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罗氏沼虾野田村病毒中国株RT-LAMP-LFD快速检测方法的研究 被引量：1
1
作者 林锋 刘莉 +4 位作者 郝贵杰 曹铮 盛鹏程 吴颖蕾 沈锦玉 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期502-507,共6页
罗氏沼虾白尾病(White tail disease,WTD)是流行于罗氏沼虾苗种阶段的重要疾病,该病病原被确定为罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirus,MrNV),为了建立罗氏沼虾野田村病毒中国分离株(MrNV-chin)的便捷、灵敏、特异... 罗氏沼虾白尾病(White tail disease,WTD)是流行于罗氏沼虾苗种阶段的重要疾病,该病病原被确定为罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirus,MrNV),为了建立罗氏沼虾野田村病毒中国分离株(MrNV-chin)的便捷、灵敏、特异的分子诊断方法,本研究根据罗氏沼虾野田村病毒RNA2基因保守序列的6个区域设计了4条特异性引物和1条检测探针,将环介导等温扩增技术与侧向流层析试纸(Lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立了MrNV的RT-LAMP-LFD检测方法。结果表明,该方法的灵敏度是常规琼脂糖凝胶电泳的10倍;从核酸提取到检测结果判定仅需45min;反应特异性强,对其他虾类病毒WSSV、IHHNV、IMNV、TSV和YHV扩增结果均为阴性;操作简单,不需要复杂的仪器,在61℃水浴反应即可;利用LFD试纸显示结果,肉眼可直接观察判定。作为一种快速灵敏实用的分子诊断技术,该方法有利于罗氏沼虾白尾病的诊断与预防。 展开更多
关键词 罗氏沼虾野田村病毒 环介导等温扩增技术 侧向流层析试纸
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基于微流控芯片的核酸检测技术 被引量：9
2
作者 姚梦迪 吕雪飞 邓玉林 《生命科学仪器》 2017年第4期22-28,共7页
核酸检测,作为一种分子诊断技术,包括核酸提取、扩增和检测,对微生物分析、医学诊断、及时就医等起着根本性的作用。目前核酸检测存在工作量大、成本高、而且耗时长等问题,显著影响了其在诊断中的应用。微流控芯片技术以及侧向流层析试... 核酸检测,作为一种分子诊断技术,包括核酸提取、扩增和检测,对微生物分析、医学诊断、及时就医等起着根本性的作用。目前核酸检测存在工作量大、成本高、而且耗时长等问题,显著影响了其在诊断中的应用。微流控芯片技术以及侧向流层析试纸条,具有制作成本低、设备小型化、分析速度快、灵敏度高等特点,且结果可传送给最终用户,在医疗诊断中具有巨大的发展潜力。鉴于前人的相关研究成果,本文首先介绍了微流控技术在核酸检测中的意义,其次介绍了以微流控芯片为平台的核酸提取技术、扩增技术,以及核酸检测技术,在文章最后展望了将核酸的提取、扩增、检测技术集成到一个微装置中的可行性。 展开更多
关键词 核酸提取 核酸扩增 核酸检测 侧向流层析试纸条 微流控芯片
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柑橘黄化脉明病毒RT-RPA检测方法的建立 被引量：5
3
作者 马志敏 许建建 +6 位作者 段玉 王春庆 苏越 张琦 宾羽 周常勇 宋震 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第15期3241-3249,共9页
【目的】利用逆转录重组酶聚合酶扩增技术(reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA),结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条,建立一种快速简便、特异、灵敏、裸眼可视的柑橘黄化脉明病毒(citrus... 【目的】利用逆转录重组酶聚合酶扩增技术(reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA),结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条,建立一种快速简便、特异、灵敏、裸眼可视的柑橘黄化脉明病毒(citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)检测新方法。