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猪MSTN基因双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定
被引量：
4
1
作者
王向鹏
肖一红
+3 位作者
刘园园
杜永坤
马玉萍
周恩民
《西北农林科技大学学报（自然科学版）》
CSCD
北大核心
2012年第8期47-53,59,共8页
【目的】利用正负筛选策略,构建猪肌肉生长抑素(Myostatin,MSTN)基因的双筛选标记打靶载体。【方法】以猪胎儿成纤维细胞DNA为模板,PCR扩增MSTN基因同源长、短臂;采用PCR和Overlap PCR扩增打靶载体正筛选标记嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基...
【目的】利用正负筛选策略,构建猪肌肉生长抑素(Myostatin,MSTN)基因的双筛选标记打靶载体。【方法】以猪胎儿成纤维细胞DNA为模板,PCR扩增MSTN基因同源长、短臂;采用PCR和Overlap PCR扩增打靶载体正筛选标记嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。以pUC57载体为骨架载体,在其多克隆位点连接一段包括Frt序列在内的酶切位点的多克隆位点序列,在2个Frt序列之间连接正筛选标记嘌呤霉素基因和绿色荧光蛋白基因,在Frt序列两侧分别连接5.7和1.9kb的MSTN基因同源长、短臂;在同源短臂后连接负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,将目的片段与载体定向连接克隆。用脂质体法将打靶载体转染猪肾细胞(PK15细胞),用嘌呤霉素和丙氧鸟苷进行正负筛选,验证正负筛选标记基因的功能。【结果】成功克隆了猪MSTN基因同源长、短臂及正筛选嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体,打靶载体长14kb。在打靶载体转染的PK15细胞中,正负筛选标记基因均有生物学活性。【结论】成功构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体。
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关键词
同源重组
基因打靶
猪肌肉生长抑素基因
双
筛选
标记
下载PDF
职称材料
稳定转染纤维素酶相关基因的猪胎儿成纤维细胞系的建立
被引量：
1
2
作者
黄妙容
张献伟
+5 位作者
刘德武
邹娴
帅亮
袁玉娟
朱财林
吴珍芳
《畜牧兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第4期535-542,共8页
旨在构建带有双筛选标记的纤维素酶基因的腮腺特异性表达载体,筛选稳定转染该载体的猪胎儿成纤维细胞系,为制备转纤维素酶基因的转基因克隆猪提供核供体细胞。采用SOE-PCR和PCR方法,分别扩增获得筛选标记基因NEO-T2A-EGFP序列和纤维素...
旨在构建带有双筛选标记的纤维素酶基因的腮腺特异性表达载体,筛选稳定转染该载体的猪胎儿成纤维细胞系,为制备转纤维素酶基因的转基因克隆猪提供核供体细胞。采用SOE-PCR和PCR方法,分别扩增获得筛选标记基因NEO-T2A-EGFP序列和纤维素酶相关基因的融合序列SP-EGX-F2A-BGL1,构建腮腺特异性表达载体pPSP-SP-EGX-F2A-BGL1-CMV-NEO-T2A-EGFP,经PCR、酶切、测序鉴定正确后,通过脂质体转染猪胎儿成纤维细胞,利用G418抗性和绿色荧光蛋白进行稳定筛选,并利用PCR和Western blot进行检测。结果表明,成功构建了带双筛选标记的腮腺特异表达纤维素酶基因的表达载体,并获得稳定转染该载体的猪胎儿成纤维细胞系。该结果为生产腮腺特异表达纤维素酶的转基因克隆猪研究奠定基础。
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关键词
双
筛选
标记
纤维素酶
2A
猪胎儿成纤维细胞
下载PDF
职称材料
题名
猪MSTN基因双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定
被引量：
4
1
作者
王向鹏
肖一红
刘园园
杜永坤
马玉萍
周恩民
机构
西北农林科技大学动物医学院兽医免疫学研究所
山东农业大学动物医学院
出处
《西北农林科技大学学报（自然科学版）》
CSCD
北大核心
2012年第8期47-53,59,共8页
基金
国家"863"高技术研究与发展计划项目(2009AA10Z111)
国家转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08009-147B)
