兔出血症病毒2型的分离鉴定与序列分析 被引量：25

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作者 魏后军 胡波 +5 位作者 范志宇 宋艳华 仇汝龙 陈萌萌 薛家宾 王芳 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第2期404-409,共6页

兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种具有高度传染性、急性致死性兔病。兔出血症病毒2型(RHDV2)引起的RHD主要在欧洲流行,病兔的死亡率高达90%,而用经典RHDV... 兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种具有高度传染性、急性致死性兔病。兔出血症病毒2型(RHDV2)引起的RHD主要在欧洲流行,病兔的死亡率高达90%,而用经典RHDV毒株制备的疫苗几乎不能预防家兔感染RHDV2,从而给世界养兔业造成了巨大的经济损失。2020年4月,中国四川省某兔场首次发生由疑似RHDV2引起的RHD,笔者所在实验室通过红细胞凝集试验(Hemagglutination,HA)、逆转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增、vp60基因序列分析和病毒复制试验,对采集的病死家兔肝脏样本进行病原鉴定。HA结果显示,部分病死家兔的肝脏样本不能引起血凝现象;RT-PCR结果显示,样品中出现了RHDV2的特异性条带。对新发现毒株cDNA的RT-PCR产物进一步分析发现,所扩增vp60基因核苷酸序列与经典RHDV vp60基因核苷酸序列的一致性为77.5%~80.1%,与RHDV2 vp60基因核苷酸序列的一致性为93.6%~96.1%,并且与RHDV2处于同一个进化分支。病毒复制试验结果显示,用病死家兔肝脏组织与磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)按1 g∶10 ml混合后制成的悬液分别人工感染5只非免疫25日龄未断奶仔兔和5只2月龄兔,在24~48 h全部死亡。基于以上试验结果,确定本研究新发现的RHDV毒株为RHDV2,并将其命名为SC2020,这是在中国首次发现RHDV2毒株,应引起高度重视。 展开更多

关键词 兔出血症 兔出血症病毒2型(rhdv2) VP60基因 鉴定 序列分析

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经典RHDV与RHDV2对家兔致病性和组织嗜性的比较研究

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作者 肖璐 于吉锋 +11 位作者 谢晶 曹冶 叶勇刚 李兴玉 吴学婧 毛从剑 潘梦 叶健强 林毅 魏勇 杨竣雁 康润敏 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第24期106-112,118,143,144,共10页

为了比较经典兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)对家兔的致病性与组织嗜性差异,试验将15只45~50日龄家兔随机分成3组,分别为经典RHDV攻毒组、RHDV2攻毒组和对照组,每组5只,经典RHDV攻毒组和RHDV2攻毒组每只家兔分别皮下注射含... 为了比较经典兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)对家兔的致病性与组织嗜性差异,试验将15只45~50日龄家兔随机分成3组,分别为经典RHDV攻毒组、RHDV2攻毒组和对照组,每组5只,经典RHDV攻毒组和RHDV2攻毒组每只家兔分别皮下注射含2×10^(8)copies/μL经典RHDV和RHDV2的病毒悬液1 mL,对照组每只家兔皮下注射PBS 1 mL,持续观察并记录每组的精神状态、体重变化、采食情况、运动状况和死亡情况,并于攻毒36 h后处死并剖检各组未死亡家兔。无菌采集各组肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、心脏、脑、胃、肠、蚓突、圆小囊进行石蜡切片制作、H.E.染色和组织病变观察。各组无菌多点位采集等量心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织,提取病毒RNA反转录成cDNA后采用实时荧光定量PCR方法检测各组织中病毒载量。结果表明:攻毒后第6~10小时,经典RHDV攻毒组和RHDV2攻毒组均表现为精神沉郁、厌食、静卧、嗜睡、反应迟钝、体重下降等临床症状。经典RHDV攻毒组于攻毒后第24~25小时死亡3只,死亡率为60%(3/5);RHDV2攻毒组于攻毒后第8~21小时全部死亡,死亡率达100%(5/5);对照组5只家兔均存活且无异常表现。剖检可见经典RHDV攻毒组和RHDV2攻毒组气管环状出血,且RHDV2攻毒组气管中出现大量泡沫;经典RHDV攻毒组和RHDV2攻毒组肝脏质脆、肿大、出血,肺脏严重出血,心脏有明显出血点,脾脏明显肿大,经典RHDV攻毒组的组织匀浆中仅检出经典RHDV,RHDV2攻毒组的组织匀浆中仅检出RHDV2。经典RHDV攻毒组和RHDV2攻毒组的组织切片中可见多组织器官变性、坏死、扩张或淤血,其中RHDV2攻毒组肝脏和脾脏的损伤程度大于经典RHDV攻毒组;而蚓突、圆小囊和脑部未见明显病理变化;对照组所有组织器官均未见明显病变与异常。经典RHDV攻毒组内脏病毒载量从高到低依次为肝脏、脾脏、肾脏、肺脏和心脏;RHDV2攻毒组内脏病 展开更多