【方法】根据CYVCV外壳蛋白基因的保守序列设计5对引物,通过样品检测筛选出扩增效果好、特异性强的引物对。将选出的引物进行标记物修饰,并设计对应的特异性探针,分别设置6个反应时间梯度(5、10、20、30、40、50 min)和8个反应温度梯度(37、38、39、40、41、42、43、44℃),对RT-RPA反应条件进行优化,建立CYVCV的RT-RPA检测体系。分别以仅感染了CYVCV、柑橘叶斑驳病毒(citrus leaf blotch virus,CLBV)、柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)、柑橘碎叶病毒(citrus tatter leaf virus,CTLV)、柑橘裂皮病类病毒(citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘鳞皮病毒(citrus psorosis virus,CPV)、温州蜜柑萎缩病毒(satsuma dwarf virus,SDV)、柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)和柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)柑橘材料的总核酸为模板,采用所筛选的最佳引物、探针和反应条件进行检测,评价所建立RT-RPA检测体系的特异性。将感染了CYVCV的柑橘总RNA样品进行10倍梯度稀释,以原液和10~(-1)、10~(-2)、10~(-3)、10~(-4)、10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)稀释液作为模板,平行进行RT-PCR及RT-RPA的检测,评价所建立检测方法的灵敏度。随机采集来自田间9个不同品种柑橘的叶片,同时进行RT-RPA和RT-PCR检测,检验所建立RT-RPA检测方法的适用性。【结果】建立了CYVCV的RT-RPA检测体系:最佳引物为CY1-F/R,对应探针为CY1-Probe(47 bp),最佳反应条件为39℃,30 min,特异扩增目的片段为177 bp,检测结果可通过侧向流层析试纸条直接判读。特异性检测结果显示,利用该检测体系仅对感染了CYVCV的样品检测� 展开更多
关键词 柑橘 柑橘黄化脉明病毒 RT-RPA 侧向流层析试纸条 快速检测
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向日葵黑茎病菌RPA/CRISPR-Cas12a快速检测方法的建立 被引量：4
4
作者 邝瑞瑞 雷荣 +6 位作者 江丽 段维军 李雪莲 符娜 范在丰 李远 吴品珊 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期69-76,89,共9页
向日葵黑茎病菌是向日葵上的一种毁灭性真菌,是我国的植物检疫性有害生物。为了准确快速检测向日葵黑茎病菌,本研究根据向日葵黑茎病菌及其近似种的ITS序列差异,设计特异性RPA引物和CRISPR-Cas12a crRNA,建立了RPA等温扩增技术结合CRISP... 向日葵黑茎病菌是向日葵上的一种毁灭性真菌,是我国的植物检疫性有害生物。为了准确快速检测向日葵黑茎病菌,本研究根据向日葵黑茎病菌及其近似种的ITS序列差异,设计特异性RPA引物和CRISPR-Cas12a crRNA,建立了RPA等温扩增技术结合CRISPR-Cas12a检测的快速检测方法。通过条件优化,RPA/CRISPR-Cas12a检测体系在37℃恒温条件下,RPA反应30 min,CRISPR/Cas12a反应20 min,即可特异性检测向日葵黑茎病菌。荧光法检测灵敏度与实时荧光PCR的灵敏度相当,最低检测量为0.1 pg,试纸条法检测最低检测量为1 pg。由于试纸条检测结果可用肉眼观察,快速便携,操作简单,更适合用于田间和口岸的向日葵黑茎病菌快速早期检测;而荧光检测灵敏度高,对环境要求高,更适合用于实验室检测。 展开更多
关键词 向日葵黑茎病菌 RPA CRISPR-Cas12a 荧光检测 侧向流层析试纸条
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猫杯状病毒RAA-CRISPR/Cas12a-LFS检测方法的建立及初步应用 被引量：3
5
作者 周红蕾 程淑琴 +3 位作者 李佳鹏 刘涵 卓国荣 张蕾 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期494-501,共8页
