PTA-1^(-/-)/ApoE^(-/-)双基因敲除小鼠的繁育及基因型鉴定 被引量：1

1

作者 董子龙 庄然 +2 位作者 张宇丝 金伯泉 张圆 《实验动物科学》 2012年第5期6-8,共3页

目的建立(PTA-1-/-/ApoE-/-)双基因敲除小鼠(double-gene knockout,DKO)模型,探讨该小鼠的繁育及鉴定方法,为进一步利用该小鼠研究相关疾病奠定基础。方法将引进的PTA-1-/-及ApoE-/-基因敲除小鼠通过杂交和互交的方法进行繁殖,以得到DK... 目的建立(PTA-1-/-/ApoE-/-)双基因敲除小鼠(double-gene knockout,DKO)模型,探讨该小鼠的繁育及鉴定方法,为进一步利用该小鼠研究相关疾病奠定基础。方法将引进的PTA-1-/-及ApoE-/-基因敲除小鼠通过杂交和互交的方法进行繁殖,以得到DKO小鼠。结果经过PCR基因鉴定的方法证实PTA-1-/-/ApoE-/-双基因敲除小鼠繁育成功。结论正确的饲养繁殖及鉴定方法是获得该DKO纯合子小鼠的有效途径。 展开更多

关键词 PTA-1 APOE 双基因敲除 小鼠

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PGRN和Rev-erbβ双基因敲除HEK 293细胞系的构建及应用

2

作者 陈芳 杨沛艳 朱久玲 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期1679-1692,共14页

为研究PGRN与Rev-erbβ相互作用可能存在的分子机理及其生理意义,在前期构建的Rev-erbβ基因敲除HEK293 C3-6细胞系的基础上,利用CRISPR/Cas9技术构建PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293细胞系。首先,针对PGRN基因设计了4个不同的sgRNA... 为研究PGRN与Rev-erbβ相互作用可能存在的分子机理及其生理意义,在前期构建的Rev-erbβ基因敲除HEK293 C3-6细胞系的基础上,利用CRISPR/Cas9技术构建PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293细胞系。首先,针对PGRN基因设计了4个不同的sgRNA,经筛选将活性较高的PGRN sgRNA 2和sgRNA 3串联,构建携带双PGRN sgRNA和Cas9的慢病毒打靶载体pLenti/CMV-Loxp-Cas9-sgRNA2-U6-sgRNA3-U6-Loxp-EF1α-Puro。再将包装的携带Cas9和双PGRN sgRNA的慢病毒感染HEK293(Rev-erbβ^(-/-))细胞,通过筛选、克隆化及测序分析获得双基因敲除的HEK293 C3-6/23(Rev-erbβ^(-/-);PGRN^(-/-))单克隆细胞系,并用qRT-PCR和Western blotting检测HEK293(C3-6/23)细胞中PGRN mRNA和蛋白质的表达。最后,在双基因敲除HEK293(C3-6/23)细胞系中,通过回补基因方式研究PGRN介导Rev-erbβ对靶基因启动子转录活性调控研究。在PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293(C3-6/23)细胞系中,PGRN基因的两条DNA链均为缺失突变型,PGRN mRNA和蛋白质的表达均未达到检测水平。同时在HEK293(C3-6/23)细胞系中研究发现PGRN与Rev-erbβ相互作用,可以增强Rev-erbβ对靶基因启动子转录的调控。利用CRISPR/Cas9系统,成功构建了双基因敲除的HEK293(Rev-erbβ^(-/-);PGRN^(-/-))C3-6/23单克隆细胞系。利用该敲除细胞系研究发现PGRN可以影响Rev-erbβ对靶基因启动子转录的调控,但PGRN参与介导Rev-erbβ转录调控的机制还有待进一步研究。 展开更多

