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利用双荧光报告基因可视化鉴定胚特异启动子的功能
1
作者 卜小兰 夏玉梅 +4 位作者 詹祎捷 余木兰 淡俊豪 唐宁 曹孟良 《分子植物育种》 CAS 北大核心 2022年第11期3587-3594,共8页
胚特异启动子对于外源基因在种子中特异表达、改良水稻品质有重要理论和实际意义。为高效鉴定水稻胚特异启动子功能和表达情况,本实验筛选了三个胚特异启动子OsESP1、pEMB1和Ole18,分别连接到含红色荧光蛋白(RFP)报告基因的载体pLJ02上... 胚特异启动子对于外源基因在种子中特异表达、改良水稻品质有重要理论和实际意义。为高效鉴定水稻胚特异启动子功能和表达情况,本实验筛选了三个胚特异启动子OsESP1、pEMB1和Ole18,分别连接到含红色荧光蛋白(RFP)报告基因的载体pLJ02上构建双荧光表达载体。利用基因枪介导的瞬时表达结合农杆菌介导的稳定表达,通过荧光观察,鉴定三个胚特异启动子的特异表达模式。结果表明:GFP/RFP双荧光载体是一个可以用于可视化筛选组织特异启动子的高效表达载体;相较于成熟胚,幼胚更适宜用于胚特异表达启动子的瞬时表达验证,为研究组织特异性启动子驱动外源基因在水稻中表达及水稻品种遗传改良拓展新思路。 展开更多
关键词 胚特异启动子 基因克隆 基因枪 双荧光报告基因
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AGK基因启动子重组质粒构建及其在T淋巴细胞白血病中转录活性的研究
2
作者 肖晓依楠 王瑞琨 +6 位作者 韩萌 刘思含 禚方圻 陈敏宽 杜祎萌 车永胜 徐小洁 《中国癌症防治杂志》 CAS 2024年第5期586-592,共7页
目的研究T淋巴细胞白血病中酰基甘油激酶(acylglycerol kinase,AGK)上游转录机制,构建AGK基因启动子不同截短片段的重组质粒并检测其转录活性。方法利用TIMER2.0、The Human Protein Atlas、Gene Expression Profiling Interactive Anal... 目的研究T淋巴细胞白血病中酰基甘油激酶(acylglycerol kinase,AGK)上游转录机制,构建AGK基因启动子不同截短片段的重组质粒并检测其转录活性。方法利用TIMER2.0、The Human Protein Atlas、Gene Expression Profiling Interactive Analysis等公共数据库探索AGK在白血病中的作用,以pGL4.20-pAGK promoter-luciferase全长质粒为模板,利用PCR法分别扩增AGK启动子不同长度的截短片段;将扩增片段分别插入pGL4.20-basic载体,构建AGK启动子不同截短片段重组质粒;经双酶切及序列鉴定正确后,将重组质粒电击转染至人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat中,采用双荧光素酶报告基因实验测定AGK启动子不同截短片段的双荧光素酶活性。结果AGK在多种类型肿瘤中表达上调(P<0.05),且在白血病细胞中处于较高水平。Log-rank检验结果显示AGK高表达患者的总生存期短于低表达患者(P=0.028)。JASPAR网站预测出3个评分高的转录因子TEAD与AGK的结合区域,并成功构建含AGK基因启动子不同截短片段重组质粒。双荧光素酶报告基因实验发现T淋巴细胞白血病细胞中AGK启动子转录活性在-540bp至-80 bp区域较高。结论人T淋巴细胞白血病细胞中AGK基因启动子在-540 bp至-80 bp区域的转录活性较高,可为进一步研究T淋巴细胞白血病中AGK的转录及其上游调控机制奠定基础。 展开更多
关键词 T淋巴细胞白血病 酰基甘油激酶 转录因子 重组质粒 双荧光酶报告基因
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葛根素对成骨细胞增殖能力及靶向Runx2的miRNA的影响 被引量：22
3
作者 张莹莹 周建斌 +3 位作者 曾祥伟 赵凤鸣 刘光东 詹秀琴 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期1457-1462,共6页
目的研究葛根素作用成骨细胞MC3T3-E1后对细胞的增殖能力和靶向Runx2基因的miRNA的影响。方法 1MTT法检测葛根素作用于MC3T3-E1细胞后对成骨细胞增殖能力的影响。2碱性磷酸酶活性检测葛根素对于成骨细胞活力影响。3葛根素作用于成骨细胞... 目的研究葛根素作用成骨细胞MC3T3-E1后对细胞的增殖能力和靶向Runx2基因的miRNA的影响。方法 1MTT法检测葛根素作用于MC3T3-E1细胞后对成骨细胞增殖能力的影响。2碱性磷酸酶活性检测葛根素对于成骨细胞活力影响。3葛根素作用于成骨细胞后,采用荧光实时定量PCR(Q-PCR)和蛋白印迹法(Western blot)法检测Runx2的mRNA表达水平和蛋白表达水平。4采用Target Scan、Pic Tar等靶点预测软件预测靶向Runx2的miRNA,并与表达谱测定的葛根素作用MC3T3-E1前后miRNA变化作比较。5采用Q-PCR法验证葛根素作用MC3T3-E1前后靶向Runx2基因的miRNA表达量。6构建Runx2 3'UTR/突变型Runx2 3'UTR重组质粒、合成miRNA-204mimics、miRNA-204inhibitor、miRNA-204NC共转染MC3T3-E1细胞,用双荧光素酶报告基因系统验证Runx2与miRNA-204的靶向关系。结果葛根素作用后,与空白对照组比较,细胞增殖活性提高,Runx2的mRNA和蛋白表达水平上升,miRNA-204和miRNA-344f-5p表达水平下降,miRNA-2861表达水平上升,miRNA-23a-5p、miRNA-770-5p、miRNA-871-5p表达水平无明显改变。细胞转染48h后,只有Runx2 3'UTR+miRNA-204 mimics组荧光素蛋白的表达水平明显降低,说明只有miRNA-204可抑制Runx2 3'UTR报告基因的表达。结论葛根素可促进成骨细胞增殖,并通过下调靶向Runx2的miRNA的表达来提高Runx2表达水平。 展开更多
