双分子荧光互补技术在动物病毒中的研究进展 被引量：3

1

作者 周水娟 郭忠建 《生物技术进展》 2022年第6期825-836,共12页

病毒侵染宿主的过程存在着一系列相互作用,了解病毒与宿主之间的蛋白质相互作用对于深入研究病毒具有重要意义。在众多研究蛋白质相互作用的方法中,双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)因其能在活细胞... 病毒侵染宿主的过程存在着一系列相互作用,了解病毒与宿主之间的蛋白质相互作用对于深入研究病毒具有重要意义。在众多研究蛋白质相互作用的方法中,双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)因其能在活细胞中可视化相互作用而被广泛应用。介绍了双分子荧光技术的原理、发展和优势,总结了双分子荧光技术在动物病毒以及抗病毒药物研究中的应用,并进一步阐述了新型双分子荧光系统的原理,以期为研究动物病毒致病机制和抗病毒药物研发提供新的思路。 展开更多

关键词 双分子荧光互补技术 蛋白质相互作用 动物病毒 抗病毒药物

下载PDF 职称材料

利用分裂泛素酵母双杂交技术钓取小麦TaSC互作蛋白质 被引量：3

2

作者 蔺芳芳 杨旭 +3 位作者 武小翠 刘晓梅 葛荣朝 赵宝存 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期423-430,共8页

TaSC(Triticum asetivum L.salt-tolerance related gene,Gen Bank登录号为AY956330)是从小麦耐盐突变体RH8706-49中克隆的高盐诱导表达的耐盐相关基因。以该基因编码的蛋白质TaSC为诱饵,运用分裂泛素酵母双杂交技术从小麦cDNA表达文库... TaSC(Triticum asetivum L.salt-tolerance related gene,Gen Bank登录号为AY956330)是从小麦耐盐突变体RH8706-49中克隆的高盐诱导表达的耐盐相关基因。以该基因编码的蛋白质TaSC为诱饵,运用分裂泛素酵母双杂交技术从小麦cDNA表达文库中钓取互作蛋白质,筛选到一个编码小麦未知功能蛋白质的基因(GenBank登录号为AK336035),命名为TaSCIP1(TaSC interaction protein 1)。双分子荧光互补(BiFC)实验证实TaSCIP1与TaSC存在互作。该互作蛋白的分离有利于进一步研究TaSC基因的耐盐机制。 展开更多

关键词 TaSC 小麦 CDNA表达文库 分裂泛素酵母双杂交 双分子荧光互补技术

下载PDF 职称材料

双分子荧光互补技术的应用与展望 被引量：3

3

作者 史彦薇 孔建强 安建梅 《药物生物技术》 CAS 2013年第5期443-447,共5页

双分子荧光互补技术是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术。该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用,彼此靠近,重新构建成完整的具有活性的... 双分子荧光互补技术是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术。该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用,彼此靠近,重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子,从而产生荧光。BiFC方法简单直观,具有可视性的特点,对温度敏感,荧光片段种类较多,被广泛地应用到不同的细胞中,既可以检测蛋白之间的相互作用,也可以定位蛋白质相互作用的位点。此外,BiFC还能在蛋白构型的确定以及RNA的检测方面发挥作用。经过若干年的发展,双色荧光互补技术已经发展成包括多色荧光互补技术,BiFC和FRET联用技术以及BiFC和YTH联用技术在内的多种技术,拓宽了BiFC的应用。 展开更多

关键词 双分子荧光互补技术 蛋白质片段互补 荧光蛋白 蛋白质相互作用

原文传递

双分子荧光互补技术在蛋白质相互作用研究中的应用 被引量：3

4

作者 沈珂 吴群英 蒋晓山 《中国医学创新》 CAS 2015年第12期132-135,共4页

双分子荧光互补技术(Bi FC)是基于两个不发光的荧光蛋白互补片段在借助其融合蛋白的驱动下重新形成活性荧光蛋白,直接作为报告基因的可视化关键性技术,在探究各种模式生物体内蛋白质与蛋白质间相互作用(PPI)技术中日益受到重视。本文对B... 双分子荧光互补技术(Bi FC)是基于两个不发光的荧光蛋白互补片段在借助其融合蛋白的驱动下重新形成活性荧光蛋白,直接作为报告基因的可视化关键性技术,在探究各种模式生物体内蛋白质与蛋白质间相互作用(PPI)技术中日益受到重视。本文对Bi FC技术原理、发展过程、应用现状、技术改进、及未来展望进行概述。 展开更多

