目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性...目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL。结论制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。展开更多
为阐明热激蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)在甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hbner)幼虫抵抗高温过程中的作用,克隆了其HSP90基因cDNA全长序列,并检测了在系列高温胁迫下不同龄期幼虫体内其相对表达量。根据已报道的热激蛋白90基因...为阐明热激蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)在甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hbner)幼虫抵抗高温过程中的作用,克隆了其HSP90基因cDNA全长序列,并检测了在系列高温胁迫下不同龄期幼虫体内其相对表达量。根据已报道的热激蛋白90基因序列同源性设计简并引物,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了甜菜夜蛾HSP90基因全长cDNA(GenBank登录号FJ862050)。该cDNA序列开放阅读框长2154bp,编码717个氨基酸,预测的相对分子量和等电点分别为82.6kD和5.0。该序列具有HSP90家族的典型特征和特殊的功能结构域,并且与多种生物的HSP90基因序列有较高的同源性。为了研究HSP90抵抗高温的作用,构建荧光定量RT-PCR体系,检测了37,39,41,43和45℃胁迫下甜菜夜蛾不同龄期幼虫体内HSP90表达量的变化。结果表明,高温胁迫对甜菜夜蛾幼虫体内的HSP90表达具有明显的诱导作用。幼虫体内HSP90表达量随着温度升高呈增加的趋势。43℃和45℃胁迫下,各龄幼虫体内HSP90的表达量均显著高于常温(P<0.05),但不同龄期之间没有显著差异。这说明HSP90在甜菜夜蛾幼虫抗高温中起到重要作用。展开更多
目的了解北京地区2009～2010年甲型流感的流行情况,为预防和控制北京地区甲型流感的流行提供依据。方法以解放军总医院作为哨点医院,用Real-ti me RT-PCR从流感样病例咽拭子中检测甲型流感病毒,监测甲型流感病毒在该地区的流行情况。结...目的了解北京地区2009～2010年甲型流感的流行情况,为预防和控制北京地区甲型流感的流行提供依据。方法以解放军总医院作为哨点医院,用Real-ti me RT-PCR从流感样病例咽拭子中检测甲型流感病毒,监测甲型流感病毒在该地区的流行情况。结果 2 134份标本中甲型流感病毒阳性575份,阳性率为26.94%,其中甲型H1N1占46.26%,季节性H3N2型占40.70%,H1N1型占3.30%,未分型占9.74%。甲型流感病毒感染者年龄分布峰值在20～30岁之间,感染时间分布的2个峰值在第37周和47周,分别以H3N2型和甲型H1N1流感病毒为主。结论 2009～2010年北京地区流行的甲型流感病毒以甲型H1N1为主,其次是H3N2,甲型H1N1取代了季节性H3N2流感病毒在冬季的流行。应加强对甲型流感病毒的监测,密切关注甲型H1N1流感病毒的抗原变化有重要意义。展开更多
根据牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)膜蛋白M基因设计引物及探针,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性、重复性进行了测定,并对人工感染BPIV3的牛群...根据牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)膜蛋白M基因设计引物及探针,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性、重复性进行了测定,并对人工感染BPIV3的牛群临床样本进行了检测。结果显示,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR的最低检测限为17.6copies/μL,同时进行批内、批间5次重复性试验,变异系数均小于2.5%。应用建立的方法检测牛传染性鼻气管炎病毒、牛腺病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒1型,结果均为阴性,说明建立的方法特异性较强。用建立的方法检测人工感染BPIV3的犊牛鼻拭子样本,检测结果与样本TCID50的测定结果相符合,但比其更敏感。结果表明,本试验中建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR可以作为BPIV3早期诊断及定量分析的有效技术手段。展开更多
