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植物CRISPR/Cas9多基因编辑载体构建和突变分析的操作方法 被引量:36
1
作者 曾栋昌 马兴亮 +2 位作者 谢先荣 祝钦泷 刘耀光 《中国科学:生命科学》 CSCD 北大核心 2018年第7期783-794,共12页
CRISPR/Cas9基因组编辑技术是植物基因功能研究与作物改良的有效工具.为此,本实验室开发了高效的CRISPR/Cas9植物多基因编辑载体系统.本载体系统包括6个双元载体和12个含有不同U3/U6启动子的sg RNA中间载体,可满足对单子叶和双子叶植物... CRISPR/Cas9基因组编辑技术是植物基因功能研究与作物改良的有效工具.为此,本实验室开发了高效的CRISPR/Cas9植物多基因编辑载体系统.本载体系统包括6个双元载体和12个含有不同U3/U6启动子的sg RNA中间载体,可满足对单子叶和双子叶植物的遗传转化以及不同抗生素筛选的要求,具有简便、高效,可同时对多基因进行编辑的特点.此外,为了能更高效地应用基因组编辑技术,还开发了一站式在线分析工具包CRISPR-GE.为方便研究人员利用CRISPR/Cas9系统进行植物基因组编辑,本文提供了从靶点选择、CRISPR/Cas9多靶点双元载体构建,以及对靶点突变序列的测序分析等详细的操作方法,以及常见的问题解答. 展开更多
关键词 植物基因组编辑 CRISPR/Cas9 定点突变 CRISPR-GE
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Aphid-resistant Transgenic Tobacco Plants Expressing Modified gna Gene 被引量:13
2
作者 袁正强 赵存友 +1 位作者 周岩 田颖川 《Acta Botanica Sinica》 CSCD 2001年第6期592-597,共6页
A gene sequence coding for the precursor of Galanthus nivalis agglutinin (GNA) was modified by site-directed mutagenesis to change very low usage bias codons to higher usage bias ones for improvement of the gene expre... A gene sequence coding for the precursor of Galanthus nivalis agglutinin (GNA) was modified by site-directed mutagenesis to change very low usage bias codons to higher usage bias ones for improvement of the gene expression in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum L.) plants. Results from Western blot analysis of some of the transgenic tobacco plants showed that the expression level of GNA in plants transformed with the modified gene GNA34m reached 0.25% of total soluble proteins, while that of the GNA34 gene transgenic plants was 0.17%. Since the GNA expression level increased, the aphid resistance of GNA34m transgenic plants were also enhanced significantly as judged by a 71.0% aphid population inhibition in insect bioassay of GNA34m transformed plants and 63.7% for the plants transformed with the natural GNA34 gene. 展开更多
关键词 gna gene site-directed mutagenesis transgenic tobacco plants aphid-resistance
