将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)转移到链霉菌染色体整合载体的构建 被引量：4

1

作者 张桂敏 周秀芬 +1 位作者 邓子新 庄永红 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期602-605,共4页

链霉菌抗生素的生物合成对培养环境中氧的供应相当敏感 ,为了改善这一溶氧问题 ,本研究通过将透明颤菌血红蛋白基因 (vgb)克隆到含ФC31int,attP基因的诱导型表达载体pIJ86 0 0上 ,构建了可接合转移到链霉菌的整合型表达vgb基因的质粒 p... 链霉菌抗生素的生物合成对培养环境中氧的供应相当敏感 ,为了改善这一溶氧问题 ,本研究通过将透明颤菌血红蛋白基因 (vgb)克隆到含ФC31int,attP基因的诱导型表达载体pIJ86 0 0上 ,构建了可接合转移到链霉菌的整合型表达vgb基因的质粒 pHZ12 76。pHZ12 76通过接合转移导入变铅青链霉菌 (Streptomyceslivi dans) ,所得重组子经Southern杂交验证后 ,进行诱导表达 ,菌体经破碎后所得蛋白粗提物经Western杂交和CO结合试验表明vgb基因在该菌中表达出了有活性的VHb蛋白。 展开更多

关键词 透明颤菌血红蛋白基因 变铅青链霉菌 整合型 基因表达

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变铅青链霉菌高效异源表达宿主SBT5的构建 被引量：5

2

作者 白亭丽 俞燕飞 +1 位作者 徐钟 陶美凤 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期1-6,共6页

以变铅青链霉菌TK24为出发菌株,依次敲除钙依赖抗生素(CDA)、放线紫红素(ACT)和十一烷基灵菌红素(RED)这3个内源抗生素的生物合成基因簇,同时在钙依赖抗生素基因簇原位整合了来自棒状链霉菌的全局性调控基因afsRScla,构建得到变铅青链... 以变铅青链霉菌TK24为出发菌株,依次敲除钙依赖抗生素(CDA)、放线紫红素(ACT)和十一烷基灵菌红素(RED)这3个内源抗生素的生物合成基因簇,同时在钙依赖抗生素基因簇原位整合了来自棒状链霉菌的全局性调控基因afsRScla,构建得到变铅青链霉菌菌株SBT5。将来自天蓝色链霉菌的放线紫红素生物合成基因簇导入SBT5中,接合子产生大量蓝色的放线紫红素,而出发菌株TK24只产微量蓝色抗生素;SBT5接合子的ACT产量也显著高于导入了额外act基因簇拷贝的出发菌株接合子。SBT5菌株次级代谢背景清晰,不产色素类抗生素和抗细菌抗生素,可作为高效宿主用于次级代谢产物基因簇的异源表达和筛选。 展开更多

关键词 变铅青链霉菌 异源表达宿主 次级代谢产物 抗生素生物合成基因簇 基因敲除 “砖RSm

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柔红霉素C-14羟化酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达 被引量：3

3

作者 吴大治 朱春宝 朱宝泉 《中国医药工业杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期13-15,共3页

将柔红霉素C-14羟化酶基因与酪氨酸酶基因启动子和红霉素抗性基因启动子串联连接,克隆到变铅青链霉菌TK24中进行表达。经过SDS-PAGE蛋白电泳、CO结合差光谱分析结果证明,重组克隆表达的羟化酶分子量约45 kD、重组的蛋白量约占细胞总蛋白... 将柔红霉素C-14羟化酶基因与酪氨酸酶基因启动子和红霉素抗性基因启动子串联连接,克隆到变铅青链霉菌TK24中进行表达。经过SDS-PAGE蛋白电泳、CO结合差光谱分析结果证明,重组克隆表达的羟化酶分子量约45 kD、重组的蛋白量约占细胞总蛋白的12％,并具有细胞色素P-450的特征。 展开更多

关键词 柔红霉素C-14羟化酶 基因克隆 基因表达 变铅青链霉菌 TK24 基因启动子

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大肠杆菌乙酰-CoA羧化酶基因异源表达对变铅青链霉菌次级代谢的影响 被引量：3