关键词 兔瘟 兔出血症病毒(rhdv) 兔出血症病毒2型(rhdv2) 致病性 组织嗜性

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密码子优化的RHDV2双VP60基因重组杆状病毒构建及表达蛋白免疫原性分析

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作者 于吉锋 谢晶 +8 位作者 黄勇 肖璐 林毅 曹冶 叶勇刚 魏勇 吴学婧 李江凌 康润敏 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期668-677,共10页

[目的]试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。[方法]根据... [目的]试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。[方法]根据昆虫细胞的密码子偏好性优化合成RHDV2 VP60全基因,将双VP60基因插入真核载体pFastBacTMDual,转化携带Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,构建含双VP60基因的重组杆粒Bacmid-VP60-VP60,转染Sf9昆虫细胞,通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜对重组杆状病毒Bacmid-VP60-VP60进行表达验证;将优化策略制备的重组蛋白抗原与氢氧化铝佐剂按照9∶1比例制备VLP灭活疫苗,通过安全性检验、最小免疫剂量、免疫持续期等评估优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗的保护效果。[结果]试验成功构建重组杆粒Bacmid-VP60-VP60。Western blotting鉴定结果显示,重组杆状病毒转染Sf9细胞表达出大小约60 ku的RHDV2 VP60蛋白。IFA鉴定结果显示,感染重组杆状病毒的Sf9细胞产生了大量的黄绿色荧光,表明重组杆状病毒在Sf9细胞中大量表达VP60蛋白。透射电镜观察结果显示,VP60蛋白折叠成VLP,大小为40 nm左右,呈现球形结构,表面光滑。优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗对家兔具有良好的安全性和免疫原性,最小免疫剂量为0.5 mL/只,免疫持续期可达210 d以上。[结论]试验构建了含有密码子优化的双VP60基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中成功表达RHDV2 VP60蛋白,该蛋白制备的VLP疫苗对家兔具有良好的免疫原性。 展开更多

关键词 兔出血症病毒2型(rhdv2) 病毒样颗粒(VLP) 密码子偏好性 重组杆状病毒 免疫原性

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四川省兔出血症病毒2型流行病学调查及遗传变异分析 被引量：4

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作者 李丽 陈弟诗 +5 位作者 陈斌 张毅 邓飞 邵靓 周莉媛 任永军 《中国动物检疫》 CAS 2022年第5期42-48,共7页

为了解四川省兔出血症病毒2型(rabbit hemorrhagic disease virus type 2,RHDV2)的流行情况及分子遗传变异特征,采集全省范围内的7525份样品,其中发病兔场肝脏组织样品117份、环境拭子样品243份,受监测兔场血液样品3340份、环境拭子样品... 为了解四川省兔出血症病毒2型(rabbit hemorrhagic disease virus type 2,RHDV2)的流行情况及分子遗传变异特征,采集全省范围内的7525份样品,其中发病兔场肝脏组织样品117份、环境拭子样品243份,受监测兔场血液样品3340份、环境拭子样品3825份,采用商品化荧光RT-PCR试剂盒,对以上样品进行RHDV2检测;对筛选出的12份肝组织阳性样品进行RHDV2 VP60基因RT-PCR扩增、测序和遗传进化分析。结果显示:RHDV2流行无明显季节性,各养殖品系家兔均有RHDV2感染,哺乳仔兔、幼兔、怀孕哺乳母兔死亡率分别为25%~60%、18%~45%、9%~30%。发病兔场肝脏样品RHDV2阳性检出率为88.89%(104/117),环境样品为46.09%(112/243);受监测兔场全血样品RHDV2阳性检出率为25.99%(868/3340),环境样品为16.29%(623/3825)。12份阳性样品的RHDV2 VP60基因序列长度均为1740 bp,核苷酸序列同源性为98.4%~100%,在系统发生进化树上独成一簇;与国内外参照毒株的VP60基因序列核苷酸同源性为93.7%~100%,编码的氨基酸序列同源性为95.7%~99.8%。结果表明:RHDV2已开始在四川省流行,需要加强检疫,重视饲养管理工作;其VP60基因序列出现了一定程度的变异,但遗传演化相对稳定。本研究补充了国内RHDV2的分子流行病学信息,也为该病的相关防控研究和控制对策制定提供了参考。 展开更多

