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Pfu-sso7d DNA聚合酶的制备及反应缓冲液的研究
1
作者 刘俊伶 陶倩倩 +2 位作者 李琳钰 姚新欣 张鑫 《赣南医学院学报》 2024年第4期374-382,共9页
目的:制备有高效扩增长片段以及复杂片段能力的Pfu DNA聚合酶。方法:运用基因工程学方法构建重组质粒pET-28a-Pfu-sso7d,采用优化后的诱导条件对pET-28a-Pfu-sso7d实行诱导表达,将菌液超声破碎并提取上清液,应用镍亲和层析洗脱纯化取得... 目的:制备有高效扩增长片段以及复杂片段能力的Pfu DNA聚合酶。方法:运用基因工程学方法构建重组质粒pET-28a-Pfu-sso7d,采用优化后的诱导条件对pET-28a-Pfu-sso7d实行诱导表达,将菌液超声破碎并提取上清液,应用镍亲和层析洗脱纯化取得较纯Pfu-sso7d DNA聚合酶。采用qPCR方法对酶进行酶活力单位定量、确定反应缓冲液组分最佳浓度及检测自制Pfu-sso7d DNA聚合酶酶活性。结果:在1 mmol·L^(-1) IPTG、16℃条件下诱导Pfu-sso7d DNA聚合酶菌液16 h,Pfu-sso7d DNA聚合酶高效表达;用20~100 mmol·L^(-1)咪唑可将蛋白洗脱。Pfu-sso7d DNA聚合酶最终活力单位定量为1 U·μL^(-1)。PCR最佳反应缓冲液为pH9.0、20 mmol·L^(-1) Tris-HCl、0.6 mmol·L^(-1) MgSO_(4)、50 mmol·L^(-1) KCl、5 mmol·L^(-1)(NH_(4))_(2)SO_(4)、0.1%Triton X-100,添加剂组分为3%DMSO、1 mol·L^(-1)甜菜碱。Pfu-sso7d DNA聚合酶能高效扩增3000 bp的目的条带,活性达到商用高保真DNA聚合酶水平。结论:基于基因重组制备的Pfu-sso7d DNA聚合酶可进行高效的PCR反应,节省了实验室PCR成本,为进一步提高Pfu DNA聚合酶活性提供一定技术参考。 展开更多
关键词 聚合酶链式反应 Pfu DNA聚合酶 Sso7d 反应缓冲液
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鸡白痢沙门氏菌直接-多重PCR检测体系的建立 被引量：2
2
作者 程玲玲 严伟 +3 位作者 侯若彤 帅培强 张彪 白林含 《四川大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期149-154,共6页
通过对鸡白痢沙门氏菌毒力质粒pSPUV上入侵质粒抗原J蛋白和质粒共转移调控因子的编码基因ipaJ和traJ的序列分析,在特异区域设计PCR引物,经沙门氏菌属不同种及常见肠道致病菌的交叉验证,筛选出三对鸡白痢沙门氏菌特异检测引物ipaJ-417、t... 通过对鸡白痢沙门氏菌毒力质粒pSPUV上入侵质粒抗原J蛋白和质粒共转移调控因子的编码基因ipaJ和traJ的序列分析,在特异区域设计PCR引物,经沙门氏菌属不同种及常见肠道致病菌的交叉验证,筛选出三对鸡白痢沙门氏菌特异检测引物ipaJ-417、traJ-387、traJ-476.并且调试出一种利用两种DNA聚合酶的直接三重PCR检测体系:invA-211/traJ-387/16S-495,可以对鸡白痢沙门氏菌进行快速准确的鉴定. 展开更多
关键词 鸡白痢沙门氏菌 毒力质粒pSPUV 特异检测引物 DNA聚合酶共用反应缓冲液 直接三重PCR检测体系
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基因甲基化聚合酶链反应检测体系的优化
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作者 揣征然 黄庆 +1 位作者 黄君富 府伟灵 《检验医学与临床》 CAS 2014年第21期2945-2946,2949,共3页
目的优化甲基化敏感限制性内切酶的聚合酶链反应(PCR)检测体系。方法用甲基化敏感限制性内切酶-PCR技术对10例健康未孕女性的RASSF1A基因进行甲基化检测,并对反应的缓冲体系进行优化。结果未经纯化的酶切产物直接进行PCR时,PCR反应特异... 目的优化甲基化敏感限制性内切酶的聚合酶链反应(PCR)检测体系。方法用甲基化敏感限制性内切酶-PCR技术对10例健康未孕女性的RASSF1A基因进行甲基化检测,并对反应的缓冲体系进行优化。结果未经纯化的酶切产物直接进行PCR时,PCR反应特异性降低,出现众多非特异PCR产物;纯化酶切产物或用PCR缓冲液替代酶切缓冲液后,PCR反应特异性变高。结论酶切缓冲液可影响后续PCR反应的特异性,采取纯化措施或以PCR缓冲液替代酶切缓冲液能够有效提高后续PCR特异性,首选PCR缓冲液替代更为简便。 展开更多
关键词 限制性内切酶缓冲液 聚合酶链反应缓冲液 纯化 基因甲基化检测
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