关键词 葛根素 成骨细胞 增殖 碱性磷酸酶 Runx2miR-204 双荧光素酶报告基因
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基于雌激素受体调节Nrf2-ARE通路的黄芩中抗氧化成分的筛选 被引量：13
4
作者 刘媛媛 刘陶 +4 位作者 吴玉梅 张晗 赵鑫 刘志东 李楠 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期822-827,共6页
目的建立基于Nrf2-ARE通路的报告基因筛选模型,筛选黄芩中基于雌激素受体发挥抗氧化作用的活性成分。方法 ARE荧光素酶报告质粒p GL4. 37和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK共同转染293T细胞。将黄芩中汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷等3个主要活... 目的建立基于Nrf2-ARE通路的报告基因筛选模型,筛选黄芩中基于雌激素受体发挥抗氧化作用的活性成分。方法 ARE荧光素酶报告质粒p GL4. 37和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK共同转染293T细胞。将黄芩中汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷等3个主要活性成分和(或)雌激素受体(ER)特异性抑制剂加入Nrf2-ARE双荧光素酶报告基因系统,检测其是否通过ER影响Nrf2-ARE通路,发挥抗氧化作用。将筛选出的成分和(或) ER抑制剂、Nrf2-ARE通路抑制剂加入Ha Ca T细胞中,验证是否通过ER影响Nrf2-ARE通路发挥抗氧化作用。结果黄芩苷(100μmol·L^(-1))可明显激活293T细胞中的Nrf2-ARE通路,诱导表达倍数为空白组的(1. 56±0. 01)倍(P <0. 01)。预给予ER抑制剂后,诱导表达倍数下降至(1. 02±0. 23)倍,抗氧化作用消失。分别预给予ER抑制剂、Nrf2-ARE通路抑制剂后,黄芩苷干预UVB损伤的Ha Ca T细胞中的ROS值明显上升,SOD值明显下降。结论黄芩苷可以通过ER影响Nrf2-ARE通路,发挥抗氧化作用。 展开更多
关键词 黄芩 抗氧化 Nrf2-ARE通路 植物雌激素受体 双荧光素酶报告基因系统 黄芩苷
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熟地黄的大麻素2型受体激动剂活性及对骨代谢的调控作用研究 被引量：10
5
作者 胡思婧 练晨霞 +8 位作者 张奇 周灏 史晓林 程刚 张泉龙 赵琦明 张巧艳 赵瑛 秦路平 《中草药》 CAS CSCD 北大核心 2022年第20期6481-6491,共11页
目的 探究熟地黄的大麻素2型受体(cannabinoid receptor 2,CB2R)激动活性及其对骨代谢的调控作用。方法采用双荧光素酶报告基因建立CB2R调节剂筛选体系;分别给予熟地黄提取物或CB2R选择性激动剂HU308或CB2R反向激动剂AM630处理,采用CCK-... 目的 探究熟地黄的大麻素2型受体(cannabinoid receptor 2,CB2R)激动活性及其对骨代谢的调控作用。方法采用双荧光素酶报告基因建立CB2R调节剂筛选体系;分别给予熟地黄提取物或CB2R选择性激动剂HU308或CB2R反向激动剂AM630处理,采用CCK-8法测定成骨细胞和破骨细胞的增殖活性;采用磷酸苯二钠法测定成骨细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)的活性;采用流式细胞仪测定成骨细胞的细胞周期;采用ALP染色观察成骨细胞分化;采用茜素红染色观察成骨细胞骨矿化结节的形成;采用TRAP染色观察破骨细胞数目;采用罗丹明-鬼笔环肽染色镜观察破骨细胞F-肌动蛋白(F-actin)环的结构和形态;采用Western blotting检测CB2R及骨代谢相关蛋白的表达。结果 500μg/mL熟地黄显著升高HEK293-CB2R细胞CB2R表达(P<0.001),抑制forskolin刺激的HEK293-CB2R细胞中环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)的产生,并且其对CB2R的激动活性可被AM630逆转(P<0.001)。500μg/mL熟地黄显著促进成骨细胞增殖(P<0.001),升高ALP活性(P<0.001),促进骨矿化结节形成,上调CB2R及骨形成相关蛋白的表达(P<0.05、0.01、0.001),抑制p38的表达(P<0.05);抑制破骨细胞形成分化,降低TRAP活性(P<0.001),抑制F-actin环的形成,下调CB2R、p-p38和骨吸收相关蛋白的表达(P<0.05、0.001);熟地黄对成骨细胞和破骨细胞的作用可被AM630逆转(P<0.05、0.01、0.001)。结论 熟地黄具有特异性的CB2R激动活性,并可通过CB2R调控成骨细胞和破骨细胞的功能。 展开更多
关键词 熟地黄 大麻素2型受体激动剂 双荧光素酶报告基因 成骨细胞 破骨细胞 地黄苷D
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谱效捕获技术筛选蛇胆陈皮口服液抗炎平喘药效成分 被引量：7
6
作者 虞涛 万丹 +2 位作者 张瑶纾 姜民 董林毅 《中国药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期459-463,共5页
