。方法将合成的TNFR1封闭肽(TNFR1BP)基因片段插入质粒pIG/3C,构建真核表达载体pIG/3C-TNFR1BP;脂质体法将重组载体转染COS-7细胞;ELISA和... 目的构建肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)封闭肽与IgGFc融合蛋白的真核表达载体,检测其表达和生物学活性。方法将合成的TNFR1封闭肽(TNFR1BP)基因片段插入质粒pIG/3C,构建真核表达载体pIG/3C-TNFR1BP;脂质体法将重组载体转染COS-7细胞;ELISA和Western blot法检测转染细胞的培养上清中TNFR1BP/IgGFc融合蛋白的表达;间接免疫荧光抑制实验、细胞毒抑制实验检测融合蛋白对TNFR1的封闭作用。结果经PCR和核苷酸序列测定证实TNFR1BP基因正确插入质粒pIG/3C。ELISA检测证实,在转染细胞培养上清中有融合蛋白的表达;间接免疫荧光抑制实验和细胞毒抑制实验证实融合蛋白能结合L929细胞表面的TNFR1,并能抑制分泌型肿瘤坏死因子α(sTNF-α)介导的细胞毒作用。结论成功构建并实现TNFR1BP/IgGFc融合蛋白真核表达;体外实验证实此融合蛋白可通过与细胞表面TNFR1结合,从而拮抗sTNF-α介导的生物学效应。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子-Α 真核表达 IgGFc融合蛋白 封闭肽
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新型融合蛋白pro-SIRPα的构建及体外活性研究
2
作者 赵一蓉 徐进 +5 位作者 郭怀祖 李彦韬 陈曦 钱卫珠 李晶 李博华 《现代免疫学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期89-95,共7页
筛选获得肿瘤特异性释放封闭肽的高亲和力新型融合蛋白pro-SIRPα并对其体外活性进行了研究。首先利用噬菌体表面展示肽库筛选能与信号调节蛋白SIRPα-cv1活性区结合的短肽,并以含有尿激酶(uPA)酶切位点的linker将其连接在SIRPα-cv1融... 筛选获得肿瘤特异性释放封闭肽的高亲和力新型融合蛋白pro-SIRPα并对其体外活性进行了研究。首先利用噬菌体表面展示肽库筛选能与信号调节蛋白SIRPα-cv1活性区结合的短肽,并以含有尿激酶(uPA)酶切位点的linker将其连接在SIRPα-cv1融合蛋白的氨基末端,构建完整的pro-SIRPα。通过竞争ELISA实验验证pro-SIRPα前端封闭肽具有封闭效应。由于氨基端封闭肽的存在,pro-SIRPα与CD47的结合能力显著下降。而肿瘤微环境中富含uPA,可水解pro-SIRPα氨基末端的linker,使得封闭肽解离并暴露出的完整SIRPα-cv1,恢复与CD47的结合能力。因此,pro-SIRPα可特异性作用于肿瘤细胞,减少了与正常血液系统细胞的非特异性结合,降低了毒性以及可能引起的抗原沉默(antigen sink effect)现象。我们的体外实验还证实,与单独应用抗EGFR-IgG1单抗相比,pro-SIRPα与抗EGFR-IgG1单抗联用可显著增强巨噬细胞对A431肿瘤细胞的吞噬作用。pro-SIRPα的研制可能为肿瘤靶向治疗提供新的策略。 展开更多
关键词 SIRPα CD47 封闭肽 高亲和力突变体
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TNF受体封闭肽对大鼠腹腔巨噬细胞功能的影响 被引量：6
3
作者 何亚萍 尹丙姣 +4 位作者 李卓娅 徐勇 姜小丹 冯玮 熊平 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期385-387,391,共4页
