目的:建立一种高效、特异的检测内镜活检胃组织石蜡包埋标本幽门螺杆菌(Hp)实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法。方法:针对Hp 23S核糖体核糖核酸(rRNA)基因设计特异度引物,建立SYBR Green qPCR反应体系,并验证该方法的特异度、灵敏...目的:建立一种高效、特异的检测内镜活检胃组织石蜡包埋标本幽门螺杆菌(Hp)实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法。方法:针对Hp 23S核糖体核糖核酸(rRNA)基因设计特异度引物,建立SYBR Green qPCR反应体系,并验证该方法的特异度、灵敏度和重复性。用该方法对20份内镜活检胃组织石蜡标本进行检测,同时作免疫组织化学染色分析。阳性扩增产物以Sanger测序法明确克拉霉素基因突变情况。结果:本研究qPCR方法具备良好特异度和灵敏度,最低可检测2.3×10^(2)copies·μL^(-1)的质粒脱氧核糖核酸(DNA)。标准曲线表明其具有良好线性关系,直线方程为y=–3.6106x+44.626,R2为0.9879>0.98。不同浓度标准品的批内变异系数为0.20%~2.19%,批间变异系数为1.24%~2.63%,均<3%,表明该方法的稳定性和重复性良好。针对20份疑似感染Hp的内镜活检胃黏膜组织石蜡标本,该方法检出Hp阳性样品14份,阳性检出率为70%,免疫组织化学染色方法检出Hp阳性样品15份,阳性检出率为75%,二者的符合率为93.33%。阳性扩增产物经Sanger测序法测序显示均为Hp 23S rRNA基因片段,且14例样品中有5例存在克拉霉素耐药基因突变。结论:本研究建立的SYBR Green qPCR方法的特异度、灵敏度和重复性良好,后续阳性扩增产物的测序结果可明确克拉霉素耐药基因突变情况,适用于临床Hp感染和克拉霉素耐药性的检测。展开更多
文摘目的:建立一种高效、特异的检测内镜活检胃组织石蜡包埋标本幽门螺杆菌(Hp)实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法。方法:针对Hp 23S核糖体核糖核酸(rRNA)基因设计特异度引物,建立SYBR Green qPCR反应体系,并验证该方法的特异度、灵敏度和重复性。用该方法对20份内镜活检胃组织石蜡标本进行检测,同时作免疫组织化学染色分析。阳性扩增产物以Sanger测序法明确克拉霉素基因突变情况。结果:本研究qPCR方法具备良好特异度和灵敏度,最低可检测2.3×10^(2)copies·μL^(-1)的质粒脱氧核糖核酸(DNA)。标准曲线表明其具有良好线性关系,直线方程为y=–3.6106x+44.626,R2为0.9879>0.98。不同浓度标准品的批内变异系数为0.20%~2.19%,批间变异系数为1.24%~2.63%,均<3%,表明该方法的稳定性和重复性良好。针对20份疑似感染Hp的内镜活检胃黏膜组织石蜡标本,该方法检出Hp阳性样品14份,阳性检出率为70%,免疫组织化学染色方法检出Hp阳性样品15份,阳性检出率为75%,二者的符合率为93.33%。阳性扩增产物经Sanger测序法测序显示均为Hp 23S rRNA基因片段,且14例样品中有5例存在克拉霉素耐药基因突变。结论:本研究建立的SYBR Green qPCR方法的特异度、灵敏度和重复性良好,后续阳性扩增产物的测序结果可明确克拉霉素耐药基因突变情况,适用于临床Hp感染和克拉霉素耐药性的检测。