4

作者 郑华亮 白亭丽 陶美凤 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期12-18,共7页

克隆组装了大肠杆菌的乙酰-CoA羧化酶基因acc,以研究其异源表达对变铅青链霉菌中2种"沉默"抗生素放线紫红素和十一烷基灵菌红素合成的影响。大肠杆菌ACC由4个基因编码,通过PCR扩增4个基因,并通过重叠延伸PCR加上ermE启动子,... 克隆组装了大肠杆菌的乙酰-CoA羧化酶基因acc,以研究其异源表达对变铅青链霉菌中2种"沉默"抗生素放线紫红素和十一烷基灵菌红素合成的影响。大肠杆菌ACC由4个基因编码,通过PCR扩增4个基因,并通过重叠延伸PCR加上ermE启动子,构建得到4个重组基因;再将重组基因依次组装得到异源表达质粒pHLZ11,接合转移到变铅青链霉菌中进行异源表达。结果显示:含有异源表达质粒的变铅青链霉菌接合转移子能合成放线紫红素而十一烷基灵菌红素产量提高。表明大肠杆菌acc基因异源表达能够激活变铅青链霉菌沉默抗生素的合成,并提高已有抗生素产量。 展开更多

关键词 变铅青链霉菌 大肠杆菌 乙酰-CoA羧化酶 放线紫红素 十一烷基灵菌红素

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灰色链霉菌胰蛋白酶在变铅青链霉菌中的异源表达及酶学性质分析 被引量：2

5

作者 马腾博 令桢民 +3 位作者 康振 李江华 堵国成 陈坚 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期466-479,共14页

胰蛋白酶作为一种重要的丝氨酸蛋白酶被广泛应用于食品、医药和皮革等工业领域。本文成功实现了灰色链霉菌来源的胰蛋白编码基因在变铅青链霉菌中的高效活性表达,并对其酶学性质进行分析比较。以灰色链霉菌ATCC10137基因组为模板,获得... 胰蛋白酶作为一种重要的丝氨酸蛋白酶被广泛应用于食品、医药和皮革等工业领域。本文成功实现了灰色链霉菌来源的胰蛋白编码基因在变铅青链霉菌中的高效活性表达,并对其酶学性质进行分析比较。以灰色链霉菌ATCC10137基因组为模板,获得胰蛋白酶编码基因sprT并克隆至表达质粒pIJ86,成功构建了重组链霉菌工程菌TK24/pIJ86-sprT。以R2YE和SELF为发酵培养基,最高酶活分别达9.21 U/mL和8.61 U/mL。酶学性质分析表明,和牛胰蛋白酶(BT)相比,重组链霉菌胰蛋白酶(rSGT)的耐酸能力强,具有较广的pH;且rSGT对酰胺键具有更高的特异性;此外,Zn2+和有机溶剂分别对rSGT的酯酶活力和酰胺酶活力具有促进作用;本研究结果为rSGT的性质改造以及工业应用提供了依据。 展开更多

关键词 灰色链霉菌 变铅青链霉菌 胰蛋白酶 酶学性质 发酵培养基

原文传递

变铅青链霉菌对噬菌体φHAU3抗性与异常修饰之间的相互关系 被引量：1

6

作者 周秀芬 邓子新 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 1995年第1期63-71,共9页

变铅青链霉菌异常修饰突变菌株ＺＸｌ同时丧失了对噬菌体ＨＡＵ３的抗性，遗传学杂交结果揭示，ＤＮＡ降解和对ＨＡＵ３抗性这两种表型从不发生分离。以ＺＸｌ为宿主和链霉菌低拷贝质粒ＳＣＰ２衍生的载体ｐＩＪ９２２为载体，构建了变... 变铅青链霉菌异常修饰突变菌株ＺＸｌ同时丧失了对噬菌体ＨＡＵ３的抗性，遗传学杂交结果揭示，ＤＮＡ降解和对ＨＡＵ３抗性这两种表型从不发生分离。以ＺＸｌ为宿主和链霉菌低拷贝质粒ＳＣＰ２衍生的载体ｐＩＪ９２２为载体，构建了变铅青链霉菌ＪＴ４６的基因组文库。在８０００多个转化子中获得了一个能使ＺＸ１对ＨＡＵ３显示抗性的杂合质粒，命名为ｐＩＪ８３１０。它除了含有完整的ｐＩＪ９２２外，还携带了大约１１ｋｂ的外源片段。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实，这个外源片段来源于ＪＴ４６，但在ＺＸ１中完全消失。利用转座子Ｔｎ４５６０对该克隆进行诱变定位，获得了中断噬菌体抗性基因表达的衍生质粒，并已证实Ｔｎ４５６０插入在一个２．５ｋｂ的ＢｄｍＨＩ一ＥｃｏＲＩ片段上。 展开更多