关键词 PGRN Rev-erbβ CRISPR/Cas9 双基因敲除 慢病毒打靶载体

原文传递

瘦素和载脂蛋白E基因共同缺陷促进糖尿病动脉粥样斑块形成

3

作者 陈婷婷 胡洪亮 《中国微循环》 2009年第3期200-203,共4页

目的通过瘦素基因缺陷的肥胖型Ⅱ型糖尿病小鼠与ApoE基因敲除(ApoE Knockout)的高胆固醇血症合并动脉粥样硬化的小鼠进行杂交,产生混合性高甘油三酯血症和高胆固醇血症并较单纯ApoE基因敲除小鼠具有更明显的血管动脉粥样硬化。方法采用... 目的通过瘦素基因缺陷的肥胖型Ⅱ型糖尿病小鼠与ApoE基因敲除(ApoE Knockout)的高胆固醇血症合并动脉粥样硬化的小鼠进行杂交,产生混合性高甘油三酯血症和高胆固醇血症并较单纯ApoE基因敲除小鼠具有更明显的血管动脉粥样硬化。方法采用杂交、回交、互交的方法进行培育,提取小鼠尾部基因组DNA进行PCR分析和血浆脂质测定,并从大体病理标本上,主动脉纵切面观察比较血管动脉粥样硬化情况。结果通过上述培育方法,成功得到Leptin及ApoE双基因敲除小鼠。成年小鼠表现为极度的混合型高脂血症,其血浆甘油三酯和胆固醇水平是正常小鼠的2.6倍和8.6倍,其主动脉血管粥样硬化斑块较单纯ApoE基因敲除小鼠更为明显。结论成功培育了Leptin/ApoE双基因敲除的遗传性混合型高甘油三酯、高胆固醇血症小鼠并具有更明显的动脉粥样硬化斑块。 展开更多

关键词 载脂蛋白E 瘦素 双基因敲除 动脉粥样硬化 小鼠模型

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H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除小鼠的鉴定及繁育

4

作者 唐志元 王燕 +2 位作者 吕靓 李林格 张华 《新疆医科大学学报》 CAS 2017年第10期1261-1264,共4页

目的饲养、繁殖和鉴定H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除小鼠,获得双纯合子H2-Eb1^(-/-)+H2-Ab1^(-/-)及双野生型H2-Eb1^(+/+)+H2-Ab1^(+/+)小鼠,为深入研究H2-Eb1、H2-Ab1的基因功能奠定基础。方法基因敲除小鼠经适应性饲养2w后,分别将雌性杂合... 目的饲养、繁殖和鉴定H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除小鼠,获得双纯合子H2-Eb1^(-/-)+H2-Ab1^(-/-)及双野生型H2-Eb1^(+/+)+H2-Ab1^(+/+)小鼠,为深入研究H2-Eb1、H2-Ab1的基因功能奠定基础。方法基因敲除小鼠经适应性饲养2w后,分别将雌性杂合子和雄性杂合子小鼠合笼饲养并繁殖,提取鼠尾DNA,利用PCR法鉴定其基因型。生产后代中的野生型和纯合子小鼠用于后续的生物学功能研究,杂合子小鼠用于繁殖及保种。结果小鼠成功繁殖,其中双纯合子H2-Eb1^(-/-)+H2-Ab1^(-/-)20只(20%),双野生型H2-Eb1^(+/+)+H2-Ab1^(+/+)26只(26%),未鉴定出基因型54只(54%)。成功获得H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除纯合子小鼠,并建立了饲养、繁殖和鉴定方法。结论采用雌性和雄性H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除杂合子小鼠交配,不仅可以获H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除纯合子小鼠,而且有利于长期饲养与繁殖。 展开更多

关键词 双基因敲除 小鼠 基因鉴定 繁育方法

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建立载脂蛋白E基因敲除小鼠骨髓髓源性生长因子缺失模型及鉴定

5

作者 丁燕 向光大 +2 位作者 孟碧莹 徐晓丽 陈月富 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2022年第14期2196-2201,共6页