目的建立超高效液相色谱/四极杆飞行时间质谱与(NF-κB和β2-肾上腺素能受体)双荧光素酶报告基因检测系统相结合的方法,快速测定蛇胆陈皮口服液中抗炎平喘活性成分。方法利用NF-κB和β2-肾上腺素能受体活性的双荧光素酶报告基因检测系... 目的建立超高效液相色谱/四极杆飞行时间质谱与(NF-κB和β2-肾上腺素能受体)双荧光素酶报告基因检测系统相结合的方法,快速测定蛇胆陈皮口服液中抗炎平喘活性成分。方法利用NF-κB和β2-肾上腺素能受体活性的双荧光素酶报告基因检测系统,筛选潜在的抗炎解痉成分,同时根据四级杆飞行时间质谱数据对筛选结构进行鉴定。结果蛇胆陈皮口服液中辛弗林抑制β2-AR激活效应最明显;胆酸、甘氨胆酸、牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸抑制NF-κB激活作用最显著。结论双活性评价谱效捕获方法是对筛选中药复方的有效成分的一种快速有力的手段。 展开更多
关键词 液质联用 Β2受体激动剂 抗炎 平喘 双荧光素酶报告基因实验
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重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建转染及转染细胞萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶表达 被引量：3
7
作者 廖亮 王琴容 杨国辉 《山东医药》 CAS 2020年第9期32-35,共4页
目的构建重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron,并观察其在非小细胞肺癌细胞株PC-9转染后对萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶表达。方法以双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2中的嵌合体内含子(设计长度为133 bp)为模板,PCR扩增后插... 目的构建重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron,并观察其在非小细胞肺癌细胞株PC-9转染后对萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶表达。方法以双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2中的嵌合体内含子(设计长度为133 bp)为模板,PCR扩增后插入到psiCHECK-2质粒中,即获得重组双荧光素酶报告基因质粒psi-CHECK-2-Intron。取psiCHECK-2-Intron质粒,转染至感受态大肠杆菌中,采用琼脂糖凝胶电泳实验观察目的基因片段长度,并对目的基因片段进行基因测序。将重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron、双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2分别转染至PC-9细胞中,记为转染组、对照组,采用qRT-PCR法检测两组细胞中萤火虫荧光素酶mRNA、海肾荧光素酶mRNA,采用双荧光素酶活性实验检测两组细胞中萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性。结果目的基因片段长度为133 bp,基因序列正确,无突变和缺失,表明重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建成功。转染组细胞中萤火虫荧光素酶mRNA、海肾荧光素酶mRNA的相对表达量分别为2.213±0.038、2.004±0.025,对照组分别为1.004±0.012、1.003±0.010,两组相比,P均<0.05。转染组细胞中萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性分别为2.974±0.099、1.948±0.052,对照组分别为1.000±0.018、1.000±0.020,两组相比,P均<0.05。结论成功构建了重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron;psiCHECK-2-Intron转染PC-9细胞后,细胞中萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶的表达均升高。 展开更多
关键词 荧光素酶报告基因 双荧光素酶报告基因 重组双荧光素酶报告基因 嵌合体内含子 基因质粒 萤火虫荧光素酶 海肾荧光素酶 细胞实验
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MiR-143通过负调控GLI3基因来抑制鼻咽癌细胞的迁移 被引量：6
8
作者 钟文 何本夫 +3 位作者 朱成全 肖烈钢 周思朗 彭心昭 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期1057-1061,共5页
目的探讨miR-143在鼻咽癌细胞迁移中的生物学功能及可能的分子机制。方法应用生物信息软件预测miR-143靶基因,分别将预测靶基因GLI3的3'UTR及其突变体构建到荧光素酶载体psiCHECK-2骨架中。通过荧光素酶报告基因检测分析miR-143对... 目的探讨miR-143在鼻咽癌细胞迁移中的生物学功能及可能的分子机制。方法应用生物信息软件预测miR-143靶基因,分别将预测靶基因GLI3的3'UTR及其突变体构建到荧光素酶载体psiCHECK-2骨架中。通过荧光素酶报告基因检测分析miR-143对靶基因GLI3的调控作用,并检测转染miR-143 mimics、inhibitor和siGLI3后鼻咽癌5-8F细胞miR-143和GLI3的表达水平及迁移能力的变化。结果生物信息学预测Hh信号通路转录基因GLI3可能是miR-143的靶基因;双荧光素酶报告基因分析表明miR-143能够作用于GLI3的3'UTR;Western Blot和qRT-PCR结果进一步证明5-8F细胞中miR-143与GLI3的表达呈负相关,并影响5-8F细胞的迁移能力。结论 MiR-143可通过负调控靶基因GLI3抑制鼻咽癌细胞的迁移,为进一步研究miR-143及Hh信号通路在鼻咽癌中的作用机制提供参考价值。 展开更多