关键词 双分子荧光互补技术 蛋白质相互作用 荧光蛋白 细胞信号转导

下载PDF 职称材料

利用BiFC技术研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1结构域Ⅰ与棒状体颈部蛋白2互作关系 被引量：3

5

作者 严茗 黄兵 +6 位作者 赵其平 韩红玉 朱顺海 赵宗平 陈婷 吕凌 董辉 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第4期32-38,共7页

为了验证柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1结构域Ⅰ(apical membrance antigen 1 domain I,E tAMA1-DⅠ)与棒状体颈部蛋白2(rhoptry neck protein 2,EtRON2)的互作关系,以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增出492 bp的E t... 为了验证柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1结构域Ⅰ(apical membrance antigen 1 domain I,E tAMA1-DⅠ)与棒状体颈部蛋白2(rhoptry neck protein 2,EtRON2)的互作关系,以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增出492 bp的E tAMA1-DⅠ片段和1395 bp的E tRON2片段,并与pGEM-T-easy载体连接构建相应重组质粒。获得的阳性重组质粒及双分子荧光互补技术的真核表达载体pBiFC-VN155和pBiFC-VC155用E c oRⅠ和B g I II进行双酶切,将E tAMA1-DⅠ、E tRON2分别与pBiFC-VN155、pBiFC-VC155连接,构建真核重组质粒pBiFC-VN155-E tAMA1-DⅠ和pBiFC-VC155-E tRON2。将2个真核重组质粒分别转染BHK细胞进行表达,经间接免疫荧光鉴定,可在BHK细胞中成功表达。将2个真核重组质粒共转染至BHK细胞中,同时将pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(deltaZIP)VC155、pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(delta)VC155共转染至细胞中分别作为阳性和阴性对照组。BiFC结果发现真核重组质粒共转染组和阳性对照组的BHK细胞均产生绿色荧光,而阴性对照组无荧光,表明E tAMA1-DⅠ与E tRON2蛋白之间存在互作关系。本研究结果为深入研究E tAMA1及E tRON2在球虫入侵过程中的功能与作用机制奠定基础。 展开更多

关键词 柔嫩艾美耳球虫 顶膜抗原1 棒状体颈部蛋白2 双分子荧光互补技术 互作蛋白

下载PDF 职称材料

P型PRSV-VPg蛋白与寄主eIF4E蛋白的互作 被引量：3

6

作者 胡正龙 肖旭倩 +3 位作者 沈文涛 言普 黎小瑛 周鹏 《热带作物学报》 CSCD 2009年第7期1013-1018,共6页

为研究番木瓜环斑病毒P型株系(PRSV-P)的病毒基因组连接蛋白(VPg)与寄主eIF4E蛋白的互作,采用双分子荧光互补技术(BiFc),通过基因枪转化法轰击洋葱表皮,在荧光显微镜下观察两者间的互作结果。结果表明:番木瓜eIF4E与P型PRSV-VPg,西瓜eI... 为研究番木瓜环斑病毒P型株系(PRSV-P)的病毒基因组连接蛋白(VPg)与寄主eIF4E蛋白的互作,采用双分子荧光互补技术(BiFc),通过基因枪转化法轰击洋葱表皮,在荧光显微镜下观察两者间的互作结果。结果表明:番木瓜eIF4E与P型PRSV-VPg,西瓜eIF4E与P型PRSV-VPg蛋白均发生互作。eIF4E与VPg的互作为研究通过转基因方法抑制或过量表达突变关键位点的寄主因子,阻断关键因子互作获得抗病植株提供了可行性依据。 展开更多

关键词 番木瓜环斑病毒 病毒基因组连接蛋白 真核翻译起始因子 双分子荧光互补技术 蛋白互作

下载PDF 职称材料

靶向人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)整合酶多肽药物表达载体的构建 被引量：2

7

作者 叶丽颖 彭臻菲 +3 位作者 赵婷婷 谢富安 王军凯 魏碧娜 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期333-338,共6页

