亚位点＋1处突变提高软化类芽胞杆菌环糊精糖基转移酶底物麦芽糊精特异性 被引量：8

1

作者 许乔艳 韩瑞枝 +3 位作者 李江华 堵国成 刘龙 陈坚 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期98-108,共11页

通过改造来源于软化类芽胞杆菌Paenibacillus macerans的环糊精糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,CGT酶)的+1亚位点提高其对麦芽糊精的底物特异性,并进一步提高以麦芽糊精为糖基供体催化合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(AA... 通过改造来源于软化类芽胞杆菌Paenibacillus macerans的环糊精糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,CGT酶)的+1亚位点提高其对麦芽糊精的底物特异性,并进一步提高以麦芽糊精为糖基供体催化合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的效率。首先对+1亚位点附近的3个氨基酸残基Leu194、Ala230和His233分别进行定点饱和突变,得到3个优势突变体L194N(亮氨酸→天冬酰胺),A230D(丙氨酸→天冬氨酸),H233E(组氨酸→谷氨酸),然后以这3个优势突变体为模板进一步进行两点和三点复合突变,获得7个复合突变体。研究结果表明,突变体L194N/A230D/H233E以麦芽糊精为底物合成AA-2G的产量最高,达到1.95 g/L,比野生型CGT酶提高了62.5%。对获得的突变体进行动力学分析,发现高浓度的底物L-AA对突变型CGT酶催化的酶促反应具有抑制作用。确定了突变体酶促反应的最适温度、pH和反应时间。模拟突变体的三维结构并进行分析,突变体底物特异性的改善可能与CGT酶第194位、230位和233位的氨基酸残基的亲水性及与底物分子间的作用力的改变有关。 展开更多

关键词 环糊精糖基转移酶 L-抗坏血酸 麦芽糊精 2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸 定点饱和突变

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环糊精葡萄糖基转移酶182位点定点改造催化合成糖基化染料木素 被引量：6

2

作者 柴宝成 姜钰琳 +1 位作者 倪晔 韩瑞枝 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期749-759,共11页

染料木素及其单糖苷衍物在食品和医药领域具有重要作用,但难溶于水的特性极大地限制了其应用范围,研究表明糖基化反应可有效提高其水溶性。文中针对来源于软化芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶,研究其对染料木素单糖苷衍生物槐角苷的糖... 染料木素及其单糖苷衍物在食品和医药领域具有重要作用,但难溶于水的特性极大地限制了其应用范围,研究表明糖基化反应可有效提高其水溶性。文中针对来源于软化芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶,研究其对染料木素单糖苷衍生物槐角苷的糖基化反应。通过对D182位点的定点饱和突变,突变酶D182C较WT转化率提高了13.42%,主要糖基化产物(槐角苷单糖苷、二糖苷、三糖苷)分别提高了39.35%、56.05%和64.81%。酶学性质研究发现,D182C较WT的环化、水解、歧化活力均有所提高。且最适pH和温度分别为6和40℃。动力学研究发现,D182C针对底物(糖基供体和受体)的K_(m)值较WT均有所降低,且催化效率k_(cat)/K_(m)则明显提高,说明D182C对底物的亲和力相较于WT有大幅提升。同源建模及分子对接结果表明,突变酶D182C糖基化效率提高的原因可能与底物作用力增加有关。 展开更多

关键词 染料木素 槐角苷 环糊精葡萄糖基转移酶 水溶性 定点饱和突变 糖基化反应

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3-甾酮-Δ^(1)-脱氢酶突变体文库高通量筛选方法的建立