关键词 MIR-143 GLI3 双荧光素酶报告基因 5-8F 迁移
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ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列转录活性的鉴定 被引量：6
9
作者 高书颖 许丽艳 +3 位作者 孟令英 崔磊 周飞 李恩民 《肿瘤防治研究》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期1-4,共4页
目的检测ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列的转录活力,探讨ezrin基因在癌细胞的表达调控机制。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测ezrin基因在食管癌细胞EC109、EC171、EC8712、SHEEC,胃癌细胞N87... 目的检测ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列的转录活力,探讨ezrin基因在癌细胞的表达调控机制。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测ezrin基因在食管癌细胞EC109、EC171、EC8712、SHEEC,胃癌细胞N87、BGC823,肺癌细胞A549、95D,肝癌细胞HepG2,白血病细胞K562和宫颈癌细胞HeLa中的mRNA和蛋白表达水平;采用PCR法构建以ezrin基因翻译起始位点上游-1444/+134序列为启动子的真核细胞表达质粒pGLB-hE(-1444/+134);采用双荧光素酶报告基因分析系统检测-1444/+134序列在EC109、Hela、A549和BGC823细胞中的转录活力。结果ezrin基因在食管癌等几种癌细胞中均有高表达,其5′侧翼区-1444/+134序列具有较强的转录活力。结论ezrin基因5′侧翼区序列的转录活性可能对ezrin基因的几种癌细胞中的高表达起重要作用。 展开更多
关键词 EZRIN基因 逆转录聚合酶链反应 WESTERN BLOT检测 双荧光素酶报告基因分析
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MEF2C基因启动子区碱基突变对转录活性的影响 被引量：6
10
作者 邱进 刘辉 +5 位作者 热孜宛古丽.伊敏 袁芳 许瑞 马玲 霍强 周勇 《新疆医科大学学报》 CAS 2017年第5期606-611,616,共7页
目的研究MEF2C基因启动子突变对其转录活性的影响及其突变可能的致病机制。方法采用聚合酶链式反应,以对照组基因组DNA为模板,获得野生型MEF2C基因启动子区DNA片段(-939^+531bp)(1 470bp);利用分子克隆技术将目的片段连接到含有荧光素... 目的研究MEF2C基因启动子突变对其转录活性的影响及其突变可能的致病机制。方法采用聚合酶链式反应,以对照组基因组DNA为模板,获得野生型MEF2C基因启动子区DNA片段(-939^+531bp)(1 470bp);利用分子克隆技术将目的片段连接到含有荧光素酶报告基因的pGL3-Basic载体上,构建野生型MEF2C启动子报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-WT;利用点突变技术,构建突变型MEF2C启动子报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-M1(M1点突变类型:-293插入G突变)、pGL3-Basic-MEF2C-M2(M2点突变类型:-160插入G,C>T突变);采用琼脂糖凝胶电泳、双酶切、基因测序方法验证上述3种载体是否构建成功;利用脂质体瞬时转染技术将pGL3-Basic-MEF2C-WT、pGL3-Basic-MEF2C-M1、pGL3-Basic-MEF2C-M2载体分别体外转染HEK-293T细胞,标记为WT组、M1组、M2组,将pGL3-Basic空载体转染HEK-293T细胞标记为对照组、将相同条件下培养未转染载体的细胞标记为空白组,采用双荧光素酶报告基因检测系统检测各组相对荧光素酶活性(relative luciferase activity RLA),比较各组载体的转录活性。数据用SPSS18.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)处理,运用启动子区生物信息预测软件对各组启动子区序列可能的转录因子结合位点及CpG岛进行预测,并分析比较。结果成功构建了含野生型、M1型、M2型的MEF2C基因启动子区的荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-WT、pGL3-Basic-MEF2C-M1、pGL3-Basic-MEF2C-M2;空白组、对照组、WT组、M1组、M2组的RLA分别为(0.83±0.35)、(2.28±0.36)、(24.17±0.50)、(29.65±2.40);M1组和M2组的RLA水平高于WT组,分别是野生型的10.6倍、13倍,差异具有统计学意义(P<0.05);转录因子结合位点预测发现正常MEF2C基因启动子片段上-356^-108bp存在13个可能的位点,M1突变导致1个新的转录因子结合位点JCV-repeated-sequence生成,M2突变导致1个新的转录因子结合位点Sp1生成;预测发现正常MEF2C基因启动子片段上� 展开更多
关键词 肌细胞增强因子2 启动子突变 单纯性先天性心脏病 双荧光素酶报告基因系统 维吾尔族人群
