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经典方法与LaSRT法测定绿色荧光蛋白标记重组病毒滴度的研究 被引量：15
1
作者 江千里 王健民 +2 位作者 江汕 温丽敏 周虹 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第10期1101-1103,共3页
目的以带有绿色荧光蛋白(GFP)标记基因的重组逆转录病毒为例,对经典方法与批量快速病毒滴度法(LaSRT)测定病毒滴度进行比较研究。方法(1)经典方法:于6孔培养板分别接种NIH3T3细胞2×105/孔,培养12 h 后分别以0.5 ml、50 μl和5 μl... 目的以带有绿色荧光蛋白(GFP)标记基因的重组逆转录病毒为例,对经典方法与批量快速病毒滴度法(LaSRT)测定病毒滴度进行比较研究。方法(1)经典方法:于6孔培养板分别接种NIH3T3细胞2×105/孔,培养12 h 后分别以0.5 ml、50 μl和5 μl带有GFP 标记基因的病毒感染,聚凝胺终浓度为8 μg/ml,48 h后以流式细胞仪检测细胞eGFP+率。病毒滴度(TU/ml)=(2×105×细胞eGFP+率)/病毒原液体积。(2)LaSRT法:NIH3T3 细胞以5 000/孔接种于96 孔板,12 h后更换成完全培养液90 μl/孔,以8孔为一组,第1 孔中加入病毒液10 μl,此后每孔依次10∶1 倍比稀释,聚凝胺终浓度为8 μg/ml,48 h后以浓度自高到低的方向,在荧光倒置显微镜下确定计量孔(第n孔),计数孔中的阳性细胞数m。病毒滴度(TU/ml)=m×10n+1。(3)对7批病毒以LaSRT法研究,探讨冻存/复苏过程对重组病毒滴度的影响。结果经典方法测定的重组病毒滴度为(1.54±0.38)×106 TU/ml,LaSRT法测定的病毒滴度为(1.33±0.57)×106 TU/ml,两者无统计学差异(P>0.05)。LaSRT法可以大批量、快速地测定以GFP为标记基因的重组病毒滴度。单次冻存/复苏后的病毒滴度为冻存前的(18.1±9.9)%(n=7)。结论LaSRT法和经典方法测定以GFP为标记基因的重组病毒滴度,结果无统计学差异; 展开更多
关键词 经典方法 LaSRT法 测定 绿色荧光蛋白 病毒滴度测定法 基因重组逆转录病毒
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含抗凋亡基因bcl-2重组逆转录病毒重组体的构建及鉴定 被引量：1
2
作者 李素芳 魏锐利 金玲 《国际眼科杂志》 CAS 2006年第4期781-782,共2页
目的:构建并鉴定含鼠bcl-2基因重组逆转录病毒。方法:将抗凋亡基因bcl-2片段从载体pcDNA3.1中切下,定向插入逆转录病毒载体PLNCX2中,酶切鉴定;脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定表达bcl-2的细胞株。结果:双... 目的:构建并鉴定含鼠bcl-2基因重组逆转录病毒。方法:将抗凋亡基因bcl-2片段从载体pcDNA3.1中切下,定向插入逆转录病毒载体PLNCX2中,酶切鉴定;脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定表达bcl-2的细胞株。结果:双酶切鉴定,成功构建重组逆转录病毒载体;重组逆转录病毒转入包装细胞PT67,经G418筛选,形成了抗性克隆,并测得病毒滴度为3×1011cfu/L,提示构建的含鼠bcl-2基因重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论:含抗凋亡基因bcl-2重组逆转录病毒载体构建成功。 展开更多
关键词 抗凋亡基因BCL-2 逆转录病毒重组体 酶切鉴定 基因重组逆转录病毒 重组逆转录病毒载体 PCDNA3.1 包装细胞系 bcl-2基因 脂质体法 稳定表达
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基因重组BDNF感染脊髓神经干细胞及其表达 被引量：3
3
作者 曹延林 罗卓荆 叶正旭 《中国矫形外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第17期1326-1328,共3页
[目的]探讨脊髓神经干细胞(NSC)被重组逆转录病毒感染后目的基因的表达。[方法]用人脑源性神经生长因子(hBDNF)基因重组逆转录病毒上清液感染脊髓NSCs,取感染后的NSCs培养液(BDNF条件培养液)培养背根神经结(DRG)和小鼠嗜铬瘤细胞(PC12细... [目的]探讨脊髓神经干细胞(NSC)被重组逆转录病毒感染后目的基因的表达。[方法]用人脑源性神经生长因子(hBDNF)基因重组逆转录病毒上清液感染脊髓NSCs,取感染后的NSCs培养液(BDNF条件培养液)培养背根神经结(DRG)和小鼠嗜铬瘤细胞(PC12细胞)检测培养液中BDNF活性;酶联免疫吸附反应(ELISA)检测培养液中BDNF浓度;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测BDNFmRNA。[结果]感染hBDNF基因重组逆转录病毒的NSCs上清中有BDNF的表达,经hBDNF条件培养液培养的PC12细胞,数量增多,突起明显变长。经hBDNF条件培养液培养背根神经结,神经元突起伸出,逐渐增多,长度大于神经节直径。[结论]脊髓NSC可直接作为基因靶细胞,被BDNF基因重组逆转录病毒有效感染而表达和分泌有生物学活性的BDNF。 展开更多
关键词 脊髓 神经干细胞 脑源性神经生长因子 基因转染 表达 基因重组逆转录病毒 脊髓神经干细胞 HBDNF 病毒感染后 神经干细胞(NSC)
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