目的探讨鲍曼不动杆菌临床分离株对常用抗菌药物的耐药性及与外排泵adeA基因表达水平之间的关系。方法琼脂二倍稀释法检测鲍曼不动杆菌临床分离株对17种常用抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC);PCR法扩增外排泵编码基因adeA;实时荧光定量RT-PC...目的探讨鲍曼不动杆菌临床分离株对常用抗菌药物的耐药性及与外排泵adeA基因表达水平之间的关系。方法琼脂二倍稀释法检测鲍曼不动杆菌临床分离株对17种常用抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC);PCR法扩增外排泵编码基因adeA;实时荧光定量RT-PCR(Real Time Fluorescent Quantitative RT-PCR)法检测adeA基因的mRNA表达水平。结果药敏结果显示86株鲍曼不动杆菌对多粘菌素B全部敏感(100%),其次是美罗培南(73.2%)、亚胺培南(70.9%)。耐药率最高的是庆大霉素(84.9%),其次为美罗西林(83.7%)和环丙沙星(79.1%)。55株菌为多重耐药株(64%),其中5株(5/86)对多粘菌素B外的所有抗菌药物耐药(5.8%)。adeA的检出阳性率为84.9%(73/86),Real Time RT-PCR结果显示多重耐药菌株adeA基因的mRNA相对表达量均高于敏感菌株,其中3株相对表达量为敏感菌株平均表达水平的30倍以上。结论鲍曼不动杆菌临床分离株耐药情况严重,其主动外排系统adeA基因表达增强在多重耐药性形成中起重要作用。展开更多
文摘目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL。结论制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。
文摘为阐明热激蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)在甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hbner)幼虫抵抗高温过程中的作用,克隆了其HSP90基因cDNA全长序列,并检测了在系列高温胁迫下不同龄期幼虫体内其相对表达量。根据已报道的热激蛋白90基因序列同源性设计简并引物,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了甜菜夜蛾HSP90基因全长cDNA(GenBank登录号FJ862050)。该cDNA序列开放阅读框长2154bp,编码717个氨基酸,预测的相对分子量和等电点分别为82.6kD和5.0。该序列具有HSP90家族的典型特征和特殊的功能结构域,并且与多种生物的HSP90基因序列有较高的同源性。为了研究HSP90抵抗高温的作用,构建荧光定量RT-PCR体系,检测了37,39,41,43和45℃胁迫下甜菜夜蛾不同龄期幼虫体内HSP90表达量的变化。结果表明,高温胁迫对甜菜夜蛾幼虫体内的HSP90表达具有明显的诱导作用。幼虫体内HSP90表达量随着温度升高呈增加的趋势。43℃和45℃胁迫下,各龄幼虫体内HSP90的表达量均显著高于常温(P<0.05),但不同龄期之间没有显著差异。这说明HSP90在甜菜夜蛾幼虫抗高温中起到重要作用。
文摘根据牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)膜蛋白M基因设计引物及探针,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性、重复性进行了测定,并对人工感染BPIV3的牛群临床样本进行了检测。结果显示,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR的最低检测限为17.6copies/μL,同时进行批内、批间5次重复性试验,变异系数均小于2.5%。应用建立的方法检测牛传染性鼻气管炎病毒、牛腺病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒1型,结果均为阴性,说明建立的方法特异性较强。用建立的方法检测人工感染BPIV3的犊牛鼻拭子样本,检测结果与样本TCID50的测定结果相符合,但比其更敏感。结果表明,本试验中建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR可以作为BPIV3早期诊断及定量分析的有效技术手段。
文摘目的探讨鲍曼不动杆菌临床分离株对常用抗菌药物的耐药性及与外排泵adeA基因表达水平之间的关系。方法琼脂二倍稀释法检测鲍曼不动杆菌临床分离株对17种常用抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC);PCR法扩增外排泵编码基因adeA;实时荧光定量RT-PCR(Real Time Fluorescent Quantitative RT-PCR)法检测adeA基因的mRNA表达水平。结果药敏结果显示86株鲍曼不动杆菌对多粘菌素B全部敏感(100%),其次是美罗培南(73.2%)、亚胺培南(70.9%)。耐药率最高的是庆大霉素(84.9%),其次为美罗西林(83.7%)和环丙沙星(79.1%)。55株菌为多重耐药株(64%),其中5株(5/86)对多粘菌素B外的所有抗菌药物耐药(5.8%)。adeA的检出阳性率为84.9%(73/86),Real Time RT-PCR结果显示多重耐药菌株adeA基因的mRNA相对表达量均高于敏感菌株,其中3株相对表达量为敏感菌株平均表达水平的30倍以上。结论鲍曼不动杆菌临床分离株耐药情况严重,其主动外排系统adeA基因表达增强在多重耐药性形成中起重要作用。