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定点突变技术的研究进展 被引量:19
3
作者 张浩 毛秉智 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2000年第z1期108-110,共3页
定点突变技术是蛋白质工程中采用的重要技术之一 ,可以有目的地改变 DNA序列中的碱基 ;它不仅可以用来阐明基因的调控机理 ,还可以用来研究蛋白质结构与功能之间的关系。本文综述了 3种常用的定点突变方法的原理及应用并对三者的优缺点... 定点突变技术是蛋白质工程中采用的重要技术之一 ,可以有目的地改变 DNA序列中的碱基 ;它不仅可以用来阐明基因的调控机理 ,还可以用来研究蛋白质结构与功能之间的关系。本文综述了 3种常用的定点突变方法的原理及应用并对三者的优缺点和适用范围进行了比较。 展开更多
关键词 定点突变 蛋白质工程
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基于PCR的体外诱变技术 被引量:25
4
作者 罗师平 冷希岗 《国外医学(生物医学工程分册)》 2005年第3期188-192,共5页
定点突变技术是蛋白质工程中应用的重要技术之一,可以有目的改变DNA序列中的碱基。它不仅可以阐明基因表达的调控机理,还可用研究蛋白质结构与功能间的关系,改造天然蛋白质,使之更符合应用需求。自从PCR技术发明以来,便被用于进行定点... 定点突变技术是蛋白质工程中应用的重要技术之一,可以有目的改变DNA序列中的碱基。它不仅可以阐明基因表达的调控机理,还可用研究蛋白质结构与功能间的关系,改造天然蛋白质,使之更符合应用需求。自从PCR技术发明以来,便被用于进行定点突变。综述了各种基于PCR技术的定点突变方法,并与其他定点突变方法进行对比。 展开更多
关键词 定点突变 聚合酶链式反应
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植酸酶基因中稀有密码子的改造提高其在毕赤酵母中的表达量 被引量:22
5
作者 陈惠 赵海霞 +3 位作者 王红宁 杨婉身 吴琦 倪燕 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期171-175,共5页
对来源于黑曲霉N2 5(AspergillusnigerChinaStrain)的植酸酶基因phyA进行PCR介导的定点突变 ,不改变其所编码氨基酸 ,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因保守序列中第 81位和第 85位的Arg密码子进行同义突变 .构建了含正确突变的克隆载体... 对来源于黑曲霉N2 5(AspergillusnigerChinaStrain)的植酸酶基因phyA进行PCR介导的定点突变 ,不改变其所编码氨基酸 ,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因保守序列中第 81位和第 85位的Arg密码子进行同义突变 .构建了含正确突变的克隆载体pUC18 phyAm 和酵母表达载体pPIC9k phyAm,电击转化毕赤酵母 ,经MM、MD平板筛选和产物的酶活性测定 ,筛选出突变与未突变高酶活酵母转化子各 2株 .这 4株转化子的Southern印迹结果表明 ,phyA基因以单交换方式单拷贝整合到酵母染色体DNA中 .表达产物的SDS PAGE分析表明 ,重组酵母中的植酸酶能有效分泌和表达 ,蛋白质分子大小为 70 15kD .转化子酶活测定结果表明 ,经密码子优化的突变重组酵母酶活力明显高于未进行优化的重组酵母转化子 .经密码子优化的突变重组酵母株PP NPm 8于麦芽汁培养基中诱导 36h后酶活力可达 4 76 0 0U/ml,其活力比未优化重组酵母株PP NP 2 (2 36 6 7U/ml)提高了约 1倍 ,且重组转化子遗传稳定性良好 . 展开更多
关键词 黑曲霉 植酸酶PHYA基因 定点突变 毕赤酵母 表达
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一种载体构建的新方法:重组融合PCR法 被引量:26
6
作者 邝翡婷 袁定阳 +1 位作者 李莉 李新奇 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期634-639,共6页