关键词 放线菌噬菌体 ψHAU3 变铅青链霉菌 基因克隆

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变铅青链霉菌TK24 secE启动子表达特性的研究 被引量：1

7

作者 王丽非 洪斌 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2003年第4期370-375,共6页

通过PCR扩增得到变铅青链霉菌 (Streptomyceslividans)TK2 4secE基因上游 4 96bp的片段 ,其序列与S .coelicolorsecE启动子序列同源性为 99 8%。将该序列克隆到以儿茶酚加氧酶基因 (xylE)为报告基因的链霉菌启动子探测质粒pIJ4 0 83上 ... 通过PCR扩增得到变铅青链霉菌 (Streptomyceslividans)TK2 4secE基因上游 4 96bp的片段 ,其序列与S .coelicolorsecE启动子序列同源性为 99 8%。将该序列克隆到以儿茶酚加氧酶基因 (xylE)为报告基因的链霉菌启动子探测质粒pIJ4 0 83上 ,并转化S .lividansTK2 4原生质体 ,获得了重组菌株S .lividans[pIJ4 0 83 secE]。S .lividans[pIJ4 0 83 secE]菌株发酵结果表明 ,secE启动子为强启动子 ,活性与vsi基因启动子相当。secE启动子的表达在对数生长期达到高峰 ,平台期下降 ;2 8℃发酵培养时secE启动子活性远高于 37℃发酵培养 ;比较了不同发酵培养基Phage ,NB和CM中secE启动子的活性 ;实验结果还表明培养基中葡萄糖含量对secE启动子的表达有抑制作用。 展开更多

关键词 变铅青链霉菌 Streptomyceslividans secE启动子 xylE 基因表达

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变铅青链霉菌与放线菌噬菌体φHAU3相互关系的研究

8

作者 周秀芬 邓子新 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 1994年第4期346-352,共7页

变铅青链霉菌ＺＸ１，是由变铅青链霉菌ＪＴ４６经ＮＴＧ诱变后产生的一株修饰基因突变株，与其亲本ＪＴ４６相比，ＺＸ１除了与ＤＮＡ降解有关的基因发生了突变（Ｄｎｄ－，即该突变株的ＤＮＡ在含有Ｆｅ２＋的缓冲液中电泳不受到降解... 变铅青链霉菌ＺＸ１，是由变铅青链霉菌ＪＴ４６经ＮＴＧ诱变后产生的一株修饰基因突变株，与其亲本ＪＴ４６相比，ＺＸ１除了与ＤＮＡ降解有关的基因发生了突变（Ｄｎｄ－，即该突变株的ＤＮＡ在含有Ｆｅ２＋的缓冲液中电泳不受到降解，而野生型变铅青链霉菌在同样条件下则遭到降解）以外，对噬菌体　ＨＡＵ３的抗性也随之消失，这项特征主要表现在噬菌斑大小和成斑单位（效价）上的显著变化。研究结果表明，噬菌体　ＨＡＵ３以同等的频率吸附野生型变铅青链霉菌及其突变菌株ＺＸ１，从　ＨＡＵ３基因组中没有克隆到被变铅青链霉菌识别的特异性靶位点；噬菌体ＨＡＵ３的ＤＮＡ也可以转染野生型变铅青链霉菌原生质，但其释放的噬菌体粒子只能感染突变菌株ＺＸ１，而不能感染野生型变铅青链霉菌。噬菌体ＨＡＵ３在突变株ＺＸ１中的繁殖遵循一步生长曲线，单菌释放量大约为１００，而　ＨＡＵ３感染野生型变铅青链霉菌后，则检测不到噬菌体的释放。 展开更多

关键词 变铅青链霉菌 放线菌 噬菌体 噬菌体抗性

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葡萄糖异构酶突变体酶GIG138P和GIG138P-G247D在变铅青链霉菌中的高效表达及检测 被引量：2