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)整合酶(IN)表达载体用于双分子荧光互补技术筛选多肽药物。方法PCR扩增HIV-1 IN的全长基因序列,将目的片段插入至pBiFc-VN173载体中,并对重组质粒pBiFc-VN173-IN进行双酶切及测序鉴定。将重组质粒pBi... 目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)整合酶(IN)表达载体用于双分子荧光互补技术筛选多肽药物。方法PCR扩增HIV-1 IN的全长基因序列,将目的片段插入至pBiFc-VN173载体中,并对重组质粒pBiFc-VN173-IN进行双酶切及测序鉴定。将重组质粒pBiFc-VN173-IN和对照组质粒pBiFc-VN173分别转染HEK293T细胞,采用Western blot法和免疫荧光细胞化学染色法检测IN的表达。结果通过高保真PCR、载体构建和鉴定,成功获得IN表达载体pBiFc-VN173-IN。与对照组相比,通过Western blot法和免疫荧光细胞化学染色法证实转染质粒pBiFc-VN173-IN载体的HEK293T细胞表达IN。结论成功构建了IN表达载体,该载体可用于和IN相互作用的多肽药物的双分子荧光互补技术筛选。 展开更多

关键词 整合酶(IN) 双分子荧光互补技术 蛋白表达

下载PDF 职称材料

基于BiFC技术验证IMM-H004对CKLF1/CCR4结合的影响 被引量：2

8

作者 彭也 张钊 +1 位作者 楚世峰 陈乃宏 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期1030-1035,共6页

目的利用BiFC双分子荧光互补技术研究香豆素衍生物IMM-H004对趋化素样因子CKLF1与其受体CCR4结合的影响。方法引入BiFC技术,将CKLF1趋化活性肽段C27与CCR4分别与Venus荧光蛋白的N端(VN173)和C端(VC155)相连,C27与CCR4的结合可以Venus黄... 目的利用BiFC双分子荧光互补技术研究香豆素衍生物IMM-H004对趋化素样因子CKLF1与其受体CCR4结合的影响。方法引入BiFC技术,将CKLF1趋化活性肽段C27与CCR4分别与Venus荧光蛋白的N端(VN173)和C端(VC155)相连,C27与CCR4的结合可以Venus黄色荧光的形式体现,重组载体共转染HEK293细胞,进行氧糖剥夺/复氧损伤造模,并给予0.1、1和10μmol·L^-1 IMM-H004,观察活细胞中荧光强度。结果通过测序比对验证CKLF1/CCR4-BiFC系统构建成功,并能转染HEK293细胞正常启动,在该系统中,与Control组相比,OGD/R造模后黄色荧光强度明显增加(P<0.01),给予不同浓度IMM-H004后荧光表达均明显降低(P<0.01),差异具有统计学意义。结论通过BiFC技术,在活细胞状态下直观观察到IMM-H004在脑缺血损伤模型中具有明显的神经保护作用,可拮抗氧糖剥夺/复氧损伤造模状态下CKLF1/CCR4的结合。 展开更多

关键词 香豆素衍生物 趋化素样因子1 趋化因子受体4 双分子荧光互补技术 缺血性脑卒中 氧糖剥夺/复氧复糖

下载PDF 职称材料

pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒的构建及其在活细胞内的相互作用 被引量：2

9

作者 郭术俊 赵保明 +2 位作者 唐洁 胡建国 吕合作 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期137-141,共5页

目的构建pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察Olig2与Id4的相互作用。方法利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),以新生大鼠脊髓RNA为模板,扩增Olig2和Id4基因,分别定向克隆到p... 目的构建pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察Olig2与Id4的相互作用。方法利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),以新生大鼠脊髓RNA为模板,扩增Olig2和Id4基因,分别定向克隆到pBiFC-VN173和pBiFC-VC155载体中,获得pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒。对此2种质粒进行酶切鉴定、测序;用脂质体方法共转染pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4质粒到人结肠癌细胞系SW-1116细胞中,在荧光显微镜下观察Olig2与Id4之间的相互作用。结果通过酶切鉴定和测序表明成功构建了pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒;该质粒能够有效地共同转染到靶细胞,Olig2和Id4在靶细胞中能够高效表达,并可以相互结合出现BiFC荧光信号,且该信号主要分布于胞质中。结论成功构建了用于BiFC技术的真核表达载体,并在活细胞内检测到Olig2和Id4分子的相互结合。 展开更多