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miR-205对PEG3在子宫内膜癌细胞系中的靶向降调作用 被引量：6
11
作者 赵萌 李越 +1 位作者 侯新新 张贵宇 《山东大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2013年第4期81-86,共6页
目的探讨子宫内膜癌细胞系中miR-205对父性表达基因3(PEG3)蛋白的作用。方法免疫组化方法确定PEG3蛋白在正常子宫内膜与高、中、低分化子宫内膜癌组织中表达的差异。RT-PCR筛选出miR-205较正常子宫内膜细胞株表达量高的高、中、低分化... 目的探讨子宫内膜癌细胞系中miR-205对父性表达基因3(PEG3)蛋白的作用。方法免疫组化方法确定PEG3蛋白在正常子宫内膜与高、中、低分化子宫内膜癌组织中表达的差异。RT-PCR筛选出miR-205较正常子宫内膜细胞株表达量高的高、中、低分化子宫内膜癌细胞系,CCK-8及流式细胞学实验检测上调miR-205前后细胞增殖及凋亡;Western blot、RT-PCR和双荧光素酶报告基因分析等实验方法验证miR-205对PEG3是否有直接的靶抑制作用。结果 PEG3蛋白在正常子宫内膜组织中表达明显高于高、中、低分化子宫内膜癌组织。miR-205在高、中、低分化子宫内膜癌细胞系中上调后,细胞增殖促进,凋亡抑制;Western blot结果示PEG3蛋白含量降低,PEG3抑制的WNT通路中的两个关键蛋白β-catenin及c-myc也相应的表达量上调,而RT-PCR结果显示PEG3mRNA含量变化差异无统计学意义;双荧光素酶报告基因分析结果显示miR-205作用于PEG3基因的3’UTR端。结论 MiR-205作用于PEG3基因的3’UTR端,在转录后水平抑制PEG3的表达,提示PEG3是miR-205的直接靶基因。 展开更多
关键词 子宫内膜肿瘤 父性表达基因3 微小RNA205 WNT通路 双荧光素酶报告基因分析
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肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定 被引量：5
12
作者 高书颖 李恩民 +4 位作者 孟令英 崔磊 袁华敏 杜则澎 许丽艳 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2009年第3期288-296,共9页
研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶... 研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要. 展开更多
关键词 EZRIN基因 转录调控元件 转录因子 双荧光素酶报告基因分析系统 凝胶电泳迁移率变动分析
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微小RNA-29a-3p调节卷曲蛋白4表达影响高脂血症大鼠种植体骨整合的实验研究 被引量：5
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作者 刘飞 王志峰 +3 位作者 刘芳芳 徐巾诏 刘奇博 蓝菁 《华西口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期200-207,共8页
目的研究microRNA-29a-3p(miR-29a-3p)对高脂环境下大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化和高脂血症大鼠种植体骨整合的影响及其作用位点。方法 1)体外实验:对BMSCs分别进行普通和高脂成骨诱导,通过逆转录实时定量聚合酶链反应和Western... 目的研究microRNA-29a-3p(miR-29a-3p)对高脂环境下大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化和高脂血症大鼠种植体骨整合的影响及其作用位点。方法 1)体外实验:对BMSCs分别进行普通和高脂成骨诱导,通过逆转录实时定量聚合酶链反应和Western blot检测miR-29a-3p及成骨相关因子碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关基因2(Runx2)的基因和蛋白质表达;高脂培养的BMSCs分别转染miR-29a-3p模拟物、抑制物及阴性对照(NC)质粒,RT-qPCR检测miR-29a-3p、ALP及Runx2基因表达情况,Western blot检测ALP、Runx2蛋白表达情况。通过靶基因预测软件(Target Scan、MiRNA.org等)预测miR-29a-3p与成骨相关的靶基因为卷曲蛋白4(Fzd4),双荧光素酶报告检测miR-29a-3p与Fzd4的相互作用关系。2)体内实验:高脂血症大鼠为实验组,普通大鼠为对照组,两组分别植入种植体,检测种植体周围骨组织中miR-29a-3p、ALP、Runx2的表达差异;行种植体-骨组织的硬组织切片,亚甲基蓝-酸性品红染色,进行组织学观察。分别将miR-29a-3p过表达慢病毒载体及空白对照慢病毒载体注射入高脂血症大鼠,种植体植入后3、10 d检测种植体周围骨组织中ALP、Runx2的表达变化以研究miR-29a-3p对高脂血症大鼠成骨的作用。结果高脂组与普通组相比,ALP、Runx2和miR-29a-3p表达下调,BMSCs成骨分化能力下降。miR-29a-3p模拟物组与抑制物组相比,ALP、Runx2表达升高,BMSCs成骨分化能力增强。体内实验也得到了相似结果。双荧光素酶报告基因分析证实miR29a-3p通过直接结合3’-UTR抑制Fzd4表达。结论miR-29a-3p对高脂环境下大鼠BMSCs成骨分化起正向调节作用,可直接与Fzd4结合调节成骨分化;mi R-29a-3p能够促进高脂血症大鼠种植体周围成骨标志基因的表达,有利于骨整合。 展开更多