3

作者 董新林 胡青 +3 位作者 何建新 吕德强 宋士奎 苏正定 《生物技术》 CAS 2024年第2期158-164,共7页

[目的]建立一种快速、高通量筛选3-甾酮-Δ^(1)-脱氢酶(KstD)突变体库的方法。[方法]基于已发表KstD蛋白晶体结构,设计饱和突变引物,构建突变体文库,优化蛋白表达条件,利用冻融法结合溶菌酶法获得粗酶液;基于分光光度法原理,优化检测反... [目的]建立一种快速、高通量筛选3-甾酮-Δ^(1)-脱氢酶(KstD)突变体库的方法。[方法]基于已发表KstD蛋白晶体结构,设计饱和突变引物,构建突变体文库,优化蛋白表达条件,利用冻融法结合溶菌酶法获得粗酶液;基于分光光度法原理,优化检测反应体系,利用酶标仪检测吸光度的变化来反映酶活力。[结果]利用饱和突变引物成功构建突变体文库,表达KstD最佳条件为:IPTG终浓度0.3 mmol/L,20℃诱导20 h;缓冲液中溶菌酶浓度为0.5 mg/mL时上清目的蛋白含量最高。优化后的酶活检测条件为:Tris-HCl缓冲液50 mmol/L、pH 8.0、0.4 mmol/L DCPIP、1.5 mmol/L PMS、0.7 mmol/L雄烯二酮(4AD)和适量的酶液组成,温度30℃、酶反应时间5 min,于600 nm波长下测定。[结论]成功建立了一种5 min检测96个3-甾酮-Δ^(1)-脱氢酶(KstD)突变体的高通量筛选方法,重复性变异系数在3%以下。 展开更多

关键词 3-甾酮-Δ^(1)-脱氢酶 定点饱和突变 高通量筛选 半理性设计 雄烯二酮 酶标仪 酶法脱氢 突变体文库

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定点饱和突变提高赭曲霉11α羟化酶的催化性能

4

作者 史京辉 陈文慧 +5 位作者 陆坤 郑婷婷 任志远 鲍国庆 王敏 骆健美 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期322-331,共10页

【目的】11α,17α-双羟基黄体酮是重要的甾体激素类药物中间体,应用价值大。赭曲霉(Aspergillus ochraceus)CICC 41473的11α羟化酶CYP68J5是转化17α-羟基黄体酮生成11α,17α-双羟基黄体酮的关键酶,但其催化性能有待于提升。【方法... 【目的】11α,17α-双羟基黄体酮是重要的甾体激素类药物中间体,应用价值大。赭曲霉(Aspergillus ochraceus)CICC 41473的11α羟化酶CYP68J5是转化17α-羟基黄体酮生成11α,17α-双羟基黄体酮的关键酶,但其催化性能有待于提升。【方法】在课题组前期确定的关键氨基酸位点D118、F216和M488基础上,通过定点饱和突变和底物转化实验进行优良突变体的筛选;使用AutoDock进行酶与底物的分子对接,并通过Discovery Studio和Gromacs分别研究分子间相互作用力和分子动力学模拟。【结果】突变体D118V、F216W、M488L和M488W具有催化性能,其中,优良突变体D118V的活性最高,其在底物浓度0.5 g/L时,生产强度为431.66 mg/(L·d),较野生型提高了2.12倍,这可能是因为当118位的天冬氨酸突变为缬氨酸后,该位点与底物之间产生了新的疏水相互作用,增强了酶的底物结合口袋的疏水性。分子动力学模拟结果表明酶的整体构象更稳定,酶与底物的结合更紧密。【结论】通过定点饱和突变获得了催化性能显著提升的优良突变体D118V,研究结果为甾体11α羟化酶的改造提供了应用案例和理论指导。 展开更多

关键词 11α 17α-双羟基黄体酮 11α羟化酶 定点饱和突变 分子对接 分子动力学模拟

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倍半萜合酶催化机制的研究进展 被引量：4

5

作者 张瑞 吴萼 +3 位作者 殷晓浦 谢恬 庞潇卿 谌容 《生命的化学》 CAS CSCD 2018年第1期135-143,共9页

萜类化合物是自然界中普遍存在的一大类天然产物,其结构多样。倍半萜化合物是萜类化合物的重要组成部分。倍半萜合酶是倍半萜化合物合成过程中的关键酶。本文综述了近年来多种倍半萜合酶的突变研究,阐明了倍半萜合酶的催化机理。

关键词 倍半萜化合物 倍半萜合酶 定点饱和突变

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基于同源建模与分子对接技术构建抗Bt Cry1类毒素单链抗体定点饱和突变库 被引量：4

6

作者 焦凌霞 徐茜茜 +4 位作者 刘媛 张霄 刘贝贝 梁颖 刘贤金 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2016年第3期12-17,共6页