关键词 OLIG2 DNA结合抑制因子4 重组质粒 转染 细胞定位 双分子荧光互补技术

下载PDF 职称材料

荧光蛋白在双分子荧光互补技术中的应用 被引量：1

10

作者 胡小健 陆致晟 《复旦学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期21-28,共8页

随着荧光蛋白(fluorescent protein)被不断改进和广泛运用于生物科学的研究,近几年对荧光蛋白光学性质的结构基础越来越了解,尤其是对荧光蛋白生色机制已经基本清楚.荧光蛋白的三个生色团氨基酸经过成环氧化成熟后形成一个平面共轭结构... 随着荧光蛋白(fluorescent protein)被不断改进和广泛运用于生物科学的研究,近几年对荧光蛋白光学性质的结构基础越来越了解,尤其是对荧光蛋白生色机制已经基本清楚.荧光蛋白的三个生色团氨基酸经过成环氧化成熟后形成一个平面共轭结构,电子的迁跃产生荧光.基于荧光蛋白的双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)由于其操作简单、对环境条件要求不高等特点而在生物学中被广泛应用,并在功能和用途上得到较大提高.这里对荧光蛋白发光性质的结构基础及在BiFC应用方面的研究进展进行了综述. 展开更多

关键词 荧光蛋白 发光机制 构象变化 双分子荧光互补技术

原文传递

玉米AGPasebt2与GPN1蛋白互作的双分子荧光互补技术研究 被引量：1

11

作者 崔喜艳 赵吉元 +3 位作者 胡广宇 窦瑶 刘相国 韩四平 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2015年第6期99-104,共6页

【目的】解析玉米淀粉合成限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase-bt2)与糖酵解关键酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPN1)在植物体内是否存在相互作用。【方法】首先克隆获得AGPase-bt2和GPN1基因,然后采用双分子荧光互补技术(BiFC),构建326-CYCHA-... 【目的】解析玉米淀粉合成限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase-bt2)与糖酵解关键酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPN1)在植物体内是否存在相互作用。【方法】首先克隆获得AGPase-bt2和GPN1基因,然后采用双分子荧光互补技术(BiFC),构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-GPN1双分子荧光表达载体,转化农杆菌EHA105,并用2种载体共同瞬时侵染烟草叶肉细胞,48h后在激光共聚焦显微镜下观察AGPase-bt2与GPN1的相互作用。【结果】AGPase-bt2基因长1 428bp,GPN1基因长1 497bp。双酶切鉴定结果表明,326-CYCHA-AGPasebt2、326-CYNEE-GPN1载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;携带有共转化基因的烟草叶肉细胞在激光共聚焦显微镜下观察到明显的黄色荧光现象,且黄色荧光与叶绿体自发的红色荧光位置重合。【结论】AGPase-bt2与GPN1在植物细胞中真实地存在蛋白互作。 展开更多

关键词 AGPasebt2 GPN1 双分子荧光互补技术 蛋白质互作

下载PDF 职称材料

HIV-1整合酶C末端及N末端结构域共结合多肽候选药物的筛选

12

作者 叶丽颖 彭臻菲 《中华细胞与干细胞杂志（电子版）》 2022年第5期257-265,共9页

目的利用双分子荧光互补技术筛选人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)的整合酶(IN)C末端结构域(CTD)及N末端结构域(NTD)多肽类药物。方法构建用于双分子荧光互补技术筛选的HIV-1整合酶CTD及NTD结构域的重组质粒pBiFc-VN173-Flag-IN-CTD及pBiFc-VN1... 目的利用双分子荧光互补技术筛选人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)的整合酶(IN)C末端结构域(CTD)及N末端结构域(NTD)多肽类药物。方法构建用于双分子荧光互补技术筛选的HIV-1整合酶CTD及NTD结构域的重组质粒pBiFc-VN173-Flag-IN-CTD及pBiFc-VN173-Flag-IN-NTD,并进行限制性内切酶酶切及测序鉴定。将重组质粒pBiFc-VN173-Flag-IN-CTD、pBiFc-VN173-Flag-IN-NTD及对照质粒pBiFC-VN173-Flag分别转染HEK293T细胞,使用蛋白免疫印迹法和Flag抗体检测2种重组质粒的表达。将3组质粒分别与多肽药物表达文库pBiFc-VC155-TrxA-11AA-TrxA共转染HEK293T细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光强度。将筛选到的多肽表达载体pcDNA-cmyc-11AA及对照pcDNA-cmyc分别转染HEK293T细胞,24 h后再用表达绿色荧光蛋白的慢病毒感染,36 h后观察绿色荧光强度。多组间比较用单因素方差分析,多个组与同一对照组比较采用Dunnett-t检验。结果经酶切及测序结果确认,重组质粒pBiFc-VN173-Flag-IN-CTD及pBiFc-VN173-Flag-IN-NTD构建成功,用Flag抗体可检测到两种质粒表达的重组蛋白。多肽文库中peptide 4和peptide 192与重组质粒分别共转染HEK293T细胞后,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光的出现。经慢病毒感染后,与对照比较,转染多肽表达载体pcDNA-cmyc-peptide4和pcDNA-cmyc-peptide192的HEK293T细胞中荧光细胞数[(78.33±5.81)、(29.33±2.96)比(350.30±8.67)个]减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论用于双分子荧光互补技术筛选的HIV-1整合酶CTD及NTD表达载体构建成功,并筛选获得靶向2个结构域的多肽peptide 4和peptide 192,其可能通过和整合酶的结合而抑制慢病毒的整合。 展开更多

