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内含肽介导的天蚕素AD基因工程表达、其酰胺化及应用 被引量：3
1
作者 周冠 李蕾 +2 位作者 邓玮 李希平 俞超 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2016年第8期705-709,共5页
目的设计、合成天蚕素AD(CAD)基因序列,与内含肽(Intein)融合表达后通过重组蛋白自剪切作用获得C端酰胺化的CAD,并与抗生素配伍使用。方法根据大肠埃希菌密码子偏好性对CAD基因序列进行改造,人工合成目的基因,构建重组质粒pCold-SUMO-CA... 目的设计、合成天蚕素AD(CAD)基因序列,与内含肽(Intein)融合表达后通过重组蛋白自剪切作用获得C端酰胺化的CAD,并与抗生素配伍使用。方法根据大肠埃希菌密码子偏好性对CAD基因序列进行改造,人工合成目的基因,构建重组质粒pCold-SUMO-CAD-Intein,转化大肠埃希菌,诱导表达重组蛋白,经镍柱亲和层析纯化,后用DTT及肠激酶切割,利用分子筛纯化获得酰胺化CAD,并进行电泳及质谱鉴定。采用微量肉汤法检测重组CAD抑菌活性及其与不同抗生素按不同比例配伍使用的抑菌活性。结果 PCR扩增目的基因片段为132bp,与预期一致。质谱显示表达的CAD分子质量单位为3.949ku,与理论值相符。所得CAD抗菌肽对常见革兰阴性菌抗菌力强,配伍抗生素使用能发挥协同抑菌作用。结论成功构建CAD基因重组质粒pCold-SUMO-CAD-Intein,通过与内含肽(Intein)融合表达,经分子内的自剪切作用直接获得C末端酰胺化的抗菌肽,与抗生素配伍使用,能显著降低抗生素用量,具有作为抗生素替代物的应用潜力。 展开更多
关键词 天蚕素ad 表达 酰胺化 抗生素 配伍
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新城疫载体系统表达天蚕素AD抗菌肽及其抑菌效果 被引量：1
2
作者 任项霏 冯贺龙 +11 位作者 徐英英 李丽 杨宏春 王鑫 商雨 阳柳君 周祖涛 李自力 刘梅 罗青平 胡思顺 温国元 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期1820-1827,共8页
为探究天蚕素AD抗菌肽是否能在新城疫病毒(NDV)载体系统中表达,且通过该种表达系统得到的CAD是否有生物活性。采用同源重组的方式将CAD插入至NDV载体pTS09-C中,并利用反向遗传操作系统成功拯救出重组病毒rTS-CAD,该重组病毒能在SPF鸡胚... 为探究天蚕素AD抗菌肽是否能在新城疫病毒(NDV)载体系统中表达,且通过该种表达系统得到的CAD是否有生物活性。采用同源重组的方式将CAD插入至NDV载体pTS09-C中,并利用反向遗传操作系统成功拯救出重组病毒rTS-CAD,该重组病毒能在SPF鸡胚中稳定增殖。通过生物学特性分析,在NDV TS09-C株的P和M基因之间插入CAD基因并未改变其的弱毒和增殖特性。间接免疫荧光试验证实重组病毒能在BHK-21细胞中稳定表达CAD抗菌肽。抑菌试验结果显示,NDV载体系统表达的CAD对金黄色葡萄球菌(G+)和大肠杆菌(G-)均有一定的抑制作用:在微孔板法抑菌试验中,重组病毒表达的CAD抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑制率为79.6%~91.7%,对大肠杆菌的抑制率为87.5%~89.8%;在与DF-1细胞共培养试验中,重组病毒表达的CAD抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑制率可以达到74.5%~77.7%,对大肠杆菌的抑制率为35.0%~45.0%。本研究表明,NDV载体系统能够成功表达出有活性的CAD抗菌肽,且有良好的抑菌效果。这一研究为探索NDV载体表达抗菌肽和进一步研究CAD的局部效应奠定了一定的理论基础。 展开更多
关键词 天蚕素ad 新城疫病毒载体 反向遗传操作系统 抗菌肽
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天蚕素AD在毕赤酵母中的多拷贝整合表达及表达条件优化 被引量：1
3
作者 牛军波 薛林贵 +5 位作者 吴娟丽 陈熙明 李娟 王霞 刘阳 Emaneghemi Brown 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期1441-1451,共11页
【背景】天蚕素抗菌肽是目前研究最清楚、效果最显著的抗菌肽,实现工业化生产为其在农业、养殖业中的应用奠定了基础。【目的】获得一株高效生产天蚕素AD的基因工程菌株。【方法】构建重组载体pGAPZαA-CAD通过电击转化至Pichiapastoris... 【背景】天蚕素抗菌肽是目前研究最清楚、效果最显著的抗菌肽,实现工业化生产为其在农业、养殖业中的应用奠定了基础。【目的】获得一株高效生产天蚕素AD的基因工程菌株。【方法】构建重组载体pGAPZαA-CAD通过电击转化至PichiapastorisX33中,表达天蚕素AD基因并获得X33/GCAD菌株;构建重组载体pUCGAP-CAD导入至X33/GCAD菌株中。pGAPZαA-CAD是以博来霉素为抗性筛选标签被整合到P.pastoris X33的GAPDH启动子区域,pUCGAP-CAD是以遗传霉素为抗性筛选标签被整合到P.pastoris X33的非翻译rDNA区域,最终获得一株高效表达天蚕素AD的酵母菌株X33/GUCAD。【结果】通过质谱分析鉴定X33/GUCAD表达的抑菌物质为天蚕素AD,通过发酵条件的优化,表明X33/GUCAD菌株在以甘油为碳源和以蛋白胨、酵母提取物为有机氮源的情况下具有较强表达天蚕素AD的能力。【结论】较高的拷贝数更有利于提高天蚕素AD的产量,此工程菌株在后期发酵过程中稳定性较好,适于工业化生产。 展开更多