转基因食品中苏云金芽胞杆菌(Bt)Cry毒素种类较多,对生态环境和食品安全等造成的潜在风险日益受到关注,制备针对多种Cry毒素的高效广谱抗体,进而建立广谱性快速检测方法,是对转Bt基因作物进行监管并确保生态环境和食品安全的基础。本研... 转基因食品中苏云金芽胞杆菌(Bt)Cry毒素种类较多,对生态环境和食品安全等造成的潜在风险日益受到关注,制备针对多种Cry毒素的高效广谱抗体,进而建立广谱性快速检测方法,是对转Bt基因作物进行监管并确保生态环境和食品安全的基础。本研究利用基因工程抗体易于定向修饰及Cry毒素具有相似结构的特点,以实验室前期获得的人源化抗苏云金芽胞杆菌(Bt)Cry1Ac毒素单链抗体为材料,通过同源建模模拟单链抗体及五种Cry1类毒素的三维结构并利用分子对接技术分析单链抗体与Cry1类毒素结合的关键氨基酸位点;在此基础上利用重叠延伸PCR技术对关键氨基酸位点及其邻近位点进行定向改造,以构建定点饱和突变库,为筛选检测多种Cry1类毒素的广谱特异性抗体提供实验材料。 展开更多

关键词 Cry1毒素 单链抗体 同源建模 分子对接 重叠延伸PCR 定点饱和突变

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Clostridium clariflavum GH10木聚糖酶的克隆表达、酶学性质及位点功能分析 被引量：4

7

作者 王华广 刘雨露 +1 位作者 胡方觊 唐蕾 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期16-23,共8页

首次将来源于Clostridium clariflavum的木聚糖酶基因Clocl-2441中的糖苷水解酶家族10(glycosyl hydrolase families,GH)结构域基因连接到pET28a(+)载体上,在E.coli BL21(DE3)成功异源表达。经镍柱和脱盐分离纯化达到电泳纯,并对其酶学... 首次将来源于Clostridium clariflavum的木聚糖酶基因Clocl-2441中的糖苷水解酶家族10(glycosyl hydrolase families,GH)结构域基因连接到pET28a(+)载体上,在E.coli BL21(DE3)成功异源表达。经镍柱和脱盐分离纯化达到电泳纯,并对其酶学性质进行解析。结果表明,重组木聚糖酶rXyn2441GH10最适温度和pH分别为70℃和7.0,属于中性嗜热木聚糖酶。rXyn2441GH10在65℃以下和pH 4.0~9.0范围比较稳定,金属离子中5 mmol/L的Mg^(2+)可以提高79.2%的酶活。以榉木木聚糖为底物重组酶的动力学参数,V_(max)为1 691.5μmol/(mg·min),K_m值为2.5 mg/mL,k_(cat)为1 236.4/s,k_(cat)/K_m为494.6 mL/(mg·s)。定点饱和突变表明209位点的组氨酸对酶活有重要的作用。 展开更多

关键词 CLOSTRIDIUM clariflavum Glycosyl HYDROLASE families 10木聚糖酶 大肠杆菌 定点饱和突变

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蔗糖磷酸化酶的半理性设计及生产α-熊果苷的条件优化 被引量：3

8

作者 沈洋 吕雪芹 +3 位作者 林璐 李江华 堵国成 刘龙 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2020年第13期1-9,共9页

α-熊果苷是一种高价值糖苷,在化妆品和制药行业具有广泛的应用前景。酶法是生产α-熊果苷的主要手段,但由于缺乏高催化效率的酶而限制了α-熊果苷的生产。为了提高来自Streptococcus mutans UA159的蔗糖磷酸化酶(SmSP)的生物转化效率,... α-熊果苷是一种高价值糖苷,在化妆品和制药行业具有广泛的应用前景。酶法是生产α-熊果苷的主要手段,但由于缺乏高催化效率的酶而限制了α-熊果苷的生产。为了提高来自Streptococcus mutans UA159的蔗糖磷酸化酶(SmSP)的生物转化效率,进而提高α-熊果苷的产量,筛选了4种在Bacillus subtilis WB600中表达SmSP的载体,其中重组质粒pP43NMK-P43-gtfA在全细胞转化20 h后获得了最高的α-熊果苷产量(40.2 g/L)。其次,对SmSP催化活性中心周围的loop A进行了定点饱和突变,以提高酶和受体之间的亲和力,得到了突变体SmSP^I336L,其α-熊果苷产量和底物对苯二酚(hydroquinone,HQ)摩尔转化率分别为71.7 g/L和72.4%,产量相比对照提高了78.4%。最后,对重组菌株B.subtilis WB600/pP43NMK-P43-SmSP^I336L全细胞转化合成α-熊果苷反应条件进行优化,α-熊果苷的产量达到了110.3 g/L,HQ摩尔转化率为88.7%,产量相比对照提高了2.74倍。高催化效率重组菌株的构建,以及对突变体动力学的分析,对生物转化合成α-熊果苷具有重要的研究意义和应用价值。 展开更多