本研究介绍一种多目的片段一步重组克隆的载体构建的新方法。该方法要求在PCR引物设计时,在第一个目的片段上游引物的5'端和最后一个目的片段下游引物的5'端各设置16bp与线性化目标载体末端同源的序列,再在各目的片段之间的引... 本研究介绍一种多目的片段一步重组克隆的载体构建的新方法。该方法要求在PCR引物设计时,在第一个目的片段上游引物的5'端和最后一个目的片段下游引物的5'端各设置16bp与线性化目标载体末端同源的序列,再在各目的片段之间的引物上各设计25bp的重叠序列,以便进行融合PCR将多片段扩增成融合片段。此方法将融合片段与线性化骨架载体进行一步重组、转化和重组子鉴定。该方法只要求骨架载体上有一个特异性酶切位点,特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建;该方法还可以引入定点突变,可便捷构建分析启动子功能等需引入定点突变的载体;该构建方法还可以实现多基因的无缝融合构建多顺反子,在构建原核基因表达载体、叶绿体表达载体、线粒体表达载体方面有着明显优势。本研究以水稻胚乳特异性表达载体PGt1-mGFP-pSB130为例,介绍此载体构建方法。 展开更多
关键词 重组融合PCR 载体构建 定点突变 原核表达载体
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基于重叠延伸PCR法的定点突变技术 被引量:21
7
作者 戴灿 苗聪秀 卢光琇 《现代生物医学进展》 CAS 2010年第3期411-412,共2页
目的:建立一种高效而经济的定点突变方法。方法:采用重叠延伸PCR定点突变技术,引物设计时引入目的突变,以前两次PCR产物为模板,进行第三次PCR,即可获得突变后的目的DNA片段。将此片段连入pMDTM18-T载体后测序验证突变结果。结果:DNA测... 目的:建立一种高效而经济的定点突变方法。方法:采用重叠延伸PCR定点突变技术,引物设计时引入目的突变,以前两次PCR产物为模板,进行第三次PCR,即可获得突变后的目的DNA片段。将此片段连入pMDTM18-T载体后测序验证突变结果。结果:DNA测序表明,待突变位点已由ATTGG突变为ATTTT。结论:成功实现了目的位点的定点突变,重叠延伸PCR法是一种高效且经济的定点突变方法。 展开更多
关键词 重叠延伸PCR 定点突变
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运用定点突变提高重组木聚糖酶在毕赤氏酵母中的表达 被引量:9
8
作者 陆健 曹钰 陈坚 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期425-430,共6页
运用PCR介导的定点突变对米曲霉 (Aspergillusoryzae)来源的木聚糖酶在毕赤酵母中的重组表达进行了研究 ,获得一表达量远远高于亲本的突变株I1 5 6A ,对其进行了提纯并研究其酶学特性 ,除热稳定性外其余与亲本基本一致。突变株I1 5 6A... 运用PCR介导的定点突变对米曲霉 (Aspergillusoryzae)来源的木聚糖酶在毕赤酵母中的重组表达进行了研究 ,获得一表达量远远高于亲本的突变株I1 5 6A ,对其进行了提纯并研究其酶学特性 ,除热稳定性外其余与亲本基本一致。突变株I1 5 6A所产木聚糖酶XynFl的分子量为 3 5kD ,在pH 4~ 9范围内稳定 ,最适pH为 7 0 ,最适温度为 45℃ ,在 5 0℃以下稳定性略高于亲本。 展开更多
关键词 定点突变 重组木聚糖酶 毕赤氏酵母 表达 米曲霉
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4株鸡马立克氏病病毒国内分离株Meq基因的克隆与序列分析 被引量:18
9
作者 施维松 刘长军 +4 位作者 张艳萍 秦运安 张晓巍 李晶梅 陈洪岩 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期117-125,共9页
根据鸡马立克氏病病毒(MDV)GA株Meq基因序列,设计并合成一对用于扩增Meq基因的引物,利用这对引物通过PCR方法分别扩增4株东北地区分离的强毒株、国内标准强毒株J-1株、国内疫苗株814株的Meq基因片段,进行克隆测序,对4株MDV分离毒... 根据鸡马立克氏病病毒(MDV)GA株Meq基因序列,设计并合成一对用于扩增Meq基因的引物,利用这对引物通过PCR方法分别扩增4株东北地区分离的强毒株、国内标准强毒株J-1株、国内疫苗株814株的Meq基因片段,进行克隆测序,对4株MDV分离毒株Meq基因与国内传统毒株Meq基因及GenBank上收录的国内外9株毒株Meq基因序列进行比较分析。序列比较显示,不同的MDV株的Meq基因序列相对比较保守,它们相互间氨基酸序列的同源性在96.5%~99.7%之间。4株MDV分离毒株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变;3株分离毒株Meq基因上相同位置均存在两个定点突变,这两处点突变是国内近几年分离株所特有的,国外已发表的MDV毒株Meq序列中不存在这种变化。分离株Meq基因的这些突变和毒株毒力的关系具有一定的规律性,但是这些规律性还有待进一步研究。 展开更多