关键词 微小RNA-29a-3p 高脂血症 卷曲蛋白4 双荧光素酶报告基因 骨整合
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TNF-α3′-UTR双荧光素酶报告基因系统的构建及丹参酮类药物筛选 被引量：5
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作者 韦忠红 朱智杰 +8 位作者 刘玉萍 刘兆国 盛晓波 汪思亮 陶丽 祝娉婷 陈文星 王爱云 陆茵 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期77-81,共5页
目的构建并鉴定p GL3-TNF-α3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统,以此基于调控TNF-α转录后水平对丹参酮类成分进行筛选。方法反转录人脐静脉内皮细胞HUVEC的mRNA成c DNA,以之为模板,PCR扩增含TNF-α3'-UTR的DN... 目的构建并鉴定p GL3-TNF-α3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统,以此基于调控TNF-α转录后水平对丹参酮类成分进行筛选。方法反转录人脐静脉内皮细胞HUVEC的mRNA成c DNA,以之为模板,PCR扩增含TNF-α3'-UTR的DNA片段全长,经酶切后连接至荧光素酶报告载体p GL3-control上,构建出p GL3-TNF-α3'UTR全长的荧光素酶报告基因载体并进行鉴定。将所构建的p GL3-TNF-α3'UTR与p SVRenilla质粒组成双荧光素酶报告系统共转染至单核巨噬细胞RAW264.7,经脂多糖诱导后利用该双荧光素酶报告基因表达系统判定丹参酮类成分对TNF-α转录后调控是否有影响。结果成功构建p GL3-TNF-α3'UTR荧光素酶报告基因,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致。脂多糖(LPS)可以明显诱导转入p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光强度。丹参酮类成分中隐丹参酮可以明显降低LPS诱导的p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光素酶活性。结论成功构建含TNF-α3'UTR区的双荧光素酶报告基因表达系统,并以此从丹参酮类化合物中筛选出隐丹参酮,可以对TNF-α的转录后水平进行抑制调控。 展开更多
关键词 TNF-Α 3′非编码区 双荧光素酶报告基因 转录后调控 隐丹参酮 药物筛选
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一个抑制AP-1活性的人类新基因AC3-33的克隆和初步功能研究 被引量：2
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作者 刘鹏 邓唯唯 +6 位作者 高鹏 陆阳 孙博 李明 赵杰 石太平 张秀军 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期575-582,共8页
Activator protein-1(AP-1)是重要的转录因子,其活性失调与肿瘤等多种疾病直接相关。本文运用"高通量高内涵细胞筛选技术(high throughput-high content cell-based screening technology)"对650个以未知功能基因为主的人类... Activator protein-1(AP-1)是重要的转录因子,其活性失调与肿瘤等多种疾病直接相关。本文运用"高通量高内涵细胞筛选技术(high throughput-high content cell-based screening technology)"对650个以未知功能基因为主的人类基因进行AP-1双荧光素酶报告基因筛选(Dual-Luciferase reporter gene screening),获得了一个可抑制佛波酯(PMA)加离子霉素(Inonmycin)诱导的AP-1活性的人类新基因AC3-33(GenBank中该基因名为C3orf33,No.FLJ31139)。生物信息学分析该基因序列全长1931bp,由6个外显子和5个内含子组成,定位于3q25.31,从271～1026有一个编码251个氨基酸的可读框,编码一个约29kDa的蛋白,在肾上腺和宫颈等多种组织都有表达。AC3-33与其他人类已知蛋白质没有明显的同源性,亚细胞定位于细胞质中,许多氨基酸序列高度保守。初步实验结果显示AC3-33是一个有重要功能的人类新基因。 展开更多
关键词 AP-1 基因克隆 双荧光素酶报告基因筛选 AC3-33
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NLRP3基因3′UTR双荧光素酶报告质粒的构建及miR-22-3p靶向调控 被引量：4
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作者 伍军 李相友 +2 位作者 朱戈丽 张艳霞 毕智敏 《广东医学》 CAS 2018年第23期3463-3468,共6页