关键词 兔出血症病毒2型(rhdv2) 流行病学调查 遗传变异分析 四川省

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Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型VP60蛋白重组腺病毒的构建及鉴定 被引量：1

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作者 肖璐 于吉锋 +11 位作者 罗燕 谢晶 叶勇刚 吴学婧 毛从剑 李兴玉 曹冶 林毅 潘梦 叶健强 魏勇 康润敏 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期3336-3344,共9页

【目的】试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体,构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒,为RHDV2新型疫苗研究提供依据。【方法】修饰、合成带有Kozak序列的VP 60基因序列,将其与腺病毒穿梭质粒进... 【目的】试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体,构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒,为RHDV2新型疫苗研究提供依据。【方法】修饰、合成带有Kozak序列的VP 60基因序列,将其与腺病毒穿梭质粒进行重组,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,构建重组腺病毒穿梭质粒,并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定;采用Ad Max腺病毒包装系统,基于HEK293细胞进行穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的定点同源重组,构建重组腺病毒Ad5-RHDV2-VP60并感染HEK293细胞,通过RT-PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)对重组腺病毒进行表达验证;利用Reed-Muench方法测定重组腺病毒的病毒滴度。【结果】重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见2条大小分别为3895和1752 bp的条带,测序比对结果显示,其与GenBank中公布的相应序列相似性>99%,表明穿梭质粒构建成功。RT-PCR结果可见大小约为515 bp的特异性条带;Western blotting结果显示,大小约为60 ku的VP60蛋白特异性条带;IFA观察结果显示,感染重组腺病毒的HEK293细胞产生了绿色荧光,表明重组病毒能在HEK293细胞中表达VP60蛋白,且该蛋白具有良好的抗原性;病毒滴度测定结果显示,初代重组腺病毒的TCID_(50)为10^(5.5)/0.1 mL。【结论】本试验构建了含RHDV2 VP 60基因的重组腺病毒,并成功表达了RHDV2 VP60蛋白,为进一步研究开发RHDV2疫苗提供了病毒模型。 展开更多

关键词 兔瘟 兔出血症病毒2型(rhdv2) 重组腺病毒 HEK293细胞 KOZAK序列

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兔出血症病毒2型检测技术的研究进展

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作者 肖璐 邬旭龙 +3 位作者 王印 江地科 张鹏飞 杨蓉 《四川畜牧兽医》 2022年第8期40-43,共4页

本文针对近年来国内外兔出血症病毒2型(RHDV2)检测方法和诊断技术的研究进展进行综述,旨在为RHDV2的早诊、监测和预防提供技术参考。

关键词 兔出血症病毒2型(rhdv2) 检测方法 研究进展

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中国首例兔出血症病毒2型(RHDV2/b/GI.2)的鉴定及病理学观察 被引量：12

7

作者 肖璐 于吉锋 +11 位作者 林毅 周泷 郭志强 谢晶 岳建国 叶勇刚 曹冶 李兴玉 潘梦 叶健强 李敏 康润敏 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第1期348-355,共8页

本试验旨在鉴定四川金堂某兔场疑似兔出血症病毒2型(RHDV2)感染疫情的病原,并分析病兔的病理组织学变化。利用血凝试验和RT-PCR检测病死兔内脏组织中的病原,取病变组织制作病理切片,观察分析各组织的病理组织学变化,同时应用病兔肝脏悬... 本试验旨在鉴定四川金堂某兔场疑似兔出血症病毒2型(RHDV2)感染疫情的病原,并分析病兔的病理组织学变化。利用血凝试验和RT-PCR检测病死兔内脏组织中的病原,取病变组织制作病理切片,观察分析各组织的病理组织学变化,同时应用病兔肝脏悬液感染幼兔,分析该毒株的致病力。血凝试验结果显示,所采集病死兔肝脏样品能凝集人“O”型血红细胞;RT-PCR扩增及测序结果显示,多对引物均能从样品中扩增出RHDV2特异性条带;病理组织学观察结果显示,病兔多脏器严重出血、肿胀,淋巴细胞和中性粒细胞大量浸润,气管黏膜、肝脏、肺脏出血尤为严重;动物试验结果显示,该毒株毒力较强,含毒肝脏悬液能在24 h内迅速致死幼兔。本研究经临床诊断、核酸检测及测序证实了此次疫情确由RHDV2感染引起,动物试验和病理组织学观察表明该毒株毒力较强,可引发脏器严重出血,造成病兔急性死亡,RHDV2的出现提示病毒的跨境传播情况不容乐观,应引起更大的重视。 展开更多

