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重组蛋白质在大肠杆菌体系中的可溶性表达策略
被引量：
8
1
作者
苗朝悦
杜乐
+6 位作者
王佳琦
陈梓杰
黄靖倍
陈且昕
邹沛璇
韩笑
张纯
《中国生物工程杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第9期33-45,共13页
大肠杆菌表达体系因其表达量高、周期短、成本低等诸多优势特征而被广泛用作重组异源蛋白质的表达宿主。据统计超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主。蛋白质错误折叠或未折叠以及包涵体形成是大肠...
大肠杆菌表达体系因其表达量高、周期短、成本低等诸多优势特征而被广泛用作重组异源蛋白质的表达宿主。据统计超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主。蛋白质错误折叠或未折叠以及包涵体形成是大肠杆菌表达体系更广泛应用的主要阻碍。因此,重组蛋白质在大肠杆菌体系中可溶性表达策略探索意义重大。综述了重组蛋白质在大肠杆菌表达系统中不可溶性表达的原因、机制以及影响大肠杆菌表达系统重组蛋白质可溶性的一些关键因素,并基于外源蛋白质在大肠杆菌中表达的各个步骤,总结了目前促进蛋白质在大肠杆菌表达系统中高效、可溶性表达的策略,为进一步拓展大肠杆菌表达体系在重组异源蛋白质可溶性表达中的应用提供参考。
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关键词
大肠杆菌
表达
体系
重组异源蛋白质
可溶性
表达
包涵体
糖基化
原文传递
基质金属蛋白酶-2/9敏感型可跨膜融合抗氧化酶的表达、纯化和表征
被引量：
1
2
作者
何火聪
林丽香
+3 位作者
李玲玲
吴伦巧
林海英
潘剑茹
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第9期3515-3527,共13页
融合了跨膜肽的抗氧化酶可进入细胞,保护细胞免受放射损伤。然而跨膜肽的跨膜能力没有靶向性,其也可把抗氧化酶带入肿瘤细胞进而保护肿瘤细胞,降低放疗的效果。为此,根据多数肿瘤细胞微环境中存在活性基质金属蛋白酶(matrix metalloprot...
融合了跨膜肽的抗氧化酶可进入细胞,保护细胞免受放射损伤。然而跨膜肽的跨膜能力没有靶向性,其也可把抗氧化酶带入肿瘤细胞进而保护肿瘤细胞,降低放疗的效果。为此,根据多数肿瘤细胞微环境中存在活性基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2或MMP-9的特点,在细胞跨膜肽R9与人铜、锌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 1,SOD1)和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)之间融合MMP-2/9的底物肽X,设计了融合蛋白GST-SOD1-X-R9。该蛋白在肿瘤微环境中可因MMP-2/9酶切底物肽X而失去跨膜肽,从而无法进入肿瘤细胞,进而只能进入正常细胞。全基因合成SOD1-X-R9序列,并将其插入原核表达载体pGEX-4T-1中,得到表达质粒,并实现了GST-SOD1-X-R9融合蛋白的可溶表达。GST-SOD1-X-R9经硫酸铵沉淀和GST亲和层析纯化,分子量约为47 kDa,与理论值一致。纯化的融合蛋白的SOD活性和GST活性分别为2954 U/mg和328 U/mg。GST-SOD1-X-R9的SOD活性或GST活性在生理条件下几乎没有变化。该融合蛋白在溶液中可被胶原酶Ⅳ部分水解。分别建立了2D和3D培养的HepG2细胞模型来检验肿瘤微环境中的MMP-2活力对该蛋白跨膜能力的影响。在2D培养模型中,HepG2的MMP-2活力极低,但在3D培养模型中,随着培养时间的增加,HepG2肿瘤球的体积变大,其胞外MMP-2活力也随之增强。GST-SOD1-X-R9在2D培养的HepG2细胞中具有和GST-SOD1-R9蛋白一样的跨膜效率,但在3D培养的HepG2细胞球中的跨膜能力大大降低。本研究为后续深入研究GST-SOD1-X-R9靶向防护正常细胞的氧化损伤效应奠定了基础。
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关键词
抗氧化酶
MMP-2/9敏感性
可跨膜
大肠杆菌
表达
体系
纯化
稳定性
原文传递
溶藻弧菌AphB蛋白的原核表达及其乙酰化验证
3
作者
万明月
范晨龙
丁燏
《福建农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第10期1250-1255,共6页
【目的】研究LysR家族转录因子AphB蛋白是否存在乙酰化修饰,为进一步研究乙酰化修饰对该蛋白功能的影响提供理论基础。【方法】以溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901 LysR家族转录因子AphB为对象,根据GenBank上溶藻弧菌aphB序列(No.W...
