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题名CRISPR/Cpf1双切刻系统的构建与活性检测
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作者
张权威
都萌萌
翟双双
赵金山
李和刚
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机构
青岛农业大学动物科技学院
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出处
《中国畜牧杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第1期254-259,共6页
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基金
山东省羊产业技术体系(SDAIT-10-03)
内蒙古自治区科技重大专项(2020ZD0003)
+3 种基金
国家自然科学基金(31572383、31301936)
青岛市民生科技计划(19-6-1-68-nsh、19-6-1-63-nsh、21-1-4-ny-8-nsh)
山东省草学一级学科建设经费
青岛农业大学高层次人才引进基金(663/1119050、663/1118027)。
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文摘
Cpf1是2类V型CRISPR-Cas系统的单个RNA引导的核酸内切酶,具有切割DNA的核酸酶活性。该系统由Cpf1核酸酶和CRISPR RNA(crRNA)组成,对于如何提高CRISPR/Cpf1系统的基因编辑效率主要集中在增强crRNA的稳定性、设计对PAM要求更简单的Cpf1变体或者鉴定新型Cpf1核酸内切酶。然而,其是否适用于构建双切刻系统还有待验证。因此,本研究旨在设计3种AsCpf1突变体以及成对的crRNA,进行瞬时转染,利用双荧光素酶报告基因检测评估AsCpf1双切刻系统的编辑效率;同时探究人工改造的crRNA能否提高AsCpf1双切刻系统的编辑效率;以及设计6对具有拓展PAMs序列的crRNA靶向位点,评估HkCpf1双切刻系统在哺乳动物基因组中的编辑效率。结果显示:3种AsCpf1突变体均能不同程度地提高报告基因的相对活性,并具有切割DNA单链的能力。在AsCpf1 crRNA发生突变和延伸后,它们仍然具有引导AsCpf1双切刻系统切割DNA单链的能力。HkCpf1不仅可以用做构建双切刻系统还具有较高的切割活性,并且可以识别5’-YTN和5’-TYYN PAMs序列,与AsCpf1相比,显著拓宽了其靶向范围。
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关键词
CRISPR/Cpf1
双切刻系统
突变体
人工改造
crRNA
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Keywords
CRISPR/Cpf1
Double-nicking system
Mutant
Artificial modification
crRNA
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分类号
S826.2
[农业科学—畜牧学]
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题名CRISPR/AsCpf1双切刻系统构建初探
被引量：3
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作者
辛京京
李和刚
秦怀远
张宁
赵金山
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机构
青岛农业大学动物科技学院
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出处
《中国畜牧杂志》
CAS
北大核心
2020年第12期174-180,共7页
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基金
国家自然科学基金面上项目(31572383)
青岛市民生科技计划项目(19-6-1-63-nsh)
山东省草学一流学科建设资助项目(2019-08)。
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文摘
为了在CRISPR/AsCpf1系统的基础上构建双切刻系统,提高基因编辑特异性,本研究设计并构建Cpf1n(R1226A)、Cpf1-RRA(S542R/K607R/K949A)、Cpf1-RRAA(S542R/K607R/K949A/R1226A)3个突变体以及相应的crRNA表达载体,通过特定质粒组合与SSA-DKK2报告质粒共转染绵羊成纤维细胞,通过双荧光素酶检测的方式来验证DNA切割效率。结果显示:针对TTTV PAM的CRISPR/AsCpf1双切刻系统有DNA双链切割活性,但是单个的AsCpf1切口酶的DNA双链切割活性并未完全丧失;AsCpf1-RRA突变体针对TYCV PAM靶标具有一定的DNA双链切割活性;AsCpf1-RRAA突变体没有检测到针对TYCV PAM靶标的DNA双链和单链切割活性,但可能保留了DNA结合能力。本研究结果为后续高效CRISPR/Cpf1双切刻系统的开发与改进提供了重要参考。
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关键词
CRISPR/AsCpf1
双切刻系统
特异性
突变体
TYCV
PAM
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Keywords
CRISPR/AsCpf1
Double-nicking System
Specificity
Mutant
TYCV PAM
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分类号
Q812
[生物学—生物工程]
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