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Loop6、Loop7和Loop8参与副猪嗜血杆菌OmpP2抗血清的杀菌作用研究 被引量：2
1
作者 何欣怡 周叶 +4 位作者 周群 曹慧 宋鑫 岳华 张斌 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期639-645,共7页
为研究副猪嗜血杆菌(HPS)外膜蛋白P2(OmpP2)不同表面环状结构(Loop)在HPS抗血清杀菌过程中发挥的作用。本研究以pBAD18-Km质粒和HPS SC096为模板,PCR扩增卡那霉素抗性基因(Km)片段和含ompP2 TTA终止密码子下臂基因片段。通过重叠延伸PC... 为研究副猪嗜血杆菌(HPS)外膜蛋白P2(OmpP2)不同表面环状结构(Loop)在HPS抗血清杀菌过程中发挥的作用。本研究以pBAD18-Km质粒和HPS SC096为模板,PCR扩增卡那霉素抗性基因(Km)片段和含ompP2 TTA终止密码子下臂基因片段。通过重叠延伸PCR扩增融合基因片段Km-ompP2克隆至自杀性质粒pK18mobsacB中,获得重组自杀性质粒pZY01。以HPS SC096为模板经PCR分别扩增ompP2 Loop1~Loop8上臂片段和ompP2 Loop1~Loop 8下游片段,并经重叠延伸PCR扩增各loop基因融合片段(分别缺失Loop1~Loop8基因序列的ompP2片段)并克隆至pZY01,构建各Loop基因缺失的自杀性质粒pZY02~pZY08,所有的自杀性质粒均经PCR鉴定。将正确构建的自杀性质粒pZY01~pZY08通过自然转化法转化至ompP2基因缺失的HPS SC096(SC096ΔompP2)中,构建了HPS ompP2ΔLoop缺失菌株,并均经PCR鉴定后在TSA中传10代,通过PCR方法检测其遗传稳定性。结果显示,正确构建了8个自杀性质粒pZY01~pZY08及缺失各Loop基因的HPS ompP2ΔLoop2、ompP2ΔLoop5、ompP2ΔLoop6、ompP2ΔLoop7和ompP2ΔLoop8,共5个HPS ompP2ΔLoop缺失菌株,且各缺失菌株的Loop基因均能够稳定缺失,表明其均具有较好的遗传稳定性。未获得HPS ompP2ΔLoop1、ompP2ΔLoop3和ompP2ΔLoop4缺失菌株。制备新鲜兔血清并分别测定不同HPS ompP2ΔLoop缺失菌株在50%和90%兔血清中的存活率,分析不同缺失菌株的抗兔血清中补体介导的杀菌作用。结果显示,与HPSΔompP2菌株相比,HPS ompP2ΔLoop2菌株在50%和90%兔血清中的存活率分别增加了4×10^(5)倍和1×10^(6)倍;HPS ompP2ΔLoop5菌株在50%和90%兔血清中的存活率分别增加了3×10^(5)倍和1×10^(6)倍;HPS ompP2ΔLoop6、ompP2ΔLoop7和ompP2ΔLoop8的存活率无显著变化。与野生型SC096株相比,在50%兔血清中,HPS ompP2ΔLoop2、ompP2ΔLoop5、ompP2ΔLoop6、ompP2ΔLoop7和ompP2ΔLoop8缺失菌株的存活率分别降低了53.7%、60.1%、99.8%、99.6%和99.9%;在90%兔血清中,上述HPS om 展开更多
关键词 副猪嗜血杆菌 外膜蛋白p2 表面环状结构 血清杀菌作用
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HPS OmpP2表面环状结构诱导猪肺泡巨噬细胞炎性因子mRNA转录的研究 被引量：1
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作者 周叶 贺超 +3 位作者 王丹 岳华 任玉鹏 张斌 《动物医学进展》 北大核心 2019年第9期52-57,共6页
副猪嗜血杆菌(HPS)对养猪业造成了严重的影响。外膜蛋白P2(OmpP2)是HPS外膜中最丰富的蛋白,能介导宿主的炎症反应。试验通过人工合成OmpP2的表面环状结构(Loop)氨基酸序列体外刺激猪肺泡巨噬细胞(PAMs),探究OmpP2中不同Loop在炎性反应... 副猪嗜血杆菌(HPS)对养猪业造成了严重的影响。外膜蛋白P2(OmpP2)是HPS外膜中最丰富的蛋白,能介导宿主的炎症反应。试验通过人工合成OmpP2的表面环状结构(Loop)氨基酸序列体外刺激猪肺泡巨噬细胞(PAMs),探究OmpP2中不同Loop在炎性反应中的作用。用HPS血清4型SC096菌株OmpP2作为参照,通过real-time PCR方法测量8个Loop刺激PAMs细胞6 h后IL-1ɑ、IL-1β、IL-6、IL-8、CCL-4、CCL-5细胞因子mRNA的转录水平。与对照细胞相比,8个Loop均能诱导PAMs中IL-1ɑ、IL-1β、IL-6、IL-8、CCL-4、CCL-5细胞因子mRNA转录出现不同程度的上调,其中Loop7和Loop8刺激细胞后细胞因子mRNA转录水平上调显著(P<0.05)。提示Loop7和Loop8是OmpP2发挥促炎功能的一个重要组成结构。 展开更多
关键词 副猪嗜血杆菌 外膜蛋白p2 表面环状结构 细胞因子 mRNA转录水平
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副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2的提取及鉴定
3
作者 罗银珠 徐成刚 +5 位作者 周素明 冯赛祥 贺现辉 樊惠英 廖明 辛朝安 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第9期225-230,共6页
为简化副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)外膜蛋白中的单一蛋白外膜蛋白P2(OmpP2)的分离步骤,降低膜蛋白分离的设备要求,本试验用Hps标准3型(SW114)、5型(Nagasaki)菌株作为试验材料,选用溶菌酶、核酸酶对Hps进行酶解以获得其完... 为简化副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)外膜蛋白中的单一蛋白外膜蛋白P2(OmpP2)的分离步骤,降低膜蛋白分离的设备要求,本试验用Hps标准3型(SW114)、5型(Nagasaki)菌株作为试验材料,选用溶菌酶、核酸酶对Hps进行酶解以获得其完整外膜,然后利用含有2%tritonX-100缓冲液对外膜进行进一步解离,最后利用适量浓度的胰酶对强疏水蛋白进行酶解,实现了Hps高纯度OmpP2的体外快速提取。SDS-PAGE结果显示,上述2株菌OmpP2大小分别约为43和38ku;基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)鉴定结果显示,从上述蛋白酶解下来的肽段经比对与Hps的OmpP2完全吻合。斑点杂交(Dot-blot)显示采自Hps患病猪血清在点有5型菌株(Nagasaki)OmpP2和点有3型菌株(SW114)OmpP2NC膜上均发生杂交显色反应,该结果暗示OmpP2是一个具有免疫活性的抗原。本研究为OmpP2功能及免疫保护性研究奠定了基础,也为副猪嗜血杆菌病免疫学诊断提供新的参考。 展开更多
关键词 副猪嗜血杆菌 外膜蛋白p2 提取 鉴定
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