关键词 马立克氏病病毒 MEQ基因 序列比较 定点突变
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重组人内皮抑素的结构改造及抗肿瘤活性变化 被引量:17
10
作者 任明华 王淑静 +4 位作者 林雪松 徐建永 陶站华 赵炜明 刘兴汉 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期45-52,共8页
内皮抑素是一种内源性的血管生成和肿瘤生长抑制剂 .运用定点突变技术对人内皮抑素基因工程菌中的内皮抑素基因进行改造 ,将内皮抑素中的GRIRGAD改为RGDRGD序列 ,提高了内皮抑素的抗肿瘤活性 .裸鼠体内抑瘤试验发现 ,野生与诱变内皮抑... 内皮抑素是一种内源性的血管生成和肿瘤生长抑制剂 .运用定点突变技术对人内皮抑素基因工程菌中的内皮抑素基因进行改造 ,将内皮抑素中的GRIRGAD改为RGDRGD序列 ,提高了内皮抑素的抗肿瘤活性 .裸鼠体内抑瘤试验发现 ,野生与诱变内皮抑素的抑瘤率分别为 4 0 6 6 %和5 1 0 5 % ,诱变内皮抑素抑瘤率比野生内皮抑素提高了近 11个百分点 .病理切片HE染色诱变组肿瘤的血管生成比野生组明显减少 ,坏死灶增多 .免疫组化试验中 ,诱变组在微血管密度MVD(P <0 0 5 )、血管内皮生长因子VEGF(P <0 0 5 )、增殖细胞核抗原PCNA(P >0 0 5 )三个指标上均比野生组减小 .体外细胞实验中 ,MTT结果表明 ,野生组内皮抑素半数抑制浓度IC50 =185 μg ml,诱变组内皮抑素IC50 =2 7μg ml,诱变组抑瘤活性是野生组的 6倍 .细胞迁移抑制实验表明 ,野生组与诱变组内皮抑素均对肿瘤细胞迁移有抑制作用 ,野生组迁移抑制率为 6 8 95 % ;诱变组迁移抑制率为89 94 % .上述结果说明 ,内皮抑素除抑制血管生成外 ,对肿瘤细胞的生长和迁移也有一定的抑制作用 .诱变内皮抑素通过RGDRGD序列与整合素结合而提高了抗肿瘤活性 . 展开更多
关键词 内皮抑素 定点突变 RGD序列 抗肿瘤活性
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聚合酶链式反应介导的定点突变方法探索 被引量:9
11
作者 周丽萍 《江苏大学学报(医学版)》 CAS 2003年第4期364-365,共2页
关键词 聚合酶链式反应 介导 定点突变 重叠延伸法
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纤维素酶的蛋白质工程 被引量:11
12
作者 张晓勇 陈秀霞 高向阳 《纤维素科学与技术》 CAS CSCD 2006年第2期55-58,64,共5页
概述了纤维素酶的6个家族的蛋白质工程研究进展,主要包括用基因定点突变技术对典型纤维素酶家族的三维构象、催化残基的确认。
关键词 纤维素酶 蛋白质工程 定点突变 三维构象
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蛋白质工程技术与新型生物催化剂设计 被引量:8
13
作者 吴梧桐 《药物生物技术》 CAS CSCD 2004年第1期1-6,共6页
生物催化剂的分子设计研究是发展新型生物催化剂的重要手段。蛋白质工程技术的应用为其发展提供了有效的技术平台。定点突变技术、DNA改组与体外定向进化技术等已在创造新型生物催化剂、改造天然生物催化剂的结构与功能方面呈现出良好... 生物催化剂的分子设计研究是发展新型生物催化剂的重要手段。蛋白质工程技术的应用为其发展提供了有效的技术平台。定点突变技术、DNA改组与体外定向进化技术等已在创造新型生物催化剂、改造天然生物催化剂的结构与功能方面呈现出良好发展前景。本文对有关技术的原理与应用及其已取得的主要研究成果做了简要介绍与讨论。 展开更多
关键词 生物催化剂 蛋白质工程 定点突变 DNA改组 定向进化
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猪瘟病毒E2基因的定点突变、在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的免疫原性 被引量:14
14
作者 余兴龙 涂长春 +3 位作者 徐兴然 张茂林 陈义祥 刘伯华 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期439-443,共5页