目的构建核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3,NLRP3)基因3'非编码区(untranslated region,UTR)野生型及突变型双荧光素酶报告质粒载体,分析微小RNA(miR)-22-3p对NLRP3的调控作用。... 目的构建核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3,NLRP3)基因3'非编码区(untranslated region,UTR)野生型及突变型双荧光素酶报告质粒载体,分析微小RNA(miR)-22-3p对NLRP3的调控作用。方法应用生物信息软件预测miR-22-3p与NLRP3基因的结合位点;将NLRP3基因的3'UTR序列及其突变体克隆到双荧光素酶报告基因载体psi CHECK2中,构建野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒载体,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)及基因测序方法鉴定载体是否构建成功;将培养的人胚肾293T细胞(HEK293T)分为4组:(1) miR-22-3p对照+psi CHECK2;(2) miR-22-3p对照+psi CHECK2-NLRP3-3'UTR(野生型);(3) miR-22-3p模拟物(mimic)+psi CHECK2-NLRP3-3'UTR(野生型);(4) miR-22-3p模拟物(mimic)+psi CHECK2-NLRP3-3'UTR^(mut)(突变型),分别检测细胞荧光素酶活性。结果成功构建了NLRP3基因3'UTR野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒载体; NLRP3-3'UTR野生型与miR-22-3p mimic共转染293T细胞后,荧光素酶活性降低,下降43%,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论成功构建NLRP3基因3'UTR双荧光素酶报告质粒载体并初步验证miR-22-3p对NLRP3的调控作用。 展开更多
关键词 NLRP3 miR-22-3p 双荧光素酶报告基因
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斑马鱼notch1a和notch1b对hsp70基因的调控作用
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作者 王子睿 王昱杰 +3 位作者 周泽斌 邱军强 李伟眀 张庆华 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期829-838,共10页
研究旨在通过双荧光素酶报告基因实验探究斑马鱼notch1a和notch1b基因对hsp70的调控作用。通过NCBI数据库检索获取了斑马鱼notch1a和notch1b基因的CDS序列,对其胞内段(Notch1a/Notch1b intracellular domain,N1aICD/N1bICD)进行克隆并构... 研究旨在通过双荧光素酶报告基因实验探究斑马鱼notch1a和notch1b基因对hsp70的调控作用。通过NCBI数据库检索获取了斑马鱼notch1a和notch1b基因的CDS序列,对其胞内段(Notch1a/Notch1b intracellular domain,N1aICD/N1bICD)进行克隆并构建pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD真核表达载体,在人胚肾细胞(HEK293T)中用Western Blot和亚细胞定位检测N1aICD和N1bICD的表达。通过生信分析并克隆斑马鱼hsp70启动子序列,构建pGL3-hsp70-pro报告基因,并在HEK293T中检测该报告基因的双荧光素酶活性。之后在HEK293T细胞中过表达notch1a和notch1b基因,通过双荧光素酶报告基因实验检测pGL3-hsp70-pro的活性变化,以此探究notch1a和notch1b对hsp70基因的调控作用。实验结果显示真核表达载体pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD构建成功,Western Blot显示pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD可正常表达,亚细胞定位显示N1aICD和N1bICD蛋白表达在HEK293T的细胞核中;双荧光素酶实验显示pGL3-hsp70-pro报告基因在HEK293T细胞中具有活性,是阴性对照质粒的3.7倍;在HEK293T细胞中pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD真核表达载体能够显著增强pGL3-hsp70-pro的活性,分别为对照组的4.9倍和5.1倍。实验结果表明斑马鱼notch1a和notch1b基因可显著增强hsp70基因的表达,为进一步研究Notch分子通过Hsp70进行抗感染免疫的分子机制提供了实验材料并奠定了理论基础。 展开更多
关键词 notch1a notch1b HSP70 双荧光素酶报告基因 细胞凋亡 斑马鱼
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CACNB2基因多态性与原发性高血压的关联性研究 被引量：4
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作者 孙倩 王欣 +6 位作者 黄颖 胡云良 唐疾飞 林燕 牛宇欣 王晓欧 杜兵 《中华医学遗传学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期340-344,共5页
目的探讨钙离子通道G2亚基基因（calciumchannelt72gene，CACNB2）多态性与温州汉族人群原发性高血压的相关性及应用荧光素酶报告基因技术检测rs7069292不同等位基因对基因表达的影响。方法收集原发性高血压患者637例，以血压正常者600... 目的探讨钙离子通道G2亚基基因（calciumchannelt72gene，CACNB2）多态性与温州汉族人群原发性高血压的相关性及应用荧光素酶报告基因技术检测rs7069292不同等位基因对基因表达的影响。方法收集原发性高血压患者637例，以血压正常者600名作对照，采用飞行时间质谱分型技术对CACNB2基因rs2228645、rs2357928、rs7069292、rs7099380、rs10764319和rs11014166共6个SNP位点进行分型。构建CACNB2基因5’上游-2831bp到-2460bp的rs7069292的侧翼序列的荧光素酶报告基因载体。结果高血压组rs7069292CT基因型频率及C等位基因频率高于正常对照组（5．20％vs．2．17％，2．59％vs．1．08％，均P〈0．05），分型未发现rs7069292CC基因型；含rs7069292C等位基因的启动子活性与T等位基因相比明显增高，差异有统计学意义（P〈0．05）；其余5个SNP位点各基因型频率及等位基因频率与对照组比较差异均无统计学意义（均P〉0．05）。结论CACNB2基因rs7069292多态性与温州汉族人群原发性高血压病有关联，T〉C变异可能是CACNB2基因功能表达的一个影响因子。 展开更多