背景:目前关于髓源性生长因子(myeloid-derived growth factor,MYDGF)与动脉粥样硬化及代谢性疾病的研究较少,因此建立一种载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)敲除骨髓MYDGF缺失的小鼠模型对于研究MYDGF与动脉粥样硬化疾病的关系尤为重... 背景:目前关于髓源性生长因子(myeloid-derived growth factor,MYDGF)与动脉粥样硬化及代谢性疾病的研究较少,因此建立一种载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)敲除骨髓MYDGF缺失的小鼠模型对于研究MYDGF与动脉粥样硬化疾病的关系尤为重要。目的:建立ApoE敲除骨髓MYDGF特异性缺失小鼠模型并进行鉴定。方法:ApoE敲除小鼠和骨髓特异性MYDGF敲除小鼠,均购于上海南方模式生物科技股份有限公司。选取5只ApoE敲除小鼠与10只骨髓特异性MYDGF敲除小鼠进行交配,得到基因型为MYDGF^(flox)/+ApoE^(flox)/+F1子代小鼠30只,MYDGF^(flox)/+ApoE^(flox)/+互相进行交配,一共得到基因型为MYDGF^(flox)/floxApoE^(flox)/flox双敲除小鼠30只和ApoE^(flox)/flox小鼠子代小鼠34只。采用PCR法进行MYDGF^(flox)及ApoE^(flox)基因型鉴定,记录MYDGF^(flox)/floxApoE^(flox)/flox双敲除小鼠与ApoE^(flox)/flox小鼠2月龄的体长及体质量,采用Western blotting和免疫荧光检测2组小鼠骨髓组织MYDGF蛋白相对表达量,油红O染色检测2组小鼠胸主动脉斑块面积。实验方案经中国人民解放军中部战区总医院动物实验伦理委员会批准。结果与结论:①得到基因型为ApoE^(flox)/flox小鼠共34只、MYDGF^(flox)/floxApoE^(flox)/flox小鼠共30只,2组小鼠体长、体质量比较差异均无显著性意义(均P>0.05);②MYDGF^(flox)/floxApoE^(flox)/flox小鼠骨髓组织MYDGF蛋白相对表达量显著低于ApoE^(flox)/flox小鼠(P<0.05);③MYDGF^(flox)/floxApoE^(flox)/flox小鼠胸主动脉的斑块面积百分比显著大于ApoE^(flox)/flox小鼠(P<0.05);④结果证实成功敲除了ApoE小鼠的MYDGF基因,说明成功构建ApoE敲除骨髓特异性MYDGF缺失小鼠模型,并经基因型及蛋白组织水平鉴定;MYDGF基因缺乏可以加重ApoE基因敲除小鼠的动脉粥样硬化。 展开更多

关键词 骨髓细胞 MYDGF基因 APOE基因 MYDGF蛋白 双基因敲除 小鼠

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FAH/GSTZ1双基因突变肝细胞模型的建立

6

作者 刘艳 顾鹏 +5 位作者 叶行 梁春锦 关雅今 张映辉 邹庆剑 顾为望 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2022年第8期71-78,共8页

目的采用CRISPR/Cas9技术敲除人LO2肝细胞系的谷胱甘肽S-转移酶Z1(GSTZ1)和延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH),探讨GSTZ1和FAH基因敲除对于肝细胞生长、增殖、迁移的影响。方法分别构建靶向GSTZ1和FAH基因的向导RNA(sgRNA)载体,与CRISPR/Cas... 目的采用CRISPR/Cas9技术敲除人LO2肝细胞系的谷胱甘肽S-转移酶Z1(GSTZ1)和延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH),探讨GSTZ1和FAH基因敲除对于肝细胞生长、增殖、迁移的影响。方法分别构建靶向GSTZ1和FAH基因的向导RNA(sgRNA)载体,与CRISPR/Cas9载体共转染LO2细胞,通过有限稀释法筛选,基因型鉴定和Western blot实验证实获得的FAH和GSTZ1基因的单基因敲除和双基因敲除三种细胞株。进一步对敲除细胞株表型进行鉴定,通过平板克隆形成实验检测基因敲除肝细胞克隆形成能力;CCK8实验和EdU分析实验测试细胞增殖能力;划痕实验检测细胞迁移能力。结果成功获得GSTZ1、FAH和FAH/GSTZ1三种基因敲除细胞株。相比于野生型细胞,三种细胞株在增殖能力,克隆形成能力、迁移能力均有显著增加,其中FAH敲除对细胞表型的影响相对较小,GSTZ1敲除对肝细胞活性提高最强,双基因敲除细胞活性处于两个单基因敲除之间。结论我们首次成功建立了FAH/GSTZ1双基因突变肝细胞株,为酪氨酸代谢通路研究和Ⅰ型遗传性酪氨酸血症治疗研究提供了一个新型的细胞模型。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9技术 双基因敲除 GSTZ1 FAH LO2细胞系