9

作者 朱国萍 张颖 +2 位作者 徐旸 唐建国 徐冲 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期304-307,共4页

将含有G138P单点突变和G138P G2 47D双点突变的GI结构基因 ,分别克隆入E .coli 链霉菌穿梭载体pHZ 12 72 ,成功构建了穿梭表达载体pHZGI1和pHZGI2。通过原生质体的转化 ,将穿梭表达载体导入变铅青链霉菌TK5 4菌株。 30℃振荡培养 2 4h ... 将含有G138P单点突变和G138P G2 47D双点突变的GI结构基因 ,分别克隆入E .coli 链霉菌穿梭载体pHZ 12 72 ,成功构建了穿梭表达载体pHZGI1和pHZGI2。通过原生质体的转化 ,将穿梭表达载体导入变铅青链霉菌TK5 4菌株。 30℃振荡培养 2 4h ,加入 2 μg mL硫链丝菌素诱导表达 12h。SDS PAGE电泳表明 ,两个穿梭载体在TK5 4菌株内表达出 42 5kD特异性条带。薄层扫描显示 ,突变体酶GIG138P和GIG138P G2 47D分别约占可溶性蛋白的19%和 2 2 %。Western杂交进一步证实GIG138P和GIG138P G2 47D在变铅青链霉菌TK5 展开更多

关键词 葡萄糖异构酶 突变体酶 穿梭载体 变铅青链霉菌 高效表达 GIG138P GIG138P-G247D

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变铅青链霉菌66中对噬菌ΦHAU3显示抗性的基因（ψHAU3￣R）的核苷酸定序和分析 被引量：1

10

作者 周秀芬 邓子新 《病毒学报》 CSCD 北大核心 1995年第4期365-370,共6页

杂合质粒ｐＩＪ８３１０是链霉菌低拷贝质粒ｐＩＪ９２２１携带了１０．８ｋｂ来自变铅青链霉菌ＪＴ４６菌株，编码对噬菌体ΦＨＡＵ３抗性的ＤＮＡ片段。已知Ｔｎ４５６０插到该克隆中３ｋｂ的ＥｃｏＲＩ或３．３ｋｂ的ＢａｍＨＩ片段... 杂合质粒ｐＩＪ８３１０是链霉菌低拷贝质粒ｐＩＪ９２２１携带了１０．８ｋｂ来自变铅青链霉菌ＪＴ４６菌株，编码对噬菌体ΦＨＡＵ３抗性的ＤＮＡ片段。已知Ｔｎ４５６０插到该克隆中３ｋｂ的ＥｃｏＲＩ或３．３ｋｂ的ＢａｍＨＩ片段（这两个片段之间有２．５ｋｂ的重叠区）上，中断了ΦＨＡＵ３抗性基因的表达。已将３．０ｋｂ的ＢｃｏＡＩ片段分别以两种不同的取向克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）上。核苷酸序列分析揭示出一个１．３ｋｂ的ＯＲＦ的存在，其所编码的４７８个氨基酸组成的蛋白与λ噬菌体的ｅａ５９基因所编码的氨基酸序列显示了高度的同源性，其氨基酸序列的同一性高达３７％，相似性达５８％，而λ噬菌体的ｅａ５９基因是编码赖ＡＴＰ和单键ＤＮＡ的核酸内切酶Ｉ的，该区域与λ的复制无关。此外，这段具有高度同源性的ＤＮＡ区域的Ｇ＋Ｃ％只有６０％，低于变铅青霉菌ＤＮＡＧ＋Ｃ％的平均值（７４％）。 展开更多

关键词 变铅青链霉菌 噬菌体 抗性基因 核苷酸测序

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大鼠α-酰胺酶在变铅青链霉菌中的克隆及表达研究 被引量：1