用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变 ,然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET 2 8a(+ )中 ,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL2 1(DE3 )plysS中 ,在IPTG的诱导下 ,重组转化菌可高效表达目的基因 ,表达量平... 用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变 ,然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET 2 8a(+ )中 ,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL2 1(DE3 )plysS中 ,在IPTG的诱导下 ,重组转化菌可高效表达目的基因 ,表达量平均可达菌体蛋白总量的 2 8%。免疫印迹和间接ELISA表明所表达的蛋白是CSFV特异性的。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2基因 定点突变 大肠杆菌 表达产物 免疫原性
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化学修饰改进酶的催化特性研究进展 被引量:11
15
作者 刘建忠 宋海燕 +1 位作者 翁丽萍 计亮年 《分子催化》 EI CAS CSCD 北大核心 2002年第6期475-480,共6页
关键词 催化特性 研究进展 化学修饰 蛋白质 交联 小分子化合物 单功能聚合物 定点突变
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蛋白激酶A/Cdc25B通路在小鼠卵母细胞G_2期阻滞中作用的研究 被引量:14
16
作者 张阳 张杰 +2 位作者 于爱鸣 宗志红 于秉治 《生殖与避孕》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期195-200,共6页
目的:研究小鼠卵母细胞G2期阻滞中,蛋白激酶A(PKA)的候选底物及靶位点。方法:将野生型和突变型(S321A)cdc25B克隆至pBluescriptSK载体中,体外转录成mRNA,显微注射到dbcAMP处理和未处理的卵母细胞中,观察减数分裂恢复情况。结果:在小鼠... 目的:研究小鼠卵母细胞G2期阻滞中,蛋白激酶A(PKA)的候选底物及靶位点。方法:将野生型和突变型(S321A)cdc25B克隆至pBluescriptSK载体中,体外转录成mRNA,显微注射到dbcAMP处理和未处理的卵母细胞中,观察减数分裂恢复情况。结果:在小鼠卵母细胞减数分裂过程中,Cdc25B能促进减数分裂的重新启动,其突变体(S321A)能完全解除PKA引起的G2期阻滞,完成减数分裂。结论:PKA通过Cdc25B的321位丝氨酸磷酸化修饰引起G2期阻滞,PKA/Cdc25B通路在小鼠卵母细胞减数分裂中发挥重要作用。 展开更多
关键词 卵母细胞 G2期阻滞 篮白激酶A CDC25B 定点突变
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木聚糖酶XYNB的N46D突变、表达及酶学性质变化 被引量:12
17
作者 杨浩萌 柏映国 +5 位作者 李江 罗会颖 王亚茹 伍宁丰 范云六 姚斌 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期204-211,共8页
对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和同源序列比较,发现第11族木聚糖酶的催化结构域在β折叠股A3和B3之间存的一个保守的氨基酸位点,该位点与木聚糖酶的pH特性有关.据此设计了XYNB的N46D定点突变.... 对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和同源序列比较,发现第11族木聚糖酶的催化结构域在β折叠股A3和B3之间存的一个保守的氨基酸位点,该位点与木聚糖酶的pH特性有关.据此设计了XYNB的N46D定点突变.将突变酶XYNBN46D在毕赤酵母中表达,表达的XYNBN46D经纯化后与原酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,XYNBN46D的最适pH值由5·2下降到4·2,pH稳定性也向酸性pH偏移,同时,热稳定性和最适温度也有一定的提高,但酶的比活性显著下降.结果证实,木聚糖酶XYNB的第46位Asn与其最适pH值相关.对导致酶学性质改变的可能因素进行了分析,结果为进一步的结构与功能研究提供了资料. 展开更多