目的 :观察TNF受体封闭肽在体外对大鼠腹腔巨噬细胞功能的影响。方法 :用NBT的方法检测呼吸爆发 ;用RT PCR检测大鼠腹腔巨噬细胞IL 1βmRNA和TNF αmRNA水平 ;用Westernblot检测大鼠腹腔巨噬细胞NF κBp6 5核转位。 结果 :TNF受体封闭... 目的 :观察TNF受体封闭肽在体外对大鼠腹腔巨噬细胞功能的影响。方法 :用NBT的方法检测呼吸爆发 ;用RT PCR检测大鼠腹腔巨噬细胞IL 1βmRNA和TNF αmRNA水平 ;用Westernblot检测大鼠腹腔巨噬细胞NF κBp6 5核转位。 结果 :TNF受体封闭肽可完全拮抗TNF α诱导大鼠腹腔巨噬细胞呼吸爆发 ,明显抑制TNF α诱导的IL 1βmRNA和TNF αmRNA的转录 ,使腹腔巨噬细胞TNF α诱导的NF κBp6 5核转位明显减少。结论 :TNF受体封闭肽在体外能有效抑制TNF α诱导的大鼠腹腔巨噬细胞功能。 展开更多
关键词 TNF受体封闭肽 大鼠 腹腔巨噬细胞功能 影响 RT—PCR检测
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TNF结合肽和TNFR封闭肽的筛选及其鉴定 被引量：4
4
作者 尹丙姣 王晶 +3 位作者 喻明霞 姜小丹 冯玮 李卓娅 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期670-673,677,共5页
目的筛选能与TNF-α结合的环肽(称为TNF结合肽)以及既能与TNFR-Ⅰ结合又不诱导TNFR相关生物学效应的环肽(称为TNFR封闭肽)。方法采用噬菌体随机肽库展示技术分别以hrTNF-α和hrTNFRⅠ为诱饵进行亲和筛选,ELISA方法进行噬菌体特异性鉴定... 目的筛选能与TNF-α结合的环肽(称为TNF结合肽)以及既能与TNFR-Ⅰ结合又不诱导TNFR相关生物学效应的环肽(称为TNFR封闭肽)。方法采用噬菌体随机肽库展示技术分别以hrTNF-α和hrTNFRⅠ为诱饵进行亲和筛选,ELISA方法进行噬菌体特异性鉴定,应用细胞毒抑制实验和RT-PCR技术等进行噬菌体的生物学效应鉴定。根据噬菌体展示肽的DNA序列合成环肽。结果对肽库进行3轮筛选后,噬菌体克隆具有良好的富集效果;5种TNF结合噬菌体克隆(5、6、7、32及38号克隆)和2种TNFR封闭噬菌体(X2、X4号克隆)分别能与TNF-α和TNFR特异性结合,并且均能显著抑制sTNF-α对L929细胞和U937细胞的杀伤作用,TNFR封闭噬菌体不仅本身无促进U937细胞IL-1βmRNA转录的作用,而且还能有效抑制sTNF-α的生物学效应;并且发现X4与32号、X4与38号联用的细胞毒抑制效应均较其单独作用的效果好,其中X4与38号联用的抑制率高达85.3%,显著高于各自单独的抑制作用(P<0.01)。选择32、38和X4号噬菌体克隆进行DNA测序并合成环肽。结论从噬菌体随机环肽库中筛选得到能够抑制sTNF-α生物学功能的TNF结合肽和TNFR封闭肽,为研制TNF相关的多肽类抗炎药物奠定了实验基础。 展开更多
关键词 噬菌体肽库 肿瘤坏死因子-Α 肿瘤坏死因子结合肽 肿瘤坏死因子受体封闭肽
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TNF结合肽和TNFR封闭肽对TNF-α体外介导的生物学抑制效应的实验研究 被引量：4
5
作者 尹丙姣 喻明霞 +2 位作者 王晶 姜晓丹 李卓娅 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期172-175,共4页
目的检测TNF-α结合肽(TBP)和TNFR封闭肽(TRBP)的生物学特性及功能。方法以GFP-TNF融合蛋白竞争结合实验,检测TBP和TRBP的特异性。用非变性PAGE检测TBP和TRBP的互补结合性。用细胞毒抑制实验,观察TBP和TRBP对TNF-α杀伤U937细胞的抑制... 目的检测TNF-α结合肽(TBP)和TNFR封闭肽(TRBP)的生物学特性及功能。方法以GFP-TNF融合蛋白竞争结合实验,检测TBP和TRBP的特异性。用非变性PAGE检测TBP和TRBP的互补结合性。用细胞毒抑制实验,观察TBP和TRBP对TNF-α杀伤U937细胞的抑制作用。用硝基蓝四氮唑(NBT)还原能力和RT-PCR技术,检测TBP和TRBP对TNF-α诱导的人外周血单核细胞的呼吸爆发和对促炎症因子IL-1β和IL-8mRNA水平的抑制作用。结果TBP和TRBP能抑制GFP-TNF融合蛋白与细胞膜上TNFR的结合。非变性PAGE证明,TBP与TRBP之间的结合,为非配体和受体的结合;TBP和TRBP对TNF-α的细胞毒效应均有抑制作用,且随着剂量的增加而增强,二者联用(即pep.38+X4)效果更好。TBP和TRBP联用,能有效地抑制TNF-α和IFN-γ诱导的单核细胞呼吸爆发的强度,抑制TNF-α诱导的IL-1β和IL-8mRNA的转录。结论TBP和TRBP具有结合TNF-α和TNFR的特异性,但二者的结合为非配体和受体的相互结合。TBP和TRBP对TNF-α介导的各种生物学效应均具有抑制作用,二者联用效果更显著。 展开更多