【目的】研究LysR家族转录因子AphB蛋白是否存在乙酰化修饰,为进一步研究乙酰化修饰对该蛋白功能的影响提供理论基础。【方法】以溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901 LysR家族转录因子AphB为对象,根据GenBank上溶藻弧菌aphB序列(No.WP_005380599.1)设计引物,采用大肠杆菌表达体系异源诱导表达,设置时间、温度和IPTG浓度梯度优化表达条件,最后纯化AphB蛋白,通过抗乙酰赖氨酸特异性抗体验证AphB蛋白的乙酰化修饰程度。【结果】aphB全长约876 bp,37℃时菌液加入0.1 mmol·L^(-1)的IPTG诱导6 h后,AphB蛋白的表达量最高,纯化后的蛋白大小为37.3 kD,AphB自身存在乙酰化修饰位点,但其乙酰化程度在体外不受脱乙酰酶CobB的调控。【结论】初步证明了AphB蛋白是一种乙酰化蛋白且在体外不能被脱乙酰酶CobB脱乙酰化,研究结论丰富了原核生物弧菌中乙酰化修饰的相关理论,为溶藻弧菌毒力基因aphB的翻译后调控机制研究提供了科学参考。
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关键词
溶藻弧菌
AphB
大肠杆菌
表达
体系
赖氨酸乙酰化修饰
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职称材料
题名
重组蛋白质在大肠杆菌体系中的可溶性表达策略
被引量：
8
1
作者
苗朝悦
杜乐
王佳琦
陈梓杰
黄靖倍
陈且昕
邹沛璇
韩笑
张纯
机构
四川大学华西药学院
出处
《中国生物工程杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第9期33-45,共13页
基金
国家自然科学基金(82003685)
四川省科学技术厅项目(2021YJ0187)。
文摘
大肠杆菌表达体系因其表达量高、周期短、成本低等诸多优势特征而被广泛用作重组异源蛋白质的表达宿主。据统计超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主。蛋白质错误折叠或未折叠以及包涵体形成是大肠杆菌表达体系更广泛应用的主要阻碍。因此,重组蛋白质在大肠杆菌体系中可溶性表达策略探索意义重大。综述了重组蛋白质在大肠杆菌表达系统中不可溶性表达的原因、机制以及影响大肠杆菌表达系统重组蛋白质可溶性的一些关键因素,并基于外源蛋白质在大肠杆菌中表达的各个步骤,总结了目前促进蛋白质在大肠杆菌表达系统中高效、可溶性表达的策略,为进一步拓展大肠杆菌表达体系在重组异源蛋白质可溶性表达中的应用提供参考。
关键词
大肠杆菌
表达
体系
重组异源蛋白质
可溶性
表达
包涵体
糖基化
Keywords
Escherichia coli expression system
Recombinant heterologous protein
Soluble expression
Inclusion bodies
Glycosylation
分类号
Q814 [生物学—生物工程]
原文传递
题名
基质金属蛋白酶-2/9敏感型可跨膜融合抗氧化酶的表达、纯化和表征
被引量：
1
2
作者
何火聪
林丽香
李玲玲
吴伦巧
林海英
潘剑茹
机构
福州大学生物科学与工程学院
福建医科大学附属肿瘤医院/福建省肿瘤医院放射生物学及肿瘤放射治疗学研究室
福州大学化学学院
雅博捷锐(厦门)医疗科技有限公司
福州捷赫生物科技有限公司
深圳合民生物科技有限公司
出处
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第9期3515-3527,共13页
基金
国家自然科学基金(81974482)
福建省自然科学基金(2019J01191,2018J01732)
福建省卫生健康科研人才培养项目(2019-CXB-8)。
文摘
融合了跨膜肽的抗氧化酶可进入细胞,保护细胞免受放射损伤。然而跨膜肽的跨膜能力没有靶向性,其也可把抗氧化酶带入肿瘤细胞进而保护肿瘤细胞,降低放疗的效果。为此,根据多数肿瘤细胞微环境中存在活性基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2或MMP-9的特点,在细胞跨膜肽R9与人铜、锌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 1,SOD1)和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)之间融合MMP-2/9的底物肽X,设计了融合蛋白GST-SOD1-X-R9。该蛋白在肿瘤微环境中可因MMP-2/9酶切底物肽X而失去跨膜肽,从而无法进入肿瘤细胞,进而只能进入正常细胞。