关键词 蔗糖磷酸化酶 α-熊果苷 定点饱和突变 全细胞催化

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定点饱和突变改善米曲霉木聚糖酶的温度特性 被引量：3

9

作者 吴芹 臧嘉 +2 位作者 胡蝶 王瑞 邬敏辰 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期65-70,共6页

为改善米曲霉木聚糖酶AoXyn11A的温度特性,基于其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,随机替换最高B-factor值位点处的Gly21。以重组表达质粒pET-28a-Aoxyn11A为模板,采用全质粒两步PCR技术对AoXyn11A基因(Aoxyn11A)中编码Gly21的密码... 为改善米曲霉木聚糖酶AoXyn11A的温度特性,基于其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,随机替换最高B-factor值位点处的Gly21。以重组表达质粒pET-28a-Aoxyn11A为模板,采用全质粒两步PCR技术对AoXyn11A基因(Aoxyn11A)中编码Gly21的密码子实施饱和突变,将pET-28a-Aoxyn11A各突变体转化E.coli BL21(DE3),构建了突变转化子文库。以酶的热稳定性为指标,从文库中筛选出最优突变转化子(E.coli/Aoxyn11AG21I)。DNA测序结果显示,E.coli/Aoxyn11AG21I表达一种由Ile21替换了Gly21的突变酶AoXyn11AG21I。温度特性分析表明:突变酶的最适温度由突变前的55℃提高至65℃;AoXyn11AG21I在55℃及以下稳定,较AoXyn11A提高了7℃。另外,AoXyn11A突变前后的pH特性改变不大。 展开更多

关键词 定点饱和突变 木聚糖酶 温度特性 分子动力学模拟 B-factor值

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定点饱和突变提高Lactobacillus casei L-乳酸脱氢酶对苯丙酮酸的催化效率 被引量：2

10

作者 李雪晴 刘艳 +2 位作者 袁风娇 李剑芳 邬敏辰 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期1401-1407,共7页

【背景】光学纯L-苯乳酸是一种天然防腐剂,也是一种高附加值的手性分子,在食品、制药和材料等领域有广阔的应用前景。本实验室已发现来源于Lactobacillus casei CICIM B1192的NADH依赖型L-乳酸脱氢酶(L-LcLDH)可不对称还原苯丙酮酸制备L... 【背景】光学纯L-苯乳酸是一种天然防腐剂,也是一种高附加值的手性分子,在食品、制药和材料等领域有广阔的应用前景。本实验室已发现来源于Lactobacillus casei CICIM B1192的NADH依赖型L-乳酸脱氢酶(L-LcLDH)可不对称还原苯丙酮酸制备L-苯乳酸,但其活性较低。为提高L-LcLDH催化苯丙酮酸的催化效率,构建了一个单突变体L-LcLDH^(Q88R),其催化效率kcat/Km是L-LcLDH的4.9倍。【目的】为进一步提高L-LcLDH^(Q88R)催化苯丙酮酸的催化效率,采用饱和突变技术将位于L-LcLDH^(Q88R)底物结合口袋附近的氨基酸残基Ile^(229)随机替换为其他氨基酸,以获得活性更高的优良突变体。【方法】以重组表达质粒p ET-22b-LcldhQ88R为模板,采用全质粒PCR技术对L-LcLDH^(Q88R)基因(LcldhQ88R)中编码Ile^(229)的密码子实施饱和突变,构建突变转化子文库。以催化苯丙酮酸的活性为指标,从文库中筛选出优良的突变转化子。【结果】突变转化子(Escherichia coli/Lcldh^(Q88R/I229Q))表达出一种由Arg和Gln分别替换了Gln88和Ile^(229)的双突变体L-LcLDH^(Q88R/I229Q)。重组表达产物L-LcLDH^(Q88R/I229Q)的酶学性质分析表明:L-LcLDH^(Q88R/I229Q)的比活性是L-LcLDH的18.5倍,是L-LcLDH^(Q88R)的2.3倍;其催化效率分别为后两者的6.8倍和1.4倍。L-LcLDH突变前后的温度和pH特性改变不大。根据分子对接结果推测出,双突变Q88R/I229Q导致L-LcLDH的底物结合口袋的入口变大和构型的变化可能对其催化活性的提高发挥了重要作用。【结论】双突变Q88R/I229Q显著提高了L-LcLDH的活性和催化效率,使得L-LcLDH^(Q88R/I229Q)在不对称还原苯丙酮酸制备L-苯乳酸中成为有潜力的工具酶。 展开更多

