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4ARE强化的双荧光蛋白报告基因载体的构建及鉴定
1
作者 徐海荣 任雪迪 +3 位作者 翟达 马瑶 李晶 戴尔珣 《现代肿瘤医学》 CAS 2018年第3期325-328,共4页
目的:构建4ARE强化的红、绿双荧光蛋白报告基因载体。方法:人工合成3对ARE序列,经退火和磷酸化后插入pARE-TK-GFP载体,构建成p4ARE-TK-GFP载体。以质粒pDsRed2-N1为模板,PCR扩增红色荧光蛋白及其启动子序列与pMD18-T载体连接,构建成pMD-... 目的:构建4ARE强化的红、绿双荧光蛋白报告基因载体。方法:人工合成3对ARE序列,经退火和磷酸化后插入pARE-TK-GFP载体,构建成p4ARE-TK-GFP载体。以质粒pDsRed2-N1为模板,PCR扩增红色荧光蛋白及其启动子序列与pMD18-T载体连接,构建成pMD-DsRed载体。用Ade Ⅰ酶和BspT Ⅰ酶对载体pMD-DsRed和p4ARE-TK-GFP进行双酶切,连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞后,挑取阳性克隆子进行质粒抽提酶切及测序鉴定。结果:经酶切及DNA测序证实,目的片段ARE及DsRed的序列完全正确,重组双荧光蛋白报告基因载体成功转入DH5α。结论:成功构建4ARE强化的双荧光蛋白报告基因载体并在DH5α内表达,为进一步研究ARE的调控作用奠定了基础。 展开更多
关键词 抗氧化反应元件(ARE) 双荧光蛋白 报告基因 载体构建
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小泛蛋白样修饰物双荧光融合蛋白及其特异性蛋白酶的原核表达及鉴定 被引量：1
2
作者 王晓辉 郭杰 +4 位作者 王菊芳 李杉 孙丽华 王小宁 吕建新 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期701-707,共7页
本实验克隆了人的4种SENP(Sentrin-specific protease)C端催化结构域、3种SUMO(Smallubiq uitin-like modifer)、ECFP(Enhanced cyan fluorescent protein)以及EYFP(Enhanced yellow fluorescent protein)的基因,通过RecJoin克隆技术分... 本实验克隆了人的4种SENP(Sentrin-specific protease)C端催化结构域、3种SUMO(Smallubiq uitin-like modifer)、ECFP(Enhanced cyan fluorescent protein)以及EYFP(Enhanced yellow fluorescent protein)的基因,通过RecJoin克隆技术分别成功构建SENP和ECFP-SUMO-EYFP表达载体B28和B13。将表达载体转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,通过Ni-NTA离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS-PAGE和Westernblotting分析鉴定,并以酶切实验初步分析了SENP相对于底物ECFP-SUMO-EYFP的酶切特异性。最终,SENP3C(SENP3 catalytic domain)截短表达,SENP5C以包涵体形式表达,其他蛋白均为可溶性表达,SDS-PAGE分析表明表达产物分子质量(Mr)与预期相符,Western blotting方法进一步证实其为目的蛋白。酶切实验初步鉴定了SENP1C和SENP2C的酶切特异性。以上蛋白的原核表达为荧光共振能量转移实验奠定了实验基础。 展开更多
关键词 小泛蛋白样修饰物 小泛蛋白样修饰物特异性蛋白酶 小泛蛋白样修饰物双荧光融合蛋白 原核表达 纯化
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