关键词 木聚糖酶 XYNBN46D 定点突变 pH特性
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分子酶工程学研究进展 被引量:10
18
作者 周亚凤 张先恩 Anthony E.G.Cass 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期401-406,共6页
酶工程的研究已经发展到分子水平 ,通过基因操作 ,已实现了许多酶的克隆和表达。定点突变成为研究酶结构与功能的常规手段 ,并被广泛用于改善酶的性能。体外分子进化方法则大幅提高了酶分子的进化效率 ,并有可能发展新功能酶。融合蛋白... 酶工程的研究已经发展到分子水平 ,通过基因操作 ,已实现了许多酶的克隆和表达。定点突变成为研究酶结构与功能的常规手段 ,并被广泛用于改善酶的性能。体外分子进化方法则大幅提高了酶分子的进化效率 ,并有可能发展新功能酶。融合蛋白技术的发展使构建新型多功能融合酶成为可能。这里对分子酶工程学的研究与发展情况进行了综述。 展开更多
关键词 分子酶工程 基因工程 定点突变 体外分子定向进化 融合酶
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蛋白质和多肽药物长效性研究进展 被引量:11
19
作者 傅一鸣 王清明 安利国 《生命科学》 CSCD 2008年第2期258-262,共5页
基于分子生物学和重组技术的发展,蛋白质和多肽已经成为一类重要的药物,但是其稳定性差,生物利用率低,半衰期短等问题也日益受到关注。本文重点介绍了一些新的给药途径和给药系统,例如鼻腔、颊等给药途径以及黏膜给药系统、透皮给药系... 基于分子生物学和重组技术的发展,蛋白质和多肽已经成为一类重要的药物,但是其稳定性差,生物利用率低,半衰期短等问题也日益受到关注。本文重点介绍了一些新的给药途径和给药系统,例如鼻腔、颊等给药途径以及黏膜给药系统、透皮给药系统、缓控释技术等给药系统的进展。综述了对于蛋白质和多肽药物进行定点突变和化学修饰,以达到增加其长效性的一些新方法。 展开更多
关键词 蛋白质 多肽药物 长效性 给药系统 定点突变 化学修饰
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F43Y及I354M,L358F定点突变对植酸酶热稳定性及酶活性的改善 被引量:8
20
作者 陈惠 王红宁 +3 位作者 杨婉身 赵海霞 吴琦 单志 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期516-520,共5页
对重组酵母PPNPm8的植酸酶phyAm基因进行PCR介导的定点突变,即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y),将其354、358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(I354M,L358F),得到了2个突变体PPNPm-1(F43Y)及PPNPm-2(I354M,L... 对重组酵母PPNPm8的植酸酶phyAm基因进行PCR介导的定点突变,即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y),将其354、358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(I354M,L358F),得到了2个突变体PPNPm-1(F43Y)及PPNPm-2(I354M,L358F).含突变基因的重组表达载体pPIC9kphyAm-1,pPIC9kphyAm-2在毕赤酵母GS115中表达,对表达产物进行酶活性测定及热稳定性检测.结果表明:突变体PPNPm-1最适反应温度比未突变体PPNPm8上升了3℃,75℃处理10min,热稳定性提高15%,比活力提高11%;PPNPm-2最适反应温度未改变,热稳定性比PPNPm8仅提高3%,比活力降低6.5%.对突变前后的植酸酶空间结构进行比较预测,发现突变氨基酸Tyr43与空间位置相邻的Asn416之间形成氢键,增强了酶的热稳定性. 展开更多
关键词 植酸酶 PHYA基因 定点突变 毕赤酵母 热稳定性
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