关键词 LACTOBACILLUS CASEI L-乳酸脱氢酶 定点饱和突变 苯丙酮酸 催化效率

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定点饱和突变提高L-脯氨酸-4-羟化酶的酶活 被引量：2

11

作者 周海岩 李会帅 +1 位作者 王培 柳志强 《发酵科技通讯》 CAS 2018年第4期193-198,共6页

为了提高L-脯氨酸-4-羟化酶(P4H)合成反式-4-羟基-L-脯氨酸(4-Hyp)的能力,首先对实验室前期构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4h的P4H进行三维结构模拟和"热点"氨基酸分析,选择了7个位于"疏水口袋"附... 为了提高L-脯氨酸-4-羟化酶(P4H)合成反式-4-羟基-L-脯氨酸(4-Hyp)的能力,首先对实验室前期构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4h的P4H进行三维结构模拟和"热点"氨基酸分析,选择了7个位于"疏水口袋"附近的氨基酸残基(Y205,K207I241,F137,T142,V53和R45)进行定点饱和突变,得到P4H酶活力明显提高的突变型酶F137R和Y205K。采用F137R和Y205K催化转化0.35g/L L-脯氨酸产物4(Hyp质量浓度分别为55.09mg/L和52.29mg/L),比野生型酶分别提高了58%和50%。经过分子对接比较发现,突变型P4H的活性中心没有发生显著变化,酶活的提高可能是由于突变作用使蛋白构型发生了轻微改变,增加了该酶与底物或辅底物的亲和力引起的。该结果为进一步利用P4H生物合成4-Hyp提供了重要的理论基础。 展开更多

关键词 L-脯氨酸4-羟化酶 反式-4-羟基-L-脯氨酸 生物催化 定点饱和突变

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Lys490饱和突变提高海藻糖合酶转化率的研究 被引量：2

12

作者 吕鑫 王腾飞 +2 位作者 汪俊卿 刘洪玲 王瑞明 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期60-65,共6页

分析预测海藻糖合酶的空间结构,并进行分子对接和序列比对,选择Lys490位点进行定点饱和突变。利用全质粒PCR方法构建饱和突变体库,并利用高效液相色谱法筛选优势突变。经过筛选获得优势突变体K490L、K490I,对比分析表明,突变体K490L、K4... 分析预测海藻糖合酶的空间结构,并进行分子对接和序列比对,选择Lys490位点进行定点饱和突变。利用全质粒PCR方法构建饱和突变体库,并利用高效液相色谱法筛选优势突变。经过筛选获得优势突变体K490L、K490I,对比分析表明,突变体K490L、K490I的转化率较原始酶分别提高了18%和15%。突变体酶学性质分析表明,K490L、K490I的最适反应温度及最适pH与原始酶保持一致,皆为25℃和pH 8.0,但两种突变酶的耐热性及耐酸性较原始酶有明显增强。在pH 7.0环境下,突变体K490L、K490I放置60 min后,剩余酶活力均达80%以上,而原始酶低于68%。 展开更多

关键词 海藻糖合酶 定点饱和突变 转化率 分子改造

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L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶立体选择性的半理性改造合成D-阿洛酮糖 被引量：2