关键词 HIV-1整合酶 NTD CTD 多肽类药物 双分子荧光互补技术

原文传递

3种探究蛋白质互作实验技术简介

13

作者 姚亭秀 《生物学通报》 2016年第5期45-49,共5页

蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的主要组成部分之一。目前实验室常采用酵母双杂交技术、双分子荧光互补技术和免疫共沉淀技术研究蛋白质与蛋白质的相互作用情况。从实验技术的原理、基本步骤及其优劣性对上述3种经... 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的主要组成部分之一。目前实验室常采用酵母双杂交技术、双分子荧光互补技术和免疫共沉淀技术研究蛋白质与蛋白质的相互作用情况。从实验技术的原理、基本步骤及其优劣性对上述3种经典且常用的筛选技术进行介绍。 展开更多

关键词 蛋白质互作 酵母双杂交技术 双分子荧光互补技术 免疫共沉淀技术

下载PDF 职称材料

玉米质体型AGPase小亚基和糖酵解关键酶PPDK1互作关系的研究

14

作者 崔喜艳 王阔 +4 位作者 张继晓 鹿丹 范贝 尹悦佳 刘相国 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2014年第7期47-52,60,共7页

【目的】利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在烟草叶肉细胞中分析玉米ADP-葡萄糖焦磷酸化酶质体型小亚基(AGPase-bt2)与丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)之间的相互作用。【方法】构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-PPDK1双分子荧光表达载体,转... 【目的】利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在烟草叶肉细胞中分析玉米ADP-葡萄糖焦磷酸化酶质体型小亚基(AGPase-bt2)与丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)之间的相互作用。【方法】构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-PPDK1双分子荧光表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶肉细胞,激光共聚焦显微镜下观察AGPase-bt2和PPDK1的相互作用。【结果】双酶切试验表明,326-CYCHA-AGPase-bt2、326-CYNEE-PPDK1载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;浸染烟草叶片后,AGPase-bt2和PPDK1在叶肉细胞中高效表达,出现BiFC荧光信号。【结论】AGPase-bt2和PPDK1在植物细胞内存在真实互作关系。 展开更多

关键词 AGPase-bt2 PPDK1 双分子荧光互补技术 蛋白质互作

下载PDF 职称材料

酿酒酵母转运蛋白Agp1p泛素化对氮源利用的影响

15

作者 李应宇 吕永坤 +2 位作者 周景文 堵国成 陈坚 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期570-578,共9页

【目的】研究酿酒酵母细胞膜关键氮源转运蛋白Agp1p的泛素化对其氮源利用的影响。【方法】构建一个基于双分子荧光互补技术的泛素化检测载体,检测Agp1p是否受到泛素化。采取定点突变的方法对Agp1p中可能的泛素化位点进行突变,研究其泛... 【目的】研究酿酒酵母细胞膜关键氮源转运蛋白Agp1p的泛素化对其氮源利用的影响。【方法】构建一个基于双分子荧光互补技术的泛素化检测载体,检测Agp1p是否受到泛素化。采取定点突变的方法对Agp1p中可能的泛素化位点进行突变,研究其泛素化的关键作用位点及其对酿酒酵母氮源利用的影响。【结果】在谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸及铵盐为唯一氮源的培养基中,转运蛋白Agp1p均受到泛素化调控。定点突变实验结果显示,与出发菌株相比,潜在泛素化位点突变后,菌体荧光强度均有一定程度减弱。其中四重突变体Agp1pK11,14,98,112R荧光强度最弱,表明泛素化过程被显著抑制。系列突变菌株在9种氨基酸为复合氮源以及尿素为单一氮源的发酵实验表明,四重突变体菌体氮源利用率提高效果显著。【结论】转运蛋白Agp1p的泛素化受到不同氮源的影响,泛素化位点突变可以显著影响其泛素化过程,从而改变细胞对氮源的利用过程。 展开更多