全基因合成SOD1-X-R9序列,并将其插入原核表达载体pGEX-4T-1中,得到表达质粒,并实现了GST-SOD1-X-R9融合蛋白的可溶表达。GST-SOD1-X-R9经硫酸铵沉淀和GST亲和层析纯化,分子量约为47 kDa,与理论值一致。纯化的融合蛋白的SOD活性和GST活性分别为2954 U/mg和328 U/mg。GST-SOD1-X-R9的SOD活性或GST活性在生理条件下几乎没有变化。该融合蛋白在溶液中可被胶原酶Ⅳ部分水解。分别建立了2D和3D培养的HepG2细胞模型来检验肿瘤微环境中的MMP-2活力对该蛋白跨膜能力的影响。在2D培养模型中,HepG2的MMP-2活力极低,但在3D培养模型中,随着培养时间的增加,HepG2肿瘤球的体积变大,其胞外MMP-2活力也随之增强。GST-SOD1-X-R9在2D培养的HepG2细胞中具有和GST-SOD1-R9蛋白一样的跨膜效率,但在3D培养的HepG2细胞球中的跨膜能力大大降低。本研究为后续深入研究GST-SOD1-X-R9靶向防护正常细胞的氧化损伤效应奠定了基础。
关键词
抗氧化酶
MMP-2/9敏感性
可跨膜
大肠杆菌
表达
体系
纯化
稳定性
Keywords
antioxidant enzyme
MMP-2/9 sensitive
cell permeable
expression in Escherichia coli
purification
stability
分类号
R730.5 [医药卫生—肿瘤]
原文传递
题名
溶藻弧菌AphB蛋白的原核表达及其乙酰化验证
3
作者
万明月
范晨龙
丁燏
机构
广东海洋大学水产学院/广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室/广东省水产经济动物病害防控重点实验室
出处
《福建农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第10期1250-1255,共6页
基金
广东省自然科学基金项目(2014A030313604)
广东海洋大学研究生教育创新计划资助项目(201724)
文摘
【目的】研究LysR家族转录因子AphB蛋白是否存在乙酰化修饰,为进一步研究乙酰化修饰对该蛋白功能的影响提供理论基础。【方法】以溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901 LysR家族转录因子AphB为对象,根据GenBank上溶藻弧菌aphB序列(No.WP_005380599.1)设计引物,采用大肠杆菌表达体系异源诱导表达,设置时间、温度和IPTG浓度梯度优化表达条件,最后纯化AphB蛋白,通过抗乙酰赖氨酸特异性抗体验证AphB蛋白的乙酰化修饰程度。【结果】aphB全长约876 bp,37℃时菌液加入0.1 mmol·L^(-1)的IPTG诱导6 h后,AphB蛋白的表达量最高,纯化后的蛋白大小为37.3 kD,AphB自身存在乙酰化修饰位点,但其乙酰化程度在体外不受脱乙酰酶CobB的调控。【结论】初步证明了AphB蛋白是一种乙酰化蛋白且在体外不能被脱乙酰酶CobB脱乙酰化,研究结论丰富了原核生物弧菌中乙酰化修饰的相关理论,为溶藻弧菌毒力基因aphB的翻译后调控机制研究提供了科学参考。
关键词
溶藻弧菌
AphB
大肠杆菌
表达
体系
赖氨酸乙酰化修饰
Keywords
Vibrio alginolyticus
AphB
Escherichia coli expression system
lysine acetylation modification
分类号
S941.42 [农业科学—水产养殖]
下载PDF
职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
重组蛋白质在大肠杆菌体系中的可溶性表达策略
苗朝悦
杜乐
王佳琦
陈梓杰
黄靖倍
陈且昕
邹沛璇
韩笑
张纯
《中国生物工程杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2023
8
原文传递
2
基质金属蛋白酶-2/9敏感型可跨膜融合抗氧化酶的表达、纯化和表征
何火聪
林丽香
李玲玲
吴伦巧
林海英
潘剑茹
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022
1
原文传递
3
溶藻弧菌AphB蛋白的原核表达及其乙酰化验证
万明月
范晨龙
丁燏
《福建农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022
0
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