13

作者 汪马燕 李子杰 高晓冬 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期1-7,共7页

稀有糖D-阿洛酮糖在食品、医药、保健等领域显示了巨大的应用潜能,然而以较高的收率大量生产D-阿洛酮糖依然面临着挑战。前期研究表明,属于磷酸二羟基丙酮(dihydroxyacetone phosphate,DHAP)依赖型醛缩酶家族的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩... 稀有糖D-阿洛酮糖在食品、医药、保健等领域显示了巨大的应用潜能,然而以较高的收率大量生产D-阿洛酮糖依然面临着挑战。前期研究表明,属于磷酸二羟基丙酮(dihydroxyacetone phosphate,DHAP)依赖型醛缩酶家族的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(Rha D)在以D-甘油醛为醛受体时,失去了对该醛受体的立体选择性,生成D-阿洛酮糖和D-山梨糖两种稀有糖,两者比例接近1∶1。为了对Rha D醛缩酶的立体选择性进行优化使其专一性地生产D-阿洛酮糖,对Rha D醛缩酶的152位酪氨酸进行了19种其他氨基酸的定点饱和突变,发现Rha DY152A突变体倾向于生成D-阿洛酮糖,D-阿洛酮糖和D-山梨糖的比例从最初的1∶1显著提高到8∶1,为下一步对Rha D醛缩酶分子改造进而定向合成单一产物D-阿洛酮糖提供理论依据。 展开更多

关键词 稀有糖 D-阿洛酮糖 醛缩酶 定点饱和突变

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红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的克隆、序列分析及热稳定性提高 被引量：2

14

作者 王辂 叶丽娟 曹毅 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1447-1456,共10页

【目的】克隆红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶基因全序列,对序列进行生物信息学分析,并提高酶的热稳定性。【方法】利用多聚酶链式反应(PCR)克隆α-氨基酸酯水解酶基因全序列;应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分... 【目的】克隆红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶基因全序列,对序列进行生物信息学分析,并提高酶的热稳定性。【方法】利用多聚酶链式反应(PCR)克隆α-氨基酸酯水解酶基因全序列;应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过同源建模,预测红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的三维结构;通过定点突变替换氨基酸序列中高度柔性的位点,提高该酶的热稳定性。【结果】从红纹黄单胞菌(Xanthomonas rubrillineans)中扩增得到α-氨基酸酯水解酶基因aeh(GenBank登录号JF744990),核苷酸序列长度1 917 bp,编码638个氨基酸。序列比对和同源性分析显示,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str.GPE PC73的肽酶及地毯草黄单胞菌Xanthomonas axono-podis pv. citri str. 306的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶氨基酸序列相似性最高,分别为91%和83%,系统进化分析表明,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str. GPEPC73的肽酶亲缘性最高。基于预测的三维模型,对高度柔性的位点进行饱和突变,从282株突变体中筛选得到3株T50较野生型高5°C以上的突变体。【结论】对红纹黄单胞菌AEH的氨基酸序列分析有助于探索同源蛋白的进化过程。对高度柔性位点进行饱和突变的策略可以用于提高热稳定性。 展开更多

关键词 α-氨基酸酯水解酶 红纹黄单胞菌 序列分析 热稳定性 定点饱和突变

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Arg54保守位点对嗜热玫瑰红球菌肌氨酸氧化酶的底物适应性和催化效率的影响

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作者 唐萌蔚 黄爱敏 +2 位作者 顾正华 辛瑜 张梁 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期1-9,共9页

嗜热玫瑰红球菌肌氨酸氧化酶(thermophilus sarcosine oxidase,TrSOX)是一种N-甲基脱除酶,对底物具有特异的手性选择性并且对高温和有机溶剂具有良好的耐受性。在同源家族中,Arg54是催化中心严格保守的5个残基之一,为了研究该位点对酶... 嗜热玫瑰红球菌肌氨酸氧化酶(thermophilus sarcosine oxidase,TrSOX)是一种N-甲基脱除酶,对底物具有特异的手性选择性并且对高温和有机溶剂具有良好的耐受性。在同源家族中,Arg54是催化中心严格保守的5个残基之一,为了研究该位点对酶学性质的影响并筛选出具有良好催化效率的突变体,在预先构建的木糖诱导质粒pMA5-Pxyl-trsox中进行Arg54位点的定点饱和突变,并将得到的质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600中进行表达。在19个突变体中,共有15个突变体可以表达并进行制备,其中几乎所有突变体的粗酶液蛋白含量相较野生型TrSOX都有所降低,只有R54D提高约2.5倍。所有突变体都保持了优异的热稳定性,除R54Q、R54N、R54K、R54D和R54V外,其他大多数突变体的二级结构组成均受到一定影响。突变体对底物的手性特异性与野生型TrSOX相同,能特异性识别N-甲基-L-氨基酸类底物,并能将甲基脱除。R54D和R54K对N-甲基-L-氨基酸类底物的催化效率显著提高,而其他突变体的催化效率降低甚至完全失活。此外,包括R54P、R54K和R54I在内的一些突变体能够识别新的非氨基酸相关底物,如1,2,3,4-四氢异喹啉、1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉、己内酰胺、2-甲基哌啶、哌啶和(3S)-(+)-3-(甲氨基)吡咯烷等,拓展了TrSOX的底物适应性。 展开更多

