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DEK蛋白的真核表达纯化及其活性检测 被引量：1
1
作者 郭海红 杨辛 +1 位作者 郭芳 胡红刚 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期1-9,共9页
利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达DEK蛋白并进行纯化。首先以pFastBacI质粒构建重组质粒pFastBacI-DEK,转化DH10Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid-DEK,通过脂质体介导转染Sf9细胞产生具有强感染力的重组杆状病毒AcNPV-DEK。用此... 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达DEK蛋白并进行纯化。首先以pFastBacI质粒构建重组质粒pFastBacI-DEK,转化DH10Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid-DEK,通过脂质体介导转染Sf9细胞产生具有强感染力的重组杆状病毒AcNPV-DEK。用此重组杆状病毒AcNPV-DEK感染Sf9细胞表达His-DEK融合蛋白。在非变性条件下,利用Ni-NTA agarose对表达的His-DEK融合蛋白进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting分析,在50 kDa处出现特异性蛋白条带并证实其为His-DEK融合蛋白。凝胶迁移阻滞实验表明,融合蛋白His-DEK与DNA的结合具有结构特异性,其与超螺旋型DNA结合活性强于与线性化DNA的结合活性。真核表达并纯化的融合蛋白His-DEK与DNA的结合活性要明显强于原核表达的融合蛋白His-CDB。DEK蛋白的磷酸化修饰会阻碍其与DNA的结合,而Sf9细胞中表达的融合蛋白His-DEK存在磷酸化修饰,将His-DEK去磷酸化后,其与DNA的结合活性有所提高。 展开更多
关键词 DEK蛋白 杆状病毒表达系统 凝胶迁移阻滞
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小麦WPBF与高分子量谷蛋白基因上游Prolamin-Like box的特异结合 被引量：4
2
作者 卫晓彬 王亚楠 +3 位作者 张超 单丽伟 唐如春 范三红 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期7-15,共9页
【目的】克隆普通小麦胚乳特异表达转录因子基因WPBF,对其原核表达条件进行优化,并验证其编码蛋白和小麦高分子量谷蛋白亚基基因(HMW-GS)上游Prolamin-Like box的结合特性,为小麦HMW-GS表达调控机制的阐明奠定基础。【方法】利用RT-PCR... 【目的】克隆普通小麦胚乳特异表达转录因子基因WPBF,对其原核表达条件进行优化,并验证其编码蛋白和小麦高分子量谷蛋白亚基基因(HMW-GS)上游Prolamin-Like box的结合特性,为小麦HMW-GS表达调控机制的阐明奠定基础。【方法】利用RT-PCR扩增得到WPBF编码区,将其连接到pET-21a-MBP载体中,并分别在E.coliT7 Express和Origami B(DE3)菌株中诱导表达。依次利用Amylose和Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,最后通过凝胶迁移阻滞试验(EMSA)对重组蛋白的DNA结合特性进行分析。【结果】在33℃的Origami B(DE3)菌株中表达含MBP和His双标签的重组WPBF大部分以可溶性形式存在,其表达量占细菌总蛋白的48.0%。重组WPBF和含HMW-GS上游Prolamin-Like box的两类DNA探针能发生特异结合,但重组WPBF和含"TGCAAAG"基序DNA探针的结合强度高于其和含"TGCAAG"基序DNA探针的结合。【结论】建立了优化的WPBF原核表达系统,并获得具有生物活性的重组蛋白;重组WPBF能与HMW-GS启动子来源的两种Prolamin-Like box特异性结合,但结合能力存在差异。 展开更多
关键词 小麦 WPBF 表达纯化 HMW-GS Prolamin—Like BOX 凝胶迁移阻滞试验
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圆锥小麦ramosa2的克隆及其重组蛋白的DNA结合特性分析 被引量：2
