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题名LbCpf1基因的原核表达、纯化与体外切割检测
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作者
吕一凡
李更东
薛楠
吕国梁
时邵辉
王春生
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机构
东北林业大学生命科学学院
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出处
《中国生物工程杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2020年第8期41-48,共8页
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基金
黑龙江省大学生创新创业训练计划(201910225232)
黑龙江省自然科学基金(C2016012)资助项目。
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文摘
目的:为获得具有体外切割活性的LbCpf1蛋白。方法:将毛螺菌科细菌ND2006(Lachnospiraceae bacterium ND2006)的LbCpf1基因编码区连接至pHis*6(IV),构建原核表达质粒CRISPR-LbCpf1-6*His。将该重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导目的蛋白表达,经镍柱亲和层析纯化、透析除盐和凝胶电泳检测等步骤获得重组蛋白,进行体外切割试验鉴定重组蛋白切割活性。结果:双酶切鉴定和测序结果表明成功构建重组质粒CRISPR-LbCpf1-6*His,经转化后获得含有重组质粒CRISPR-LbCpf1-6*His的BL21(DE3)蛋白表达菌株。将菌株接种于37℃,160 r/min,IPTG终浓度为0.5 mmol/L的条件下诱导5 h,最终镍柱纯化除盐后的LbCpf1蛋白终浓度可达400 ng/μl,在体外适宜条件下,该重组蛋白可与成熟的crRNA结合切断标靶DNA。结论:获得的高纯度LbCpf1蛋白具有体外切割活性,可用于后续基因编辑研究。
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关键词
LbCpf1蛋白
原核表达
镍柱纯化
体外切割检测
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Keywords
LbCpf1
Prokaryotic expression
Nickel column purification
In vitro cleavage activity assay
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分类号
Q78
[生物学—分子生物学]
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