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体外定点突变体或CRISPR/Cas9介导的敲入突变体快速筛选方法的建立
1
作者 宋春林 张雨晴 +2 位作者 翟玉静 张刚 王颖 《精准医学杂志》 2023年第3期254-258,263,共6页
目的 探讨建立一种体外定点突变体或CRISPR/cas9介导的敲入突变体的快速筛选方法,以提高突变体筛选效率,降低实验成本。方法 针对构建的体外定点突变体或CRISPR/Cas9介导的敲入突变体,采用3′端第1、2和3个核苷酸分别与突变序列相匹配... 目的 探讨建立一种体外定点突变体或CRISPR/cas9介导的敲入突变体的快速筛选方法,以提高突变体筛选效率,降低实验成本。方法 针对构建的体外定点突变体或CRISPR/Cas9介导的敲入突变体,采用3′端第1、2和3个核苷酸分别与突变序列相匹配的筛选引物进行聚合酶链式反应(PCR),通过琼脂糖凝胶电泳检测是否有特异性扩增条带。结果 利用特异性突变筛选引物进行PCR在正确的突变体中有效地扩增出了DNA条带,而在未成功突变的样本中则无法扩增,琼脂糖凝胶电泳显示有DNA扩增条带,证明正确突变体筛选成功。结论本研究建立的突变体快速筛选方法能够简便快速地筛选出正确突变体,明显简化了突变体的鉴定过程,可有效降低实验成本,提高工作效率。 展开更多
关键词 聚合酶链反应 诱变 定点 突变 CRISPR/Cas9 基因敲入技术 诱变力试验
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GATA1s敲除hPSCs模型构建与造血分化影响初探
2
作者 李霞 李晓红 +2 位作者 周涯 马峰 张勇刚 《生命的化学》 CAS 2023年第3期443-453,共11页
本文建立了GATA1s敲除人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)细胞株,并以此为模型探讨了GATA1s缺失对体外诱导造血分化的影响。本文通过构建含有重组臂-敲入片段(GATA1外显子Ⅱ-Ⅵ序列及BGH polyA序列)-LoxP-潮霉素筛选标记... 本文建立了GATA1s敲除人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)细胞株,并以此为模型探讨了GATA1s缺失对体外诱导造血分化的影响。本文通过构建含有重组臂-敲入片段(GATA1外显子Ⅱ-Ⅵ序列及BGH polyA序列)-LoxP-潮霉素筛选标记-LoxP-重组臂的打靶质粒和含有gRNA-Cas9的gRNA质粒对hPSCs进行基因编辑以敲除GATA1s。通过第一步电穿孔将以上质粒导入细胞,潮霉素初步筛选7 d后的阳性克隆进行下一步电穿孔环化重组酶(Cre)使LoxP位点特异性重组以去除筛选标记,通过单细胞克隆的方式进一步培养,PCR及测序鉴定出正确基因编辑细胞,最后通过蛋白质免疫印迹验证其GATA1与GATA1s蛋白的表达情况,验证敲除GATA1s后的细胞株进行体外诱导造血分化,发现其CD34^(+)、CD43^(+)及CD45^(+)细胞增多,但GPA^(+)、CD41a^(+)及CD42b^(+)细胞显著减少,通过转座子系统过表达GATA1也不能挽救其减少的GPA^(+)、CD41a^(+)及CD42b^(+)细胞。本研究建立了GATA1s敲除hPSCs细胞株,并发现其在造血分化时有重要作用。 展开更多
关键词 GATA1 GATA1s 多能干细胞 基因敲入技术 聚簇规则间隔短回文重复序列 CRISPR相关蛋白 造血分化
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Grx2基因敲除小鼠晶状体混浊模型的建立及Grx2在白内障发病机制中的作用
3
作者 郭勇 郭辰峻 +3 位作者 张婕 宁小娜 陈曦 严宏 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期894-901,共8页
目的建立Grx2基因敲除(KO)和基因敲入(KI)小鼠模型,探讨Grx2基因在白内障发病机制中的作用。方法选取黑色C57BL/6J鼠各5只,利用CRISPR/Cas9系统分别制作Grx2 KO小鼠模型和Grx2 KI小鼠模型,后代小鼠剪尾测序后根据基因型纳入对应分型,观... 目的建立Grx2基因敲除(KO)和基因敲入(KI)小鼠模型,探讨Grx2基因在白内障发病机制中的作用。方法选取黑色C57BL/6J鼠各5只,利用CRISPR/Cas9系统分别制作Grx2 KO小鼠模型和Grx2 KI小鼠模型,后代小鼠剪尾测序后根据基因型纳入对应分型,观察并比较各基因型小鼠一般情况和晶状体混浊情况。