3
作者 唐如春 杨宇衡 +1 位作者 范三红 郭蔼光 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期439-446,共8页
【目的】从四倍体圆锥小麦中克隆ramosa2(TtRa2),分析其序列特征、组织表达特异性和体外活性,为阐明ramosa2与麦类作物穗形态建成关系奠定基础。【方法】利用半定量RT-PCR分析ramosa2在不同组织中的表达水平,将其重组到pET-21a-MBP载体... 【目的】从四倍体圆锥小麦中克隆ramosa2(TtRa2),分析其序列特征、组织表达特异性和体外活性,为阐明ramosa2与麦类作物穗形态建成关系奠定基础。【方法】利用半定量RT-PCR分析ramosa2在不同组织中的表达水平,将其重组到pET-21a-MBP载体并在T7 Express菌株中诱导表达。利用Amylose亲和层析柱纯化重组蛋白,通过凝胶阻滞试验对其DNA特异结合能力进行鉴定。【结果】TtRA2含有LOB和RA2结构域,属于Ⅰ类LBD蛋白家族成员。TtRa2在幼穗中高丰度表达,而在根、茎、叶、种子中未检测到表达。融合的TtRA2主要以可溶性形式存在,其表达量占总蛋白的68.6%。重组TtRA2可与包含核心序列"GCGGCG"的DNA探针特异性结合,两者形成的复合体的解离常数约为10 nmol.L-1。【结论】TtRa2参与圆锥小麦穗形态建成,其编码产物具备RA2-like转录因子的典型特征,具有类似拟南芥LOB的DNA结合特性。 展开更多
关键词 圆锥小麦 ramosa2 原核表达 LOB结构域 凝胶迁移阻滞分析
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凝胶迁移阻滞法分析人类端粒酶的DNA结合特性 被引量：1
4
作者 周俊宜 周俊梅 +5 位作者 谢金卫 周世豪 杜贻鹏 谢奇峰 陶莎 罗超权 《中国老年学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期582-584,共3页
目的采用凝胶迁移阻滞法分析研究人类端粒酶DNA结合特性。方法以地高辛标记的人端粒序列寡核苷酸与人端粒酶提取物进行结合反应,以未参与结合反应的单纯标记寡核苷酸作为参照。实验所设的3组样品中,第一组和第二组标记寡核苷酸加端粒酶... 目的采用凝胶迁移阻滞法分析研究人类端粒酶DNA结合特性。方法以地高辛标记的人端粒序列寡核苷酸与人端粒酶提取物进行结合反应,以未参与结合反应的单纯标记寡核苷酸作为参照。实验所设的3组样品中,第一组和第二组标记寡核苷酸加端粒酶,第一组显示一条阻滞性条带,第二组显示两条条带,前方的一条与第一组条带平行,为单纯探针条带,后方的一条迁移率被阻滞,应为探针与纯化的蛋白复合体相结合的结果;第三组为标记寡核苷酸加端粒酶阴性洗涤液,只显示单一探针条带。结果只有人端粒序列寡核苷酸与人端粒酶提取物结合反应管显示特异的凝胶迁移阻滞性电泳条带。结论人端粒酶具有和端粒DNA片段结合的特性。 展开更多
关键词 端粒酶 凝胶迁移阻滞法 DNA结合特性
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马尾松毛虫质多角体病毒NS5蛋白的表达和功能初步分析 被引量：2
5
作者 张万菊 赵淑玲 +5 位作者 张小霞 汤显春 肖宇宙 梅春蕾 孙修炼 彭辉银 《中国病毒学》 CSCD 2006年第4期401-404,共4页
马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株第9个片段编码非结构蛋白NS5,利用pET-32a(+)载体带有组氨酸标记的重组蛋白进行表达,获得纯化的重组蛋白。利用凝胶电泳阻滞检测试验(EMSA)检测蛋白和核酸的结合作用,结果表明NS5蛋白能与病毒基因组dsRN... 马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株第9个片段编码非结构蛋白NS5,利用pET-32a(+)载体带有组氨酸标记的重组蛋白进行表达,获得纯化的重组蛋白。利用凝胶电泳阻滞检测试验(EMSA)检测蛋白和核酸的结合作用,结果表明NS5蛋白能与病毒基因组dsRNA结合。 展开更多
关键词 马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV) 原核表达 凝胶迁移阻滞试验(EMSA)
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