关键词 嗜热玫瑰红球菌肌氨酸氧化酶 定点饱和突变 N-甲基脱除 酶学性质 保守位点

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L-氨基酸脱氨酶的分子改造及其用于全细胞催化法生产α-酮戊二酸条件的优化 被引量：1

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作者 王越 李江华 +1 位作者 堵国成 刘龙 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期56-64,共9页

酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)是谷氨酸脱氨基的酮酸产物,作为一种重要的有机酸广泛用于食品、医药、精细化工等领域。为提高L-氨基酸脱氨酶全细胞催化法合成α-KG的效率及产量,首先通过优化全细胞催化剂制备条件及全细胞转化... 酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)是谷氨酸脱氨基的酮酸产物,作为一种重要的有机酸广泛用于食品、医药、精细化工等领域。为提高L-氨基酸脱氨酶全细胞催化法合成α-KG的效率及产量,首先通过优化全细胞催化剂制备条件及全细胞转化反应条件,包括发酵过程中的温度、诱导剂浓度、诱导剂添加时刻、诱导时间等;全细胞转化过程中的温度、pH、细胞量、转化时间。各个条件优化后以200g/L谷氨酸钠为底物时,产量最终提高了54. 9%,摩尔转化率为39. 6%。其次,通过定点饱和突变对L-氨基酸脱氨酶进行定向进化以提高其催化能力。经过多次突变、筛选,最优突变体E. coli BL21-pET-20b(+)-pm1152催化200g/L谷氨酸钠生成α-KG最高产量为100. 9g/L,摩尔转化率为64. 7%,较最初对照菌株提高了66. 3%。结果表明,条件优化和饱和突变可有效提高重组大肠杆菌全细胞转化合成α-KG的能力。 展开更多

关键词 L-氨基酸脱氨酶 条件优化 定点饱和突变 全细胞催化

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定向进化CYP105D1酶提高l-THP转化活性研究

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作者 欧晨辉 沈辰 +2 位作者 赵万里 郭蕊琳 刘吉华 《药物生物技术》 CAS 2019年第4期296-300,共5页

细胞色素CYP105D1是Streptomyces griseus ATCC 13273中生物转化左旋四氢巴马汀合成左旋紫堇达明的关键酶,课题组前期成功在原核体系中克隆了CYP105D1,实现了利用工程菌株生物转化合成制备左旋紫堇达明。但是,CYP105D1存在着转化活性低... 细胞色素CYP105D1是Streptomyces griseus ATCC 13273中生物转化左旋四氢巴马汀合成左旋紫堇达明的关键酶,课题组前期成功在原核体系中克隆了CYP105D1,实现了利用工程菌株生物转化合成制备左旋紫堇达明。但是,CYP105D1存在着转化活性低、酶稳定性差等缺陷,因此希望通过定向进化手段改造CYP105D1,提高左旋紫堇达明的产量。研究首先通过同源模建与分子对接的方法,预测了CYP105D1与底物相互作用的关键位点,然后选取了其中8个位点进行定点饱和突变。突变文库筛选结果与全细胞转化结果显示,突变体R98AR99A的转化率提升至原先的1. 48倍。研究通过对CYP105D1酶进行定向进化,成功提高了左旋紫堇达明的生物转化合成效率,并进一步揭示了CYP105D1与底物左旋四氢巴马汀的相互作用机制。 展开更多

关键词 CYP105D1 左旋四氢巴马汀 左旋紫堇达明 同源模建 分子对接 定向进化 定点饱和突变

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重组β-葡萄糖醛酸苷酶键选择性的半理性改造

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作者 普鸿丽 吕波 +1 位作者 赵东旭 李春 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第7期1119-1128,共10页