关键词 TNF-Α TNF结合肽 TNFR封闭肽
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TNFR Ⅰ封闭肽-hIgGFc融合蛋白和TNFR Ⅰ封闭肽对TNF-α介导的生物学效应的封闭作用 被引量：3
6
作者 黄丽霞 尹丙姣 +4 位作者 王晶 梁慧芳 曾庆岭 姜小丹 李卓娅 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期776-780,共5页
目的:研究比较TNFR Ⅰ封闭肽-hIgGFc融合蛋白(TNFR1BP/hIgGFc)和TNFR Ⅰ封闭肽(TNFR1BP)生物学特性及功能,为开发治疗TNF-α相关疾病的肽类药物奠定基础。方法:通过流式细胞术和细胞毒抑制实验检测TNFR1BP/hIgGFc和人工合成TNFR1BP对TNF... 目的:研究比较TNFR Ⅰ封闭肽-hIgGFc融合蛋白(TNFR1BP/hIgGFc)和TNFR Ⅰ封闭肽(TNFR1BP)生物学特性及功能,为开发治疗TNF-α相关疾病的肽类药物奠定基础。方法:通过流式细胞术和细胞毒抑制实验检测TNFR1BP/hIgGFc和人工合成TNFR1BP对TNFRⅠ的封闭作用;通过RT-PCR、激光共聚焦显微镜技术检测融合蛋白和封闭肽对TNF-α介导的生物学效应的封闭作用。结果:流式细胞术证实TNFR Ⅰ封闭肽-hIgGFc融合蛋白和人工合成TNFR Ⅰ封闭肽二者均能抑制TNF-α与细胞膜表面TNFR1的结合;RT-PCR结果显示二者均可明显抑制TNF-α诱导的IL-1β及IL-8等促炎细胞因子的mRNA表达;激光共聚焦显微镜显示二者均可明显拮抗TNF-α诱导的人单核细胞NF-κB核转位的发生。结论:TNFR1BP/hIgGFc和TNFR1BP均可与细胞表面TNFR Ⅰ结合,拮抗TNF-α介导的生物学效应。 展开更多
关键词 TNFR Ⅰ封闭肽-hIgGFc融合蛋白 TNFR Ⅰ封闭肽 TNF-Α
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TNF受体封闭肽对大鼠佐剂性关节炎的影响 被引量：3
7
作者 何亚萍 李卓娅 +3 位作者 姜晓丹 冯玮 徐勇 熊平 《药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第12期889-892,共4页
目的　观察肿瘤坏死因子 (TNF)受体封闭肽对大鼠佐剂性关节炎的影响。方法　注射弗氏完全佐剂建立大鼠佐剂性关节炎模型 ,在关节局部注射TNF受体封闭肽 ,观察对大鼠关节肿胀度、关节组织病理改变及腹腔巨噬细胞表达IL 1βmRNA和TNF αmR... 目的　观察肿瘤坏死因子 (TNF)受体封闭肽对大鼠佐剂性关节炎的影响。方法　注射弗氏完全佐剂建立大鼠佐剂性关节炎模型 ,在关节局部注射TNF受体封闭肽 ,观察对大鼠关节肿胀度、关节组织病理改变及腹腔巨噬细胞表达IL 1βmRNA和TNF αmRNA(RT PCR)的影响。 结果　建立了与人类类风湿性关节炎极其相似的大鼠佐剂性关节炎模型 ;TNF受体封闭肽治疗 10d后 ,大鼠踝关节肿胀完全受到抑制 ;关节组织内炎症细胞浸润减少 ,炎性病理损伤明显减轻 ;大鼠腹腔巨噬细胞表达的TNF αmRNA和IL 1βmRNA明显减低。 结论　TNF受体封闭肽通过抑制佐剂性关节炎TNF α和IL 1的产生 ,而发挥抗炎作用 ,明显减轻关节的病理性损伤 ,有效抑制关节炎的临床进程。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子-Α TNF受体封闭肽 佐剂性关节炎 类风湿性关节炎
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TNF结合肽和TNFR封闭肽对TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用 被引量：2