关键词 兔瘟 兔出血症病毒2型(rhdv2/b/GI.2) 病理组织学 致病力

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兔出血症病毒经典毒株和变异毒株的RT-PCR鉴定 被引量：14

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作者 宋艳华 魏后军 +8 位作者 范志宇 左园园 胡波 仇汝龙 陈萌萌 李明勇 薛家宾 徐为中 王芳 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2016年第5期1117-1121,共5页

本研究旨在建立鉴别兔出血症病毒经典毒株(RHDV)和变异毒株(RHDV2)的RT-PCR检测方法。根据Gen Bank中经典RHDV和RHDV2的VP60基因序列,设计2对分别结合两种基因的特异性引物。利用2对引物,以人工合成RHDV2的VP60基因构建的p MD19-T-VP60-... 本研究旨在建立鉴别兔出血症病毒经典毒株(RHDV)和变异毒株(RHDV2)的RT-PCR检测方法。根据Gen Bank中经典RHDV和RHDV2的VP60基因序列,设计2对分别结合两种基因的特异性引物。利用2对引物,以人工合成RHDV2的VP60基因构建的p MD19-T-VP60-2和p MD19-T-VP60为模板,进行RT-PCR体系退火温度的优化,优化后的退火温度为58.2℃。对优化后的RT-PCR体系进行RHDV和RHDV2的敏感性试验、特异性试验,并用于检测RHDV人工感染样品和疑似临床样品,结果显示,该方法具有良好的特异性和敏感性,经典RHDV和RHDV2的检测限度分别为95拷贝和76拷贝的靶基因片段,且对支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌等病原以及重组质粒p MD19-T-EBHSV的检测结果均为阴性。RHDV人工感染的组织样品检出率为100%,15份临床样品中3份为经典RHDV阳性,其他均为经典RHDV及RHDV2阴性。该方法的建立能够实现快速、特异及敏感地检测RHDV和RHDV2,为监测RHDV变异株的流行情况提供技术支撑。 展开更多

关键词 兔出血症病毒经典毒株(rhdv) 兔出血症病毒变异毒株(rhdv2) RT-PCR鉴定

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兔出血症病毒YL株衣壳蛋白VP60基因在原核系统中的高效表达 被引量：3

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作者 李传山 任力刚 +2 位作者 李维英 杨增岐 郭蔼光 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2007年第11期24-28,共5页

为了在原核系统中高效表达兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60,应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL中克隆出了衣壳蛋白VP60基因并测序,结果显示,YL株VP60基因全长1740 bp,GC含量为55.3%,已在GenBank中注册(登录号为DQ530363),... 为了在原核系统中高效表达兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60,应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL中克隆出了衣壳蛋白VP60基因并测序,结果显示,YL株VP60基因全长1740 bp,GC含量为55.3%,已在GenBank中注册(登录号为DQ530363),VP60基因与中国RHDV最早期分离株WX84的VP60基因核苷酸序列同源性为93.0%,氨基酸序列同源性为95.8%。构建成功YL株VP60基因原核表达载体VP60-pET32a,转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。1 mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示,VP60融合蛋白分子质量约为75 ku,其表达量占总菌体蛋白的39.8%。Western blot检测结果表明,VP60融合蛋白可以和RHDV抗血清发生特异反应。本研究结果显示,兔出血症病毒在干旱半干旱条件下的遗传变异和免疫学特征无较大变化。 展开更多

关键词 兔出血症病毒(rhdv) 衣壳蛋白(VP60)基因 原核表达 WESTERN BLOT

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实验兔出血症病毒检测方法的建立与免疫效果调查 被引量：1

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作者 周文伟 刘月环 《中国比较医学杂志》 CAS 2010年第4期59-62,共4页