关键词 酿酒酵母 泛素化 透性酶 双分子荧光互补技术 运转蛋白Agp1p

原文传递

双分子荧光互补技术(BiFC)分析玉米SSⅠ与PPDK1之间的蛋白互作 被引量：5

16

作者 崔喜艳 张继晓 +3 位作者 窦瑶 孙小杰 尹悦佳 刘相国 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2013年第7期49-53,59,共6页

【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达... 【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶片组织,激光共聚焦显微镜下观察SSⅠ和PPDK1相互作用产生的荧光信号。【结果】双酶切试验鉴定表明,326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1重组载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;双分子荧光互补试验中,可观测到SSⅠ和PP-DK1相互结合而产生的黄色荧光信号。【结论】证实SSⅠ和PPDK1能够在植物活体细胞内发生真实的蛋白互作。 展开更多

关键词 SSⅠ PPDK1 双分子荧光互补技术(BiFC) 瞬时转化 蛋白质互作

下载PDF 职称材料

Split-GFP双分子荧光互补技术在鸡MSTN基因RNAi检测中的应用

17

作者 杨磊 朱正 +4 位作者 王博永 梁谦学 吴文德 李恭贺 郑喜邦 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期2444-2453,共10页

【目的】以Split-GFP双荧光互补技术检测鸡肌肉生长抑制素基因(MSTN)RNA干涉(RNAi)效果,并与其他常用检测方法比较,以验证Split-GFP双分子荧光互补技术在RNAi效果评估中的有效性和可行性。【方法】将合成的3个shRNA慢病毒载体(shRNA-a、... 【目的】以Split-GFP双荧光互补技术检测鸡肌肉生长抑制素基因(MSTN)RNA干涉(RNAi)效果,并与其他常用检测方法比较,以验证Split-GFP双分子荧光互补技术在RNAi效果评估中的有效性和可行性。【方法】将合成的3个shRNA慢病毒载体(shRNA-a、shRNA-b和shRNA-c)分别转染稳定表达GFP11-MSTN融合蛋白的HEK 293TGFP11-MSTN细胞,经实时荧光定量PCR筛选出最佳shRNA慢病毒载体并包装为慢病毒,然后以慢病毒感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞,采用潮霉素B筛选mCherry阳性(mCherry+)细胞,再以实时荧光定量PCR和Western blotting检测RNAi效果;得到的mCherry+细胞再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒,通过荧光显微镜观察和流式细胞术评估RNAi效果。【结果】3个shRNA慢病毒载体对MSTN基因表达均有极显著的抑制作用(P<0.01,下同),其中又以Anti-MSTN shRNA-a慢病毒载体的干涉效果最佳。Anti-MSTN shRNA-a慢病毒感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞的最适MOI=3,该条件下MSTN基因相对表达量及GFP11-MSTN融合蛋白表达量均受到抑制;得到的mCherry+细胞再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒,荧光显微镜观察和流式细胞术检测结果表明,GFP+细胞数量明显减少,GFP+细胞百分率由31.1%降至11.5%。Split-GFP检测结果与实时荧光定量PCR及Western blotting检测结果相符,说明Anti-MSTN shRNA-a慢病毒能有效抑制GFP11-MSTN融合蛋白表达,发挥了RNAi作用。【结论】以Anti-MSTN shRNA-a慢病毒对MSTN基因的干涉效果最佳,其感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞后MSTN基因表达极显著下调,且再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒后细胞中的GFP+细胞百分率明显下降,与实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果相符,证实Slipt-GFP双分子荧光互补技术是一种可靠的可视化RNAi检测方法。 展开更多

关键词 肌肉生长抑制素(MSTN) RNA干涉(RNAi) shRNA 慢病毒 Split-GFP双分子荧光互补技术

下载PDF 职称材料