文摘
【目的】利用正负筛选策略,构建猪肌肉生长抑素(Myostatin,MSTN)基因的双筛选标记打靶载体。【方法】以猪胎儿成纤维细胞DNA为模板,PCR扩增MSTN基因同源长、短臂;采用PCR和Overlap PCR扩增打靶载体正筛选标记嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。以pUC57载体为骨架载体,在其多克隆位点连接一段包括Frt序列在内的酶切位点的多克隆位点序列,在2个Frt序列之间连接正筛选标记嘌呤霉素基因和绿色荧光蛋白基因,在Frt序列两侧分别连接5.7和1.9kb的MSTN基因同源长、短臂;在同源短臂后连接负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,将目的片段与载体定向连接克隆。用脂质体法将打靶载体转染猪肾细胞(PK15细胞),用嘌呤霉素和丙氧鸟苷进行正负筛选,验证正负筛选标记基因的功能。【结果】成功克隆了猪MSTN基因同源长、短臂及正筛选嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体,打靶载体长14kb。在打靶载体转染的PK15细胞中,正负筛选标记基因均有生物学活性。【结论】成功构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体。
关键词
同源重组
基因打靶
猪肌肉生长抑素基因
双
筛选
标记
Keywords
homologous recombination
gene targeting
MSTN gene of pig
double-selection
分类号
S813.3 [农业科学—畜牧学]
Q782 [农业科学—畜牧兽医]
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职称材料
题名
稳定转染纤维素酶相关基因的猪胎儿成纤维细胞系的建立
被引量：
1
2
作者
黄妙容
张献伟
刘德武
邹娴
帅亮
袁玉娟
朱财林
吴珍芳
机构
华南农业大学动物科学学院
广东省温氏集团研究院
肇庆大华农生物药品有限公司
出处
《畜牧兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第4期535-542,共8页
基金
国家高技术研究发展计划(863)项目(2011AA100304)
广东省自然科学基金项目(2011A020102003)
+1 种基金
国家科技重大专项(2011ZX08006004)
粤港关键领域重点突破项目(2008A024200012)
文摘
旨在构建带有双筛选标记的纤维素酶基因的腮腺特异性表达载体,筛选稳定转染该载体的猪胎儿成纤维细胞系,为制备转纤维素酶基因的转基因克隆猪提供核供体细胞。采用SOE-PCR和PCR方法,分别扩增获得筛选标记基因NEO-T2A-EGFP序列和纤维素酶相关基因的融合序列SP-EGX-F2A-BGL1,构建腮腺特异性表达载体pPSP-SP-EGX-F2A-BGL1-CMV-NEO-T2A-EGFP,经PCR、酶切、测序鉴定正确后,通过脂质体转染猪胎儿成纤维细胞,利用G418抗性和绿色荧光蛋白进行稳定筛选,并利用PCR和Western blot进行检测。结果表明,成功构建了带双筛选标记的腮腺特异表达纤维素酶基因的表达载体,并获得稳定转染该载体的猪胎儿成纤维细胞系。该结果为生产腮腺特异表达纤维素酶的转基因克隆猪研究奠定基础。
关键词
双
筛选
标记
纤维素酶
2A
猪胎儿成纤维细胞
Keywords
dual screen markers
fibrolytic enzymes
2A
porcine fetal fibroblast cells
分类号
S828 [农业科学—畜牧学]
S814.1 [农业科学—畜牧兽医]
下载PDF
职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
猪MSTN基因双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定
王向鹏
肖一红
刘园园
杜永坤
马玉萍
周恩民
《西北农林科技大学学报（自然科学版）》
CSCD
北大核心
2012
4
下载PDF
职称材料
2
稳定转染纤维素酶相关基因的猪胎儿成纤维细胞系的建立
黄妙容
张献伟
刘德武
邹娴
帅亮
袁玉娟
朱财林
吴珍芳
《畜牧兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013
1
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职称材料
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