目的检测全省六个实验兔场的兔子所携带的兔出血症病毒(RHDV)情况,调查实验兔RHDV抗体水平,评价不同疫苗的免疫效果,比较HAI与ELISA两种方法的符合率。方法采用HAI、ELISA方法对1168份实验兔RHDV抗体进行了检测,并与RT-PCR方法的检测结... 目的检测全省六个实验兔场的兔子所携带的兔出血症病毒(RHDV)情况,调查实验兔RHDV抗体水平,评价不同疫苗的免疫效果,比较HAI与ELISA两种方法的符合率。方法采用HAI、ELISA方法对1168份实验兔RHDV抗体进行了检测,并与RT-PCR方法的检测结果进行对比分析。结果我省实验兔免疫情况较好,不同饲养场的实验兔免疫合格率虽有不同,但未发生疫情。通过比较发现ELISA法检测的抗体合格率明显高于HAI法。结论LISA、HAI和RT-PCR方法均适合实验兔RHDV的检测。 展开更多

关键词 兔出血症病毒(rhdv) 血凝抑制实验(HAI) 酶联免疫吸附实验(ELISA) 反转录聚合酶链式扩增(RT-PCR)

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兔肝细胞中与RHDV VP60 P2亚区相互作用蛋白质的筛选和初步鉴定 被引量：1

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作者 李腾 姜平 +6 位作者 王芳 宋艳华 胡波 范志宇 魏后军 仇汝龙 刘星 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期549-558,共10页

兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60P2亚区在病毒感染宿主细胞过程中可能起重要作用,为找寻RHDV靶细胞——兔肝细胞中与P2亚区相互作用的蛋白质,以原核表达的P2蛋白为诱饵蛋白质,通过免疫共沉淀试验(Co-IP)结合质谱分析筛选与之有相互作用... 兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60P2亚区在病毒感染宿主细胞过程中可能起重要作用,为找寻RHDV靶细胞——兔肝细胞中与P2亚区相互作用的蛋白质,以原核表达的P2蛋白为诱饵蛋白质,通过免疫共沉淀试验(Co-IP)结合质谱分析筛选与之有相互作用的肝细胞蛋白质。经分析选取层黏连蛋白受体(LamR)蛋白做进一步研究。提取兔肝细胞总RNA,反转录扩增LamR基因,将其插入pGEX-6p-1载体,经IPTG诱导表达,获得GST-LamR融合蛋白,并通过GST pull-down试验验证LamR蛋白与P2蛋白的结合。结果显示,以P2蛋白为诱饵蛋白质,免疫共沉淀试验结合质谱分析共筛选到26个与P2存在相互作用的肝细胞蛋白质,其中LamR蛋白是多种病毒的受体。通过原核表达系统表达了LamR蛋白,经pull-down试验验证了LamR蛋白与P2蛋白有直接的相互作用。本研究证实兔肝细胞LamR蛋白与RHDV VP60P2蛋白的相互作用,为深入研究RHDV的感染过程、揭示RHDV的致病机制提供了线索。 展开更多

关键词 兔出血症病毒(rhdv) VP60P2亚区 免疫共沉淀 层黏连蛋白受体(LamR)

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兔病毒性出血症检测方法的研究进展 被引量：1

12

作者 付强 肖跃强 +4 位作者 郭广君 王艳 苗立中 程立坤 沈志强 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第7期84-86,共3页

兔病毒性出血症(RHD)又称出血性败血症,俗称兔瘟,是由兔病毒性出血症病毒(RHDV)引起的一种发病急、死亡率高的传染病。为了更好地加强病毒的检测与防控,需要更精确、方便的检测方法以满足科研和基层的不同需要,文章对近年来RHDV检测方... 兔病毒性出血症(RHD)又称出血性败血症,俗称兔瘟,是由兔病毒性出血症病毒(RHDV)引起的一种发病急、死亡率高的传染病。为了更好地加强病毒的检测与防控,需要更精确、方便的检测方法以满足科研和基层的不同需要,文章对近年来RHDV检测方法的研究进展进行了综述,主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光定量PCR、环介导等温扩增技术(LAMP)和胶体金免疫层析(GICA)等,以期为RHDV的防控及诊断提供参考。 展开更多

关键词 病毒性出血症 兔病毒性出血症病毒(rhdv) 检测方法 酶联免疫吸附试验(ELISA) 荧光定量 环介导等温扩增技术(LAMP) 胶体金免疫层析(GICA)

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