为建立猫杯状病毒(FCV)基于重组酶介导的等温核酸扩增(RAA)结合CRISPR-Cas12a系统及侧向流层析试纸条(LFS)(RAA-CRISPR/Cas12a-LFS)的快速检测的方法,本研究基于FCV衣壳蛋白(VP1)基因序列保守区设计RAA引物、4对针对VP1靶标的扩增引物、... 为建立猫杯状病毒(FCV)基于重组酶介导的等温核酸扩增(RAA)结合CRISPR-Cas12a系统及侧向流层析试纸条(LFS)(RAA-CRISPR/Cas12a-LFS)的快速检测的方法,本研究基于FCV衣壳蛋白(VP1)基因序列保守区设计RAA引物、4对针对VP1靶标的扩增引物、4对VP1-cr RNA扩增引物和1条报告探针。利用4对VP1-crRNA扩增引物经退火和T7 RNA聚合酶转录合成4条靶标crRNA:VP1-1/2/3/4-crRNA,利用4对VP1靶标扩增引物经退火合成4条靶标双链DNA:VP1-1/2/3/4,经EnGen Lba Cas12a (Cpf1)核酸酶试剂的切割反应和Cas12a试纸条检测,根据出现条带的强弱筛选最佳VP1-crRNA。结果显示,VP1-2-crRNA对应的T线条带最强且C线不完全切割的条带最弱。因此选择VP1-2-crRNA进行后续试验。分别以FCV VR-782株及6株分离的FCV RNA为模板,利用RAA引物扩增其VP1基因,并通过琼脂糖凝胶电泳检测并评估RAA引物的扩增效果;利用Cas12a (Cpf1)核酸酶,以上述RAA扩增的VP1基因(来自FCV VR-782株RNA)为模板,在37℃恒温水浴30 min进行CRISPR/Cas12a-LFS检测,评估RAA产物、Cas12a、VP1-2-crRNA和ss DNA报告基团对CRISPR/Cas12a-LFS检测体系的重要性。RAA扩增效果的评估结果显示,从FCV VR-782株及6株分离的FCV RNA中均扩增到282 bp的VP1基因目的条带。重要性评估结果显示,只有上述4种试剂全部存在时CRISPR/Cas12a-LFS检测体系才能有效扩增。利用该方法检测FCV、猫疱疹病毒I型、支气管败血波氏菌、猫细小病毒、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、F81细胞,结果显示,该方法仅能够特异性检测FCV,而其他病原的检测结果 均为阴性,且分别在42℃30 min内和37℃40 min内完成对FCV的RAA扩增及CRISPR/Cas12a-LFS检测;利用该方法检测10倍倍比稀释的重组质粒标准品p MD18T-FCV-VP1以评估其敏感性,结果显示,该方法的检测限为37.5拷贝/μL,与本研究室建立的Taq Man荧光定量PCR方法的敏感性相当;分别利用同一批次和3批次配置的RAA-CRISPR/C 展开更多
关键词 猫杯状病毒 CRISPR-Cas12a系统 侧向流层析试纸条 现场检测
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鳗鲡疱疹病毒基础RPA及RPA-LFD检测方法的比较
6
作者 林而舒 《渔业研究》 2024年第4期367-374,共8页
【目的】鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)是鳗鲡“脱黏败血综合征”的主要病原,对鳗鲡养殖产业造成了严重的经济损失。为达到早期预警和防止病毒扩增蔓延的目的,建立一套AngHV快速检测技术对中国鳗鲡养殖疾病防控具有重要意... 【目的】鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)是鳗鲡“脱黏败血综合征”的主要病原,对鳗鲡养殖产业造成了严重的经济损失。为达到早期预警和防止病毒扩增蔓延的目的,建立一套AngHV快速检测技术对中国鳗鲡养殖疾病防控具有重要意义。【方法】本研究根据AngHV ORF55设计了扩增引物和探针,建立了基于重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)的基础RPA及RPA侧向流层析试纸条法(RPA-LFD)检测方法,探究了不同时间和温度对基础RPA和RPA-LFD扩增效果的影响,并比较了2种方法的灵敏度、特异性和临床应用效果。【结果】本研究建立的AngHV基础RPA及RPA-LFD快速检测方法扩增产物大小为394 bp;2种检测方法都仅需20~40 min即可完成检测过程;温度的变化对检测方法的影响不大,37~43℃范围内均能得到较好的扩增效果;2种检测方法均与鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus)和鲤疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus)无交叉反应,表现出良好的特异性;RPA-LFD检测方法具有更高的检测灵敏度,检出限至1.32×10^(0)copies/mL,基础RPA检出限至1.32×10^(3)copies/mL;检测实验室保存的20份鳗鲡病料DNA,2种方法检测的结果一致,阳性率均为30%,表明AngHV基础RPA和RPALFD检测方法均具有良好的临床应用潜力。【结论】AngHV基础RPA和RPA-LFD检测方法十分适用于基层科研单位、鳗鲡产品加工场及养殖场的病毒检测,丰富了AngHV检测手段的可选性。 展开更多