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混合性高甘油三酯/高胆固醇血症小鼠模型的培育 被引量：3

7

作者 周淑佩 张晓红 +1 位作者 刘国庆 田枫 《中国比较医学杂志》 CAS 2005年第6期368-371,共4页

目的通过脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)基因敲除极度高甘油三酯血症小鼠LPLO与ApoE基因敲除高胆固醇血症小鼠ApoEO杂交,产生混合性高甘油三酯/高胆固醇血症小鼠模型LPLO/ApoEO。方法采用杂交、回交、互交的方法进行培育,并以重组... 目的通过脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)基因敲除极度高甘油三酯血症小鼠LPLO与ApoE基因敲除高胆固醇血症小鼠ApoEO杂交,产生混合性高甘油三酯/高胆固醇血症小鼠模型LPLO/ApoEO。方法采用杂交、回交、互交的方法进行培育,并以重组腺病毒为载体在初生小鼠四肢肌肉内表达LPL基因有益突变体LPL447,救治出生2 d内即死亡LPLO/ApoEO纯合子初生小鼠。采用从LPLO/ApoEO小鼠的个体组织(鼠尾)中提取基因组DNA进行PCR分析和血浆脂质检测个体基因型。结果LPL基因有益突变体在纯合子小鼠体内短暂表达,能够成功救治LPLO/ApoEO双基因敲除小鼠。成年小鼠表现为极度的混合性高脂血症,其血浆甘油三酯和胆固醇水平分别是正常小鼠的76和14倍。结论成功培育了LPLO/ApoEO双基因敲除的遗传性混合性高甘油三酯、高胆固醇血症小鼠模型。 展开更多

关键词 脂蛋白脂酶 载脂蛋白E类 双基因敲除小鼠 繁殖

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炎症对SRA/CD36双基因敲除小鼠肝LDL受体表达的影响 被引量：2

8

作者 李秀兰 柳青 +3 位作者 雷寒 刘宏 陈压西 阮雄中 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第15期1436-1439,共4页

目的探讨炎症对清道夫受体A（scavenger receptor A，SRA）和CD36双基因敲除（SRA-／-/CD36-/-）小鼠肝脏LDL受体表达的影响及其潜存机制。方法将1～3月龄，体质量为18～23g的SRA-/-／CD36-/-雄性小鼠随机分为对照组（n=7），炎症组（n=... 目的探讨炎症对清道夫受体A（scavenger receptor A，SRA）和CD36双基因敲除（SRA-／-/CD36-/-）小鼠肝脏LDL受体表达的影响及其潜存机制。方法将1～3月龄，体质量为18～23g的SRA-/-／CD36-/-雄性小鼠随机分为对照组（n=7），炎症组（n=6），2组均喂以高脂饮食，炎症组小鼠采取皮下注射酪蛋白方法诱导产生慢性炎症模型，14周后应用实时荧光定量RT—PCR技术和免疫组化方法检测肝脏LDL受体基因及调控其转录的SREBP2、SCAP基因表达水平，并观察肝脏形态学及血生化指标的变化。结果与正常对照相比，炎症状态时肝脏LDL受体、SREBP2、SCAP mRNA水平显著高于对照组（P〈0．05），蛋白表达的水平也较对照组明显升高；肝细胞内脂质沉积加重，炎性细胞浸润；血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平均明显降低（P〈0．05），高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯降低不明显。结论炎症通过促进肝细胞内SREBP2、SCAP的表达，进而增强细胞膜表面LDL受体的表达，最终导致肝细胞内胆固醇沉积。 展开更多