11

作者 武兵元 李元 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第5期574-577,共4页

α 酰胺酶 (α amidase ,α AE)催化神经和内分泌系统中活性多肽的C 端酰胺化 ,对多肽的生物活性至关重要。以大鼠心房组织的总RNA为模板 ,采用RT PCR技术扩增获得编码α 酰胺酶的cDNA ,并进行了克隆和测序。为了使α 酰胺酶能在链霉菌... α 酰胺酶 (α amidase ,α AE)催化神经和内分泌系统中活性多肽的C 端酰胺化 ,对多肽的生物活性至关重要。以大鼠心房组织的总RNA为模板 ,采用RT PCR技术扩增获得编码α 酰胺酶的cDNA ,并进行了克隆和测序。为了使α 酰胺酶能在链霉菌中分泌表达 ,将其cDNA与链霉菌酪氨酸酶 (melC1)信号肽的编码序列融合得到融合基因mel/AE ,将mel/AE插入链霉菌质粒 pIJ6 80 ,获得重组质粒 pIJ mel/AE6 80。SDS PAGE和生物活性测定证实 ,携带 pIJ mel/AE6 80的重组菌株S .lividansTK5 4[pIJ mel/AE6 80 ]能分泌表达α 酰胺酶。 展开更多

关键词 酰胺酶 基因克隆 变铅青链霉菌 酰胺化多肽

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变铅青链霉菌66多效性突变子的遗传分析 被引量：1

12

作者 周秀芬 邓子新 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1995年第1期1-6,共6页

ＺＸ１和ＺＸ７是变铅青链霉菌ＪＴ４６经ＮＴＧ诱变所产生的多效性突变菌株。进一步的研究证明，它们表达黑色素基因（ｍｅｌ）能力的降低与异常修饰这两种不同的遗传表型是不同基因作用的结果。将天蓝色链霉菌中控制产孢的关键基因ｗ... ＺＸ１和ＺＸ７是变铅青链霉菌ＪＴ４６经ＮＴＧ诱变所产生的多效性突变菌株。进一步的研究证明，它们表达黑色素基因（ｍｅｌ）能力的降低与异常修饰这两种不同的遗传表型是不同基因作用的结果。将天蓝色链霉菌中控制产孢的关键基因ｗｈｉＧ引入ＺＸ１并不能恢复或互补ＺＸ１产孢差的性状。ＺＸ１的ＤＮＡ经脉冲电泳也不被降解。脉冲电泳和基因文库杂交的结果均证明ＺＸ１发生了大片段缺失。 展开更多

关键词 变铅青链霉菌 多效性突变 DNA 修饰 脉冲电泳

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棘白霉素脱酰酶基因工程菌的构建及应用研究 被引量：1

13

作者 赵国玲 陶欣艺 +1 位作者 王风清 魏东芝 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期67-74,共8页

目的:以Streptomyces lividans TK24为表达宿主,构建高效表达棘白霉素脱酰酶(Ech DA)的基因工程菌。方法:从Actinoplanesutahensis NRRL 12052中获取Ech DA的基因片段,连接到链霉菌表达载体p NW-S1,采用诱导型启动子Plac与组成型启动子P... 目的:以Streptomyces lividans TK24为表达宿主,构建高效表达棘白霉素脱酰酶(Ech DA)的基因工程菌。方法:从Actinoplanesutahensis NRRL 12052中获取Ech DA的基因片段,连接到链霉菌表达载体p NW-S1,采用诱导型启动子Plac与组成型启动子Perm E*和PSau3A,依次构建基因工程菌株ZNW-S11、ZNW-S12和ZNW-S13。通过分析启动子对Ech DA分泌表达的影响,确定工程菌的表达能力,随后完善发酵放大的工艺过程,将工程菌株发酵放大到300 L发酵罐水平。结果:成功实现了Ech DA在S.lividans TK24中的诱导分泌表达;在摇瓶水平,Ech DA的酶活可达到125U/L,在24h内可实现对15g/L米卡芬净前体FR901379的完全转化;在300L发酵罐水平,Ech DA的酶活可达到80U/L,可用于10g/LFR901379的完全转化。当前,国内在工业生产中仍使用原始菌A.utahensis来表达Ech DA,而开发的Ech DA基因工程菌,与之相比在生产效率上有了大幅度提升,有助于改良当前棘白霉素类抗生素的生产工艺。 展开更多

关键词 变铅青链霉菌 棘白霉素脱酰酶 基因工程 犹他游动放线菌

原文传递

头状链轮丝菌染色体复制起始区的克隆和对变铅青链霉菌的转化 被引量：1

14

作者 马伟 茅翔 +4 位作者 卢捷 姜卫红 焦瑞身 覃重军 赵国屏 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期662-666,共5页