8
作者 尹丙姣 喻明霞 +2 位作者 王晶 姜晓丹 李卓娅 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期663-667,共5页
目的检测TNF-α结合肽和TNFR封闭肽对TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用。方法以TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎为模型,联合给予TNF-α结合肽和TNFR封闭肽[2.5mg/(kg·次)]处理,同时设各种对照;观察大鼠的症状、体重、结肠组织病... 目的检测TNF-α结合肽和TNFR封闭肽对TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用。方法以TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎为模型,联合给予TNF-α结合肽和TNFR封闭肽[2.5mg/(kg·次)]处理,同时设各种对照;观察大鼠的症状、体重、结肠组织病理改变等;采用一般的生物化学检测方法检测大鼠血清和结肠组织中NO含量、活性氧以及结肠组织中MP0活性等炎性介质;采用RT-PCR技术检测大鼠腹腔MIL-1β和IL-8等mRNA水平的变化;采用免疫组织化学SP法检测大鼠结肠组织中TNF-α蛋白质表达水平的改变。结果TNF结合肽和TNFR封闭肽联合多肽组大鼠的体重、结肠组织形态学评分、组织病理学评分及血清和结肠组织中NO含量、MP0活性等指标均显著低于模型组及无关肽组(P<0.01);其腹腔M的IL-1β和IL-8 mRNA水平和结肠组织中TNF-α蛋白的表达水平及阳性细胞率也显著低于显著低于模型组及无关肽组(P<0.01)。结论TNF结合肽和TNFR封闭肽联用可显著减轻TNBS诱导大鼠实验性溃疡性结肠炎的病理损伤,改善症状,有效抑制大鼠血清和结肠组织中NO含量以及结肠组织中MP0活性的活性,抑制大鼠腹腔巨噬细胞中Il-1β、IL-8的mRNA转录和结肠组织中TNF-α蛋白的表达,对TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎具有治疗作用。本研究为进一步研制和开发拮抗TNF-α的新型肽类药物提供了重要的实验依据。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子-Α TNF结合肽 TNFR封闭肽溃疡性结肠炎
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氨基酸置换增强肿瘤坏死因子受体封闭肽的生物学效应
9
作者 张磊 冯健男 +4 位作者 王晶 熊霞辉 姜小丹 冯玮 李卓娅 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期543-546,共4页
目的增强肿瘤坏死因子受体(TNFR)封闭肽的生物学效应。方法通过计算机模建,模拟并推测提高TNFR封闭肽生物学效应需置换的位点和氨基酸;合成原封闭肽和突变肽;受体竞争抑制结合实验比较原肽与突变肽对绿色荧光蛋白-肿瘤坏死因子融合蛋白(... 目的增强肿瘤坏死因子受体(TNFR)封闭肽的生物学效应。方法通过计算机模建,模拟并推测提高TNFR封闭肽生物学效应需置换的位点和氨基酸;合成原封闭肽和突变肽;受体竞争抑制结合实验比较原肽与突变肽对绿色荧光蛋白-肿瘤坏死因子融合蛋白(GFP-TNF)结合TNFR的竞争抑制效应;细胞毒作用抑制实验比较原肽与突变肽对TNFR的封闭效应。结果受体竞争抑制结合实验结果显示:两种肽均可与GFP-TNF竞争结合U937细胞表面的TNFR。原肽的半数抑制浓度(IC50)为140μg/ml,而突变肽为100μg/ml,提示突变肽的竞争抑制效应高于原肽;细胞毒抑制实验显示:突变肽对于TNF-α杀伤U937细胞的细胞毒作用的抑制率为57%,高于原肽的40%(P<0.01)。结论突变肽的生物学效应强于原肽。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子受体封闭肽 计算机模建
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