关键词 原发性高血压 钙离子通道 单核苷酸多态性 双荧光素酶报告基因
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hsa-miRNA-216a-5p在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中负性调控NPR3表达 被引量：4
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作者 徐昊 许闫严 +2 位作者 马中希 刘贤莉 尹秀萍 《武汉大学学报（医学版）》 CAS 2022年第2期215-219,共5页
目的:探讨hsa-miRNA-216a-5p(miR-216a)对人源性骨髓间充质干细胞(hMSC)成骨分化的影响并验证其对利尿钠肽受体3(NPR3)基因的靶向作用。方法:原代培养hMSC至第6代后诱导成骨分化;在分化第0、7和14天收集细胞,利用Real-time PCR验证miR-2... 目的:探讨hsa-miRNA-216a-5p(miR-216a)对人源性骨髓间充质干细胞(hMSC)成骨分化的影响并验证其对利尿钠肽受体3(NPR3)基因的靶向作用。方法:原代培养hMSC至第6代后诱导成骨分化;在分化第0、7和14天收集细胞,利用Real-time PCR验证miR-216a的正常表达;慢病毒介导外源性miR-216a在hMSC中高表达,经成骨诱导剂作用后,检测成骨相关基因碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关转录因子2(RUNX2)及成骨相关转录因子抗体(Osterix)表达;茜素红染色细胞鉴定基质矿化;经TargetScan预测NPR3基因为miR-216a的靶基因后,检测miR-216a对NPR3表达的影响;构建包含NPR3-3’UTR的荧光素酶表达质粒及其突变体,分别与miR-216a或阴性对照质粒共转染至HEK293细胞,通过测定荧光素酶表达推测miR-216与NPR3-3’UTR的结合关系。结果:在hMSC向成骨细胞分化第7天和第14天,miR-216a表达下降;高表达外源性miR-216a导致hMSC体外成骨能力下降,特异性成骨基因ALP、RUNX2和Osterix随之降低;成骨分化过程中,NPR3的表达趋势与miR-216a相反;miR-216a通过NPR3的3’UTR区降低荧光素酶表达活性;突变NPR3-3’UTR上miR-216a结合位点的抑制作用消失。结论:在骨髓间充质干细胞的体外成骨分化过程中,miR-216a负性调控NPR3的表达。 展开更多
关键词 微小RNA-216a-5p 骨髓间充质干细胞 利尿钠肽受体3 双荧光素酶报告基因
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miRNA-4465靶向Wnt5A调控对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响
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作者 陈硕硕 孙玉玺 +1 位作者 余德 束汉生 《中国药业》 CAS 2024年第18期26-33,共8页
目的 探讨miRNA-4465(miR-4465)对胶质瘤细胞增殖、侵袭及迁移的影响及其作用机制。方法 采用miR-4465模拟物(mimic)处理U118和U87细胞,检测细胞生物活性。双荧光素酶报告基因实验评价miR-4465和Wnt5A的结合情况。采用siRNA和miR-4465... 目的 探讨miRNA-4465(miR-4465)对胶质瘤细胞增殖、侵袭及迁移的影响及其作用机制。方法 采用miR-4465模拟物(mimic)处理U118和U87细胞,检测细胞生物活性。双荧光素酶报告基因实验评价miR-4465和Wnt5A的结合情况。采用siRNA和miR-4465抑制剂(inhibitor)分别抑制Wnt5A和miR-4465的表达,采用CCK-8法、细胞克隆实验、伤口愈合实验和Transwell实验,检测细胞的增殖、迁移、侵袭能力。复制移植瘤裸鼠模型,评价miR-4465过表达和抑制对其肿瘤生长的影响。结果 miR-4465 mimic显著抑制了U118和U87细胞增殖能力。双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-4465与Wnt5A存在靶向调节作用。沉默Wnt5A可降低细胞的增殖、迁移、侵袭能力,miR-4465被抑制后,细胞的增殖、迁移、侵袭能力均显著增强(P <0.05)。此外,沉默Wnt5A可逆转miR-4465抑制导致的细胞增殖、迁移、侵袭能力增强。体内实验结果显示,miR-4465过表达抑制肿瘤生长和ki67的表达,而miR-4465被抑制后,肿瘤生长和ki67的表达显著增强(P <0.05)。结论 miR-4465在胶质瘤中呈低表达,其过表达可抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力,其下游作用机制与Wnt5A通路有关。 展开更多
关键词 胶质瘤 miR-4465 双荧光素酶报告基因 细胞 增殖 迁移 侵袭 WNT5A
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