头状链轮丝菌 (Streptoverticillumcaespitosus)ATCC2 742 2是抗肿瘤药物———丝裂霉素A的产生菌 ,根据高GC含量革兰氏阳性菌染色体复制起始区两端基因序列的保守性 ,采用PCR方法从该菌中克隆了一段包含染色体复制起始区 (oriC)的 1 3k... 头状链轮丝菌 (Streptoverticillumcaespitosus)ATCC2 742 2是抗肿瘤药物———丝裂霉素A的产生菌 ,根据高GC含量革兰氏阳性菌染色体复制起始区两端基因序列的保守性 ,采用PCR方法从该菌中克隆了一段包含染色体复制起始区 (oriC)的 1 3kb片段。序列分析发现 ,克隆片段与天蓝色链霉菌的oriC及邻近区域的同源性达 80 %以上 ;头状链轮丝菌oriC中含有 2 2个DnaA box ,保守序列为TTGTCCACA。以克隆片段构建的质粒可以跨属转化变铅青链霉菌 (S .lividans)ZX7,原生质体转化效率为 3 2× 10 2 个 μgDNA ;质粒在S .lividansZX7中能以低拷贝形式稳定存在 ;转化子的菌落和菌丝形态均正常。头状链轮丝菌oriC序列与几种链霉菌的oriC有较高的同源性 ,以及在变铅青链霉菌中仍具有复制起始活性等说明链轮丝菌属与链霉菌属在系统发生上关系较近 ;但采用最大似然法分析oriC序列构建的头状链轮丝菌与几种链霉菌的系统进化树表明 ,头状链轮丝菌与几种链霉菌之间的分化距离远大于链霉菌之间的分化距离。 展开更多

关键词 头状链轮丝菌 染色体 复制起始区 克隆 变铅青链霉菌 转化

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变铅青链霉菌启动子的克隆和表达 被引量：1

15

作者 还连栋 董可宁 +1 位作者 庄增辉 薛禹谷 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 1991年第1期82-89,共8页

利用启动子探测质粒pIJ486(Tsr^(?) Neo^(?))将变铅青链霉菌(streptomyces lividans)TK24染色体DNA的BamHI酶切片段插入pIJ486的BamHI位点。获得4个硫链丝菌肽抗性、新霉素抗性的重组质粒。它们分别命名为pMGI(10.6kb)、pMG40(7.6kb)、p... 利用启动子探测质粒pIJ486(Tsr^(?) Neo^(?))将变铅青链霉菌(streptomyces lividans)TK24染色体DNA的BamHI酶切片段插入pIJ486的BamHI位点。获得4个硫链丝菌肽抗性、新霉素抗性的重组质粒。它们分别命名为pMGI(10.6kb)、pMG40(7.6kb)、pMG50(10.8kb)和pMG88(7.92kb)。BamHI酶切分析及再转化试验表明,新霉素抗性的恢复确实来自载体的外源插入序列。用BgⅢ酶切已将pMG40的插入序列缩小到0.78kb的pMG40-2,pMG50的插入序列缩小到2.2kb的pMG50-25,仍保留启动子活性。重组质粒pMG50-25的新霉素抗性水平高达90μg/ml(卡那霉素抗性水平为500μg/ml),表明这是一个活性很强的启动子。 展开更多

关键词 启动子 变铅青链霉菌 克隆 表达

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氨肽酶PepN1在细胞外催化杀稻瘟菌素的成熟

16

作者 贺惠 禹贵阳 +2 位作者 王先坤 邓子新 贺新义 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期223-232,共10页