关键词 炎症 SRA/CD36双基因敲除小鼠 低密度脂蛋白受体

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EUK4010对Presenilin-1/Presenilin-2双基因敲除小鼠神经退行性病变的影响 被引量：2

9

作者 陈逸群 姜旭 +2 位作者 张冬丽 王丽丽 梅兵 《复旦学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期648-655,共8页

为了研究本实验室筛选出的单体化合物EUK4010对Presenilin-1/Presenilin-2双基因敲除小鼠神经退行性症状的作用及机制,将EUK4010(10μg/g体重)分别作用于2月龄和6月龄的双基因敲除小鼠(dKO小鼠),通过组织学、实时荧光定量PCR及Western b... 为了研究本实验室筛选出的单体化合物EUK4010对Presenilin-1/Presenilin-2双基因敲除小鼠神经退行性症状的作用及机制,将EUK4010(10μg/g体重)分别作用于2月龄和6月龄的双基因敲除小鼠(dKO小鼠),通过组织学、实时荧光定量PCR及Western blot、行为学等方法发现该化合物对dKO小鼠的体重下降、脑室扩大、海马萎缩等有一定缓解作用,但对dKO小鼠认知行为的改变尚不明显.进一步分析发现,EUK4010对dKO小鼠神经退行性症状的改善可能是抑制了由Presenilin-1/Presenilin-2双基因敲除导致的GFAP、C1qα与C4等炎症反应相关基因在皮层与海马中的表达上调所致. 展开更多

关键词 PRESENILIN 双基因敲除小鼠 神经退行性病变 EUK4010 炎症反应因子

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爬梯运动提高Presenilin1/Presenilin2双敲鼠的学习记忆能力 被引量：2

10

作者 嵇婷婷 卢健 +4 位作者 延莉 黄刚 倪兵 梅兵 李斐 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第23期35-42,共8页

目的 Presenilin1/Presenilin2双基因敲除(PS1/PS2DKO)可导致小鼠学习记忆能力受损,该文主要研究跑台运动和爬梯运动对PS1/PS2 DKO小鼠认知能力的影响,并通过检测运动前后各组小鼠体内神经胶质酸性蛋白(GFAP)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧... 目的 Presenilin1/Presenilin2双基因敲除(PS1/PS2DKO)可导致小鼠学习记忆能力受损,该文主要研究跑台运动和爬梯运动对PS1/PS2 DKO小鼠认知能力的影响,并通过检测运动前后各组小鼠体内神经胶质酸性蛋白(GFAP)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)等含量的变化,探讨2种运动方式对DKO小鼠认知能力受损的干预效果及其可能的分子机制。方法将6个月龄雄性DKO小鼠及其同窝对照小鼠(CON小鼠)分为4组,分别为CON不运动组、DKO不运动组、DKO跑台组和DKO爬梯组。对DKO跑台组小鼠进行10周的跑台训练,对DKO爬梯组小鼠进行10周的爬梯训练。运动结束后以开场实验、新异物体识别实验和恐惧条件反射实验测试各组小鼠的运动能力和学习记忆能力;用Western blotting、硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法检测各组小鼠GFAP、MDA、SOD含量的变化。结果爬梯运动可明显改善DKO小鼠的恐惧学习记忆能力;跑台运动和爬梯运动均可降低DKO小鼠前脑中GFAP的含量,但前者也会增加前脑中脂质过氧化程度;而跑台运动和爬梯运动对DKO小鼠前脑中的超氧化物歧化酶活性无明显影响。结论爬梯运动可以改善DKO小鼠的恐惧学习记忆能力,前脑中星型胶质细胞活化程度的降低可能是其分子机制之一。跑台运动对DKO小鼠的学习记忆能力无影响,究其原因可能是跑台运动后DKO小鼠前脑产生大量的氧自由基,其导致的脂质过氧化引起神经细胞损伤,从而抵消了跑台运动对DKO小鼠学习记忆能力的改善作用。 展开更多