处死各型小鼠,采用苏木精-伊红染色法观察小鼠晶状体病理学改变;采用ELISA法测定小鼠晶状体活性氧簇(ROS)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量;采用Western blot法测定小鼠晶状体中Grx2、谷胱甘肽(GSH)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、二硫化谷胱甘肽(GSSG)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白相对表达量。结果剪尾巢式PCR及基因测序证实获得Grx2 KO和Grx2 KI纯合子及杂合子小鼠后代。与同龄野生型(WT)小鼠相比,Grx2 KO纯合子小鼠晶状体混浊提前,而Grx2 KI纯合子小鼠晶状体一直维持透明。苏木精-伊红染色结果显示,5月龄Grx2 KO小鼠晶状体纤维出现大量缝隙和空泡。5月龄Grx2 KO小鼠晶状体8-OHdG含量为(3.886±0.326)ng/ml,高于WT小鼠的(3.531±0.250)ng/ml,差异有统计学意义(t=2.711,P=0.033);Grx2 KO小鼠晶状体ROS荧光强度为1594±132,高于WT小鼠的1157±123,差异有统计学意义(t=3.384,P=0.028)。Western blot结果显示,5月龄Grx2 KO小鼠晶状体Grx2、GSH和Bcl-2相对表达量分别为0.23±0.01、0.70±0.06和0.32±0.03,较WT小鼠的0.52±0.02、1.04±0.08和0.49±0.04降低,差异均有统计学意义(t=2.815,P=0.020;t=2.457,P=0.033;t=2.279,P=0.041)。结论本实验成功制作Grx2 KO和Grx2 KI小鼠模型,Grx2 KO小鼠年龄相关性白内障的发生和发展加速。 展开更多
关键词 白内障 氧化损伤 谷氧还蛋白 基因敲除技术 基因敲入技术 小鼠 晶状体上皮细胞
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利用成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞株的研究
4
作者 谢芳莘 蔡信平 +4 位作者 周建华 李霞 赖默温 张勇刚 马峰 《国际输血及血液学杂志》 CAS 2021年第6期520-529,共10页
目的探讨利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞(hPSC)株的方法。方法①选择GATA1基因为目的基因,利用CRISPR/Cas9技术构建共表达载体[Cas9和向导RNA(gRN... 目的探讨利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞(hPSC)株的方法。方法①选择GATA1基因为目的基因,利用CRISPR/Cas9技术构建共表达载体[Cas9和向导RNA(gRNA)]和打靶载体(重组臂),并且以电穿孔的方式将共表达载体、打靶载体及环化重组酶(Cre)导入hPSC的H1细胞系。经电穿孔后的H1细胞培养2 d后,选择24个H1细胞单克隆进行PCR扩增,以验证共表达载体和打靶载体是否被成功导入,以及Cre是否成功去除H1细胞单克隆中的筛选标志物。②挑取经PCR验证的条带大小正确的阳性H1细胞单克隆,进行细胞培养后,提取H1细胞单克隆基因组,并且分别采用引物对1/2(GATA15′端臂外引物/mCherry 3′端引物)和3/5(HygroR 5′端引物/GATA13′端臂外引物)对基因组进行PCR扩增,以验证该H1细胞单克隆是否具有GATA1和mCherry正确序列。③使用构建完成的H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血功能验证实验,以确认基因编辑是否改变H1细胞特性,以及造血分化能力。选择未经基因编辑H1细胞和H1∶GATA1-mCherry细胞,置于相同的造血分化培养条件培养14 d后,分别于610 nm激发波长免疫荧光显微镜下观察,并采用流式细胞术(FCM)对细胞表面标志物CD34、CD43、CD45进行检测。选取培养至GATA1大量表达时期的H1∶GATA1-mCherry细胞,进行细胞甩片和免疫荧光染色实验。对经过基因编辑的H1∶GATA1-mCherry细胞,进行GATA1特异抗体染色体,观察其能否准确追踪并指示GATA1。结果①经电穿孔转入打靶载体和共表达载体后,H1细胞单克隆PCR扩增产物的电泳结果显示,H1细胞经电穿孔后,可获得2710和945 bp的PCR扩增产物电泳条带;电泳条带为2710 bp,说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列,但是Cre没有去除筛选标志物;条带大小为945 bp,说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列,并且Cre� 展开更多
关键词 GATA1转录因子 多能干细胞 基因敲入技术 成簇规律间隔短回文重复序列 CRISPR相关蛋白 GATA1基因
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