【背景】肽核苷类抗生素杀稻瘟菌素(BlasticidinS,BS)生物合成途径的最后一步是亮氨酰杀稻瘟菌素(Leucylblasticidin S,LBS)水解成熟为BS,BS原始产生菌灰色产色链霉菌和异源表达菌株变铅青链霉菌WJ2清洗过的细胞均能催化这一步反应。前... 【背景】肽核苷类抗生素杀稻瘟菌素(BlasticidinS,BS)生物合成途径的最后一步是亮氨酰杀稻瘟菌素(Leucylblasticidin S,LBS)水解成熟为BS,BS原始产生菌灰色产色链霉菌和异源表达菌株变铅青链霉菌WJ2清洗过的细胞均能催化这一步反应。前期我们确定在这两种菌中都含有编码3个氨肽酶Pep N同源蛋白的基因,其中编码产物Pep N1主要负责水解LBS和亮氨酰脱甲基杀稻瘟菌素(Leucyldemethylblasticidin S,LDBS),且催化效率相当。但是,相比于原始产生菌只积累BS这一种组分,异源表达菌株变铅青链霉菌WJ2还积累了LBS和LDBS,这意味着原始产生菌与WJ2中Pep N1的水解活性存在差异。【目的】研究Pep N1在两个菌株中的表达和分泌对BS组分的影响。【方法】利用Pep N1的多克隆抗体,通过蛋白免疫印迹法(Western blot)比较不同生长时间的原始产生菌和异源表达菌株在细胞内、细胞培养液中Pep N1的表达水平。硫酸铵沉淀收集两种菌株培养液中的蛋白,通过Westernblot检测Pep N1的存在并在体外检测水解活性。【结果】原始产生菌第2-6天细胞内Pep N1水平基本没有变化,而异源表达菌株自第4天起细胞内Pep N1开始减弱,到第6天完全消失;另一方面,Western blot在原始产生菌细胞培养液中检测到Pep N1,而在异源表达菌株中却没有检测到。细胞培养液水解LDBS的活性与Western blot检测到的Pep N1表达水平相一致。【结论】BS原始产生菌能持续表达合成Pep N1并将一部分Pep N1分泌到细胞外,而异源表达菌株WJ2从第4天起则停止合成Pep N1,第2-6天的细胞均不能将Pep N1分泌到细胞外,这导致WJ2中积累亮氨酰化的产物。两个菌株清洗过的细胞均可以水解LDBS和LBS,推测在WJ2体内消失的Pep N1分泌到细胞壁上但没有释放到溶液中,这部分Pep N1可以在WJ2中将部分LDBS和LBS水解成对应的DBS和BS。 展开更多

关键词 杀稻瘟菌素 灰色产色链霉菌 变铅青链霉菌 氨肽酶N 蛋白分泌系统

原文传递

变铅青链霉菌启动子活性片段的亚克隆及其顺序分析

17

作者 蒋红 董可宁 还连栋 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 1994年第6期480-482,共3页

近年来,由于链霉菌启动子探测质粒的构建以及体外克隆技术的迅速发展,使得许多链霉菌启动子得到分离分析.已发现的链霉菌启动子大致可以分为三类:一、与原核生物典型启动子—10区和—35区类似的链霉菌启动子;二、仅与原核生物典型启动子... 近年来,由于链霉菌启动子探测质粒的构建以及体外克隆技术的迅速发展,使得许多链霉菌启动子得到分离分析.已发现的链霉菌启动子大致可以分为三类:一、与原核生物典型启动子—10区和—35区类似的链霉菌启动子;二、仅与原核生物典型启动子—10区相似的启动子;三、无论在—10区还是在—35区与典型的原核生物的启动子都没有任何相似之处的启动子.链霉菌启动子的多样性还表现在—10区与—35区保守序列的间隔长短差异较大,从7bp到24bp长短不一.链霉菌中还常存在着串联的启动子.总之,链霉菌启动子比一般原核生物启动子具有更加复杂的多样性. 展开更多

关键词 变铅青链霉菌 链霉菌 启动子 活性片段 顺序分析

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一种新的链霉菌表达载体启动子(英文)

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作者 吴杭 张部昌 +2 位作者 查向东 孔小卫 马清钧 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期647-652,共6页

eryA基因直接控制着红霉素母环6-脱氧-红霉内酯B的合成,在红霉素生物合成过程中具有重要作用。本文克隆了eryA基因的启动子PeryA,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,构建了大肠埃希菌-糖多孢红霉菌穿梭型质粒。PEG介导原生质体转化法将穿梭... eryA基因直接控制着红霉素母环6-脱氧-红霉内酯B的合成,在红霉素生物合成过程中具有重要作用。本文克隆了eryA基因的启动子PeryA,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,构建了大肠埃希菌-糖多孢红霉菌穿梭型质粒。PEG介导原生质体转化法将穿梭型质粒分别转入糖多孢红霉菌A226与变铅青链霉菌JT46,荧光显微镜检测发现,此启动子在两菌株中都具有功能。随后,以变铅青链霉菌JT46为宿主,对PeryA启动子区域进行了深入研究,结果发现该启动子的-35区并不是必需的,仅有-10区、长度为41bp的该启动子在链霉菌中仍具有功能。定点突变证明-10区对于该启动子是必不可少的。因此,41bp的该启动子片段可作为链霉菌的有效启动子,这是迄今为止所发现的最短的启动子之一,可用于构建新的链霉菌表达载体。 展开更多