为了提高Escherichia coli重组表达的β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)的键选择性,本研究以PGUS-E结构与功能关系的推测为指导,选择了可能影响PGUS-E的键选择性的R329、T369、N467位点进行定点饱和突变,利用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC... 为了提高Escherichia coli重组表达的β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)的键选择性,本研究以PGUS-E结构与功能关系的推测为指导,选择了可能影响PGUS-E的键选择性的R329、T369、N467位点进行定点饱和突变,利用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)对键选择进行筛选,得到优势突变酶R329K、T369V。结果显示:与PGUS-E酶相比,突变酶R329K、T369V键选择性分别提高26.9%、34.3%。突变酶的酶学性质研究表明,突变酶的最适p H和温度与PGUS-E一致,但其酶催化效率下降。由此可见,R329、T369对酶催化的键选择性和酶的活性有显著影响。综上结果,本文应用饱和突变方法改善了PGUS-E的键选择性,为酶的结构和功能关系理解提供了实验依据。 展开更多

关键词 Β-葡萄糖醛酸苷酶 单葡萄糖醛酸基甘草次酸 键专一性 定点饱和突变

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绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅢ基因在大肠杆菌中的表达、定点突变及其动力学特性的研究

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作者 黄艳燕 左文朴 +4 位作者 秦国梅 韦宇拓 杜丽琴 庞宗文 黄日波 《工业微生物》 CAS CSCD 2009年第5期18-24,共7页

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅢ基因亚克隆到表达载体pET-22b(+),构建重组质粒pET-egl3,转化到大肠杆菌BL21(DE3)。利用金属亲和层析对重组EGⅢ进行纯化,纯化后酶比活力达到6 U/mg蛋白,最适反应温度为60℃,最适pH为4.0。同时对EGⅢ催化区... 将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅢ基因亚克隆到表达载体pET-22b(+),构建重组质粒pET-egl3,转化到大肠杆菌BL21(DE3)。利用金属亲和层析对重组EGⅢ进行纯化,纯化后酶比活力达到6 U/mg蛋白,最适反应温度为60℃,最适pH为4.0。同时对EGⅢ催化区的氨基酸残基R130和E218进行定点饱和突变,各筛选到一株酶活有提高的突变子R130P和E218F,其比活力为野生型EGⅢ的2.8倍和3.45倍。突变酶E218F的Km提高了一倍,催化效率Kcat提高了5.4倍;而R130P的Km和Kcat没有明显变化。两个突变酶的最适酶解温度和pH分别都提高至65℃和4.4。 展开更多

关键词 绿色木霉 葡聚糖内切酶Ⅲ 大肠杆菌 定点饱和突变

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醇脱氢酶KpADH的127位点对催化活性和对映选择性的影响

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作者 朱诚 许国超 +2 位作者 戴威 周婕妤 倪晔 《化工进展》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第12期5504-5511,共8页

醇脱氢酶可用于合成手性化合物,在医药、材料等领域应用广泛。来源于多孢克鲁维酵母(Kluyveromyces polysporus)的醇脱氢酶KpADH同时具有还原(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮(CPMK)和氧化异丙醇、1,4-丁二醇的活性。通过分子对接和结构分析... 醇脱氢酶可用于合成手性化合物,在医药、材料等领域应用广泛。来源于多孢克鲁维酵母(Kluyveromyces polysporus)的醇脱氢酶KpADH同时具有还原(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮(CPMK)和氧化异丙醇、1,4-丁二醇的活性。通过分子对接和结构分析,发现Y127是紧靠底物的关键位点。本文通过对127位点定点饱和突变来提高催化活性和对映选择性,突变体Y127V和Y127I还原CPMK的比活力达到95.0U/mg和84.0U/mg,分别是野生型的6.5倍和5.8倍,突变体Y127L催化CPMK生成(R)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇[(R)-CPMA]的e.e.值由82%提高到99.2%。同时,127位点的突变提高了对醇类底物的氧化活性,突变体Y127I对异丙醇的比活力是野生型的1.46倍,而Y127C更青睐于对1,4-丁二醇的催化氧化,其比活力是野生型的3.00倍。分子间作用力分析表明,Y127L与底物CPMK间增加的氢键和π-π作用力稳定了底物构象,进一步提高了还原CPMK的对映选择性。本文为醇脱氢酶KpADH的分子改造和机制解析提供了指导,提高了该酶的工业应用潜力。 展开更多

关键词 醇脱氢酶 定点饱和突变 比活力 对映选择性 生物催化

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