关键词 Presenilin1/Presenilin2双基因敲除小鼠 跑台运动 爬梯运动 行为学

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利用PRNP^(-/-)羊制备朊蛋白多克隆抗体及其特性分析

11

作者 王学斌 俞慧清 +3 位作者 吴晓东 徐旭俊 陈建泉 成国祥 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期1399-1405,共7页

【目的】利用朊蛋白双基因敲除(PRNP-/-)羊制备朊蛋白多克隆抗体,并对其特性进行分析。【方法】构建山羊朊蛋白(PrP)原核表达载体,转入大肠杆菌并诱导表达,纯化获得羊PrP;将获得的PrP免疫PRNP-/-山羊,制备朊蛋白特异性的多克隆抗体;并... 【目的】利用朊蛋白双基因敲除(PRNP-/-)羊制备朊蛋白多克隆抗体,并对其特性进行分析。【方法】构建山羊朊蛋白(PrP)原核表达载体,转入大肠杆菌并诱导表达,纯化获得羊PrP;将获得的PrP免疫PRNP-/-山羊,制备朊蛋白特异性的多克隆抗体;并对获得的朊蛋白多克隆抗体进行ELISA及Western-blot检测。【结果】获得了大量的朊蛋白特异性抗血清,间接ELASA检测抗血清中朊蛋白多克隆抗体的效价为25600;Western-blot检测显示所制备抗体不仅可以识别鼠、牛、羊脑组织内源性朊蛋白,而且能识别鼠脑组织内朊病毒。【结论】PRNP-/-转基因山羊可用于制备大量高亲和力朊蛋白多克隆抗体,获得的抗体可用于多种动物朊蛋白及朊病毒类疾病的检测。 展开更多

关键词 朊蛋白 朊病毒 多克隆抗体 朊蛋白双基因敲除山羊

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Presenilins条件性双基因敲除小鼠海马与皮层超微结构的增龄性变化

12

作者 李莉 刘国灿 +2 位作者 梅兵 章平 倪兵 《复旦学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期472-478,共7页

为研究Presenilins条件性双基因敲除对于小鼠海马与皮层超微结构的影响,选用3、6及12月龄Presenilins 1/Presenilins 2双敲除小鼠(dKO)和同窝对照小鼠(CON),运用透射电子显微镜技术,分别观察海马与皮层突触、细胞核、线粒体、溶酶体超... 为研究Presenilins条件性双基因敲除对于小鼠海马与皮层超微结构的影响,选用3、6及12月龄Presenilins 1/Presenilins 2双敲除小鼠(dKO)和同窝对照小鼠(CON),运用透射电子显微镜技术,分别观察海马与皮层突触、细胞核、线粒体、溶酶体超微结构的改变.结果发现:3月龄dKO小鼠海马与皮层溶酶体已向次级溶酶体转化.6月龄dKO小鼠海马与皮层的突触后致密物厚度显著降低;皮层细胞核膜内陷,核不规则;海马与皮层线粒体出现肿胀、嵴变形或消失;出现高电子密度的次级溶酶体,并伴有脂褐素小体出现.12月龄dKO小鼠海马与皮层突触后致密物厚度显著减小,突触间隙宽度显著增加;海马与皮层核膜内陷,染色质固缩沿核膜分布;线粒体严重受损,嵴大部分溶解;出现较多次级溶酶体和脂褐素小体.Presenilins条件性双基因敲除对小鼠海马与皮层有增龄性的病理影响,这些病理改变将为相关的药物评价和对阿尔茨海默病的深入研究提供形态学依据. 展开更多

关键词 PRESENILINS 条件性双基因敲除小鼠 超微结构

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