关键词 ecyA基因 启动子 糖多孢红霉菌 变铅青链霉菌 增强型绿色荧光蛋白

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人肿瘤坏死因子基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达

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作者 刘菊萍 李元 刘伯英 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 1993年第6期481-487,共7页

以质粒pIJ486为载体,将来源于质粒pHT1的肿瘤坏死因子(TNF-α)cDNA克隆至变铅青链霉菌(Streptomyces lividans TK54),以新毒素(30μg/ml)为选择标记,获得了数百转化子,实验表明No.7转化子S.lividans TK54-HT所含重组质粒pIJT7已克隆有TN... 以质粒pIJ486为载体,将来源于质粒pHT1的肿瘤坏死因子(TNF-α)cDNA克隆至变铅青链霉菌(Streptomyces lividans TK54),以新毒素(30μg/ml)为选择标记,获得了数百转化子,实验表明No.7转化子S.lividans TK54-HT所含重组质粒pIJT7已克隆有TNFcDNA。L929细胞毒实验结果表明该转化子TNF表达量可达10^(?)活性单位/升以上,中和实验确证其表达产物为人TNF-α。 SDS—PAGE表明克隆菌株裂解上清液于17000遭尔顿处有明显蛋白带,与TNF-α分子量相当,这表明TNF基因在变铅青链霉菌中获得了成功的克隆与表达。 展开更多

关键词 变铅青链霉菌 肿瘤坏死因子 基因

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人肿瘤坏死因子β(hTNFβ)在变铅青链霉菌中的表达研究(英文)

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作者 洪斌 李元 +1 位作者 Godelieve Van Mellaert Jozef Anné 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2003年第3期209-214,共6页

以变铅青链霉菌为宿主研究了人TNFβ(hTNFβ)的异源表达。应用链霉菌S .venezuelaeCBS76 2 70分泌产生的枯草杆菌蛋白酶抑制剂vsi基因的启动子、表达调控序列和分泌信号肽序列 ,分别对hTNFβ进行了直接分泌表达、分泌融合表达和胞内表... 以变铅青链霉菌为宿主研究了人TNFβ(hTNFβ)的异源表达。应用链霉菌S .venezuelaeCBS76 2 70分泌产生的枯草杆菌蛋白酶抑制剂vsi基因的启动子、表达调控序列和分泌信号肽序列 ,分别对hTNFβ进行了直接分泌表达、分泌融合表达和胞内表达。将hTNFβ的cDNA分别直接融合于vsi信号肽序列下游 2个氨基酸处、vsi全长基因之后以及vsi起始密码子ATG的下游 ,获得的表达盒分别克隆至链霉菌高拷贝质粒pIJ486 ,转化StreptomyceslividansTK2 4,获得了重组菌株S .lividans(pIJ486 hTNFβ)、S .lividans(pIJ486 vsi hTNFβ)和S .lividans(pIVPA hTNFβ)。分别对不同的重组菌株进行摇瓶培养 ,对其培养的上清液和细胞裂解液进行SDS PAGE和Western杂交 ,结果表明 :hTNFβ在重组菌株中均获得了表达 ,且直接分泌产物和胞内表达产物均具有生物学活性。hTNFβ直接分泌表达产物的分子量约为 16kDa,NB培养基中培养 48h时表达水平约为 0 7mg L。胞内表达产物分子量与对照重组hTNFβ一致(18 7kDa) ,但随培养时间的延长逐步降解为 16kDa ,NB培养基中培养 48h时的表达水平 (2 5 1mg L)远高于其直接分泌表达水平。 展开更多

关键词 人肿瘤坏死因子β hTNFβ 变铅青链霉菌 异源基因表达

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