关键词 天蚕素ad 基因工程菌 生物效价
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重组大肠杆菌利用乳糖自诱导系统融合表达天蚕素AD和蛙BuforinⅡ 被引量：1
4
作者 陈泉 扈进冬 +3 位作者 李哲 郭凯 李纪顺 杨合同 《科学技术与工程》 北大核心 2014年第4期179-182,共4页
以包含质粒pET-Trx-CAD-BuforinⅡ的大肠杆菌BL21(DE3)为研究对象,开发了一种利用乳糖自诱导方式表达天蚕素AD和蛙BuforinⅡ的表达系统。首先,在LB培养基中研究了乳糖浓度、诱导时机和诱导时间对目的蛋白表达的影响。然后,利用"分... 以包含质粒pET-Trx-CAD-BuforinⅡ的大肠杆菌BL21(DE3)为研究对象,开发了一种利用乳糖自诱导方式表达天蚕素AD和蛙BuforinⅡ的表达系统。首先,在LB培养基中研究了乳糖浓度、诱导时机和诱导时间对目的蛋白表达的影响。然后,利用"分解代谢物阻遏"原理构建乳糖自诱导表达系统,以"葡萄糖+主碳源"两种碳源的依次代谢将蛋白表达过程分为两个阶段:第一阶段为菌体生长阶段,菌体利用葡萄糖生长,乳糖无法进入细胞诱导蛋白表达;第二阶段为蛋白表达阶段,葡萄糖耗尽,菌体开始利用主碳源生长;同时乳糖进入细胞诱导蛋白表达。最后,利用优选的"葡萄糖+木糖"组合自诱导表达天蚕素AD和BuforinⅡ的融合蛋白,得到的目的蛋白占全菌总蛋白含量的45.2%。 展开更多
关键词 大肠杆菌 乳糖 自诱导 天蚕素ad BuforinⅡ 融合表达
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转天蚕素AD(CAD)基因于紫花苜蓿的研究
5
作者 刘秀明 朱海林 +3 位作者 杜淑环 万秋 李海燕 李校堃 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期498-502,共5页
为了探索利用紫花苜蓿Medicago sativa作为生物反应器生产杂合抗菌肽天蚕素AD(Cecropin AD,CAD)的可行性,通过PCR搭桥方法合成了CAD全长基因,并插入对外源基因表达有一定促进作用的调控元件:Ω序列、Kozak序列及KDEL四肽序列,然后将改... 为了探索利用紫花苜蓿Medicago sativa作为生物反应器生产杂合抗菌肽天蚕素AD(Cecropin AD,CAD)的可行性,通过PCR搭桥方法合成了CAD全长基因,并插入对外源基因表达有一定促进作用的调控元件:Ω序列、Kozak序列及KDEL四肽序列,然后将改造后的CAD基因克隆进载体pCAMBIA1390R,构建了pCAMBIA1390R-CAD植物表达载体.将重组质粒转入根癌农杆菌Agrobacterium tumefacienLBA4404,并通过农杆菌介导方法将CAD基因转化入紫花苜蓿.在含潮霉素(20 mg/L)的筛选培养基上筛选转基因植株,通过PCR、Southern blotting检测,CAD基因已经转入紫花苜蓿中;提取蛋白质进行抑菌活性研究,结果表明转基因苜蓿蛋白提取物对沙门氏菌Sal-monella及金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus具有一定抑菌活性. 展开更多
关键词 紫花苜蓿 抗菌肽 天蚕素ad 转基因
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一种新型天蚕素杂合肽AD和aFGF突变体融合蛋白S的构建及表达 被引量：3
6
作者 苏志坚 吴晓萍 +4 位作者 郑青 黄亚东 庞实锋 冯雅 李校堃 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 2004年第4期420-425,共6页
目的 :构建和表达一种带有凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽AD和人酸性成纤维细胞生长因子 (acidicfibroblastgrowthfactor ,aFGF)突变体的融合蛋白S ,在创伤皮肤表面应用时能自动裂解成有抗感染功能的天蚕素杂合肽AD和皮肤修复功能的aFGF... 目的 :构建和表达一种带有凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽AD和人酸性成纤维细胞生长因子 (acidicfibroblastgrowthfactor ,aFGF)突变体的融合蛋白S ,在创伤皮肤表面应用时能自动裂解成有抗感染功能的天蚕素杂合肽AD和皮肤修复功能的aFGF突变体。方法 :利用PCR技术分别扩增出带有凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽AD基因和aFGF突变体基因。再利用两者作为模板 ,用PCR方法扩增出编码融合蛋白S的DNA。将该DNA片段插入到载体pPICZαA中 ,并利用电转法将质粒转入毕赤酵母smd116 8中 ,Zeocin抗性筛选重组转化子。甲醇诱导 72h ,SDS -PAGE电泳检测融合蛋白S的表达 ,并用Western -blot杂交检测融合蛋白S的免疫原性。结果 :筛选出的重组转化株在甲醇诱导后能表达相对分子质量约为 190 0 0的融合蛋白S ,而该蛋白能与aFGF抗体产生免疫反应。结论 :用PCR方法获得编码含凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽AD和aFGF突变体的融合蛋白SDNA 。 展开更多
关键词 天蚕素杂合肽ad aFGF突变体 融合蛋白S
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