关键词 鳗鲡 鳗鲡疱疹病毒(AngHV) 重组酶聚合酶等温扩增(RPA) 重组酶聚合酶等温扩增-侧向流层析试纸条法(RPA-LFD)
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猪霍乱沙门菌RPA-LFS快速检测方法的建立 被引量：2
7
作者 周红蕾 钱俞佳 刘静 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期456-460,共5页
为建立一种快速、准确的猪霍乱沙门菌现场检测方法,针对猪霍乱沙门菌侵袭蛋白A(Invasion protein A,invA)基因序列设计特异性引物和探针,优化反应条件,建立重组酶聚合酶等温扩增结合侧向流层析试纸条(RPA-LFS)检测方法。结果表明:建立... 为建立一种快速、准确的猪霍乱沙门菌现场检测方法,针对猪霍乱沙门菌侵袭蛋白A(Invasion protein A,invA)基因序列设计特异性引物和探针,优化反应条件,建立重组酶聚合酶等温扩增结合侧向流层析试纸条(RPA-LFS)检测方法。结果表明:建立的方法在39℃等温条件下15 min内即可特异性检出猪霍乱沙门菌,与金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌无交叉反应,该方法对猪霍乱沙门菌的最低检出限为1 CFU/反应;应用该方法对50份猪肉样本进行检测,与PCR方法检测结果一致。建立的猪霍乱沙门菌现场RPA-LFS检测方法敏感性高、特异性强、反应快速、操作简便的特点,可应用于猪霍乱沙门菌的临床快速检测。 展开更多
关键词 猪 霍乱沙门菌 侵袭蛋白A 重组酶聚合酶等温扩增 侧向流层析试纸条
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基于RAA-CRISPR的新型冠状病毒变异位点快速检测方法的建立
8
作者 牛梦伟 李浩 +4 位作者 杨兰 董雪 韩尧 夏雪山 孙岩松 《军事医学》 CAS CSCD 2023年第3期161-168,共8页
目的利用逆转录酶重组酶介导的等温扩增(RT-RAA)与成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR核酸检测技术结合,并基于“消线法”CRISPR试纸,建立一种针对新型冠状病毒基因变异位点的现场快速检测方法。方法通过对新型冠状病毒基因组HV69-7... 目的利用逆转录酶重组酶介导的等温扩增(RT-RAA)与成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR核酸检测技术结合,并基于“消线法”CRISPR试纸,建立一种针对新型冠状病毒基因变异位点的现场快速检测方法。方法通过对新型冠状病毒基因组HV69-70del变异位点的序列分析,设计并筛选可高效扩增该变异位点的RT-RAA引物,以及可特异性识别HV69-70del变异位点的crRNA。利用RT-RAA等温扩增技术对目标核酸进行扩增,通过CRISPR-Cas13a系统对扩增产物进行检测并用ERASE试纸进行结果判读。结果该法可特异性区分含有HV69-70del变异位点与未突变的新型冠状病毒核酸,同时在不依赖荧光检测设备的情况下,可在1 h内检出含量为1拷贝/μl的新型冠状病毒HV69-70del变异位点,且与其他7种病原体核酸无交叉反应。结论基于RT-RAA恒温扩增技术以及“消线法”CRISPR检测试纸建立了一种不依赖荧光检测设备的新型冠状病毒变异位点快速检测方法——RAA-CRISPR,为新型冠状病毒变异株的快速检测与鉴定提供了新方法。 展开更多
关键词 逆转录酶重组酶介导的等温扩增 成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas13a 侧向流免疫层析试纸 新型冠状病毒变异株 HV69-70del变异位点
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