抗人TNF-α单抗基因的克隆及鉴定 被引量：3

1

作者 骆训懿 王琰 +1 位作者 王欲晓 王卓智 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1999年第2期166-168,共3页

目的克隆抗人ＴＮＦ－α鼠单抗得可变区基因以构建人－鼠嵌合抗体表达载体。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，以前导肽序列的引物从１个分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链、重链可变区基因（Ｖκ，ＶＨ），在大肠杆菌中... 目的克隆抗人ＴＮＦ－α鼠单抗得可变区基因以构建人－鼠嵌合抗体表达载体。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，以前导肽序列的引物从１个分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链、重链可变区基因（Ｖκ，ＶＨ），在大肠杆菌中表达Ｆａｂ段核实其功能活性。结果分别得到了２个Ｖκ和２个ＶＨ基因。ＤＮＡ序列测定表明，其中１个轻链可变区基因为骨髓瘤细胞系中固有的无功能基因。１个重链可变区基因经原核系统表达测活表明无抗体活性。另一个轻链和重链可变区基因的成熟蛋白编码部分与从第一骨架区引物所克隆的、可在大肠杆菌表达出抗体活性的Ｖκ、ＶＨ序列相符。将该轻链、重链基因分别克隆到了人－鼠嵌合轻链、重链表达载体中。结论通过原核表达系统核实。 展开更多

关键词 人tnf-α 基因 单克隆抗体 鉴定

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抗人肿瘤坏死因子-α单链抗体与其配体的相互作用 被引量：1

2

作者 陈萍 邓健蓓 +2 位作者 韩骅 药立波 苏成芝 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 2000年第4期430-433,共4页

为了在大肠杆菌中表达纯化抗人 TNF- α单链抗体并检测其结合活性与中和活性 .利用GST融合蛋白系统在大肠杆菌中表达抗人 TNF- α单链抗体 E6Sc Fv;分离包含体后进行变性和复性 ,再用亲和层析法进行纯化 ;用 ELISA法和酵母双杂交系统检... 为了在大肠杆菌中表达纯化抗人 TNF- α单链抗体并检测其结合活性与中和活性 .利用GST融合蛋白系统在大肠杆菌中表达抗人 TNF- α单链抗体 E6Sc Fv;分离包含体后进行变性和复性 ,再用亲和层析法进行纯化 ;用 ELISA法和酵母双杂交系统检测 E6Sc Fv与配体的结合 ;用 L92 9细胞检测 E6Sc Fv对人 TNF- α细胞毒作用的中和活性 .经变性 ,复性与亲和层析 ,E6Sc Fv被纯化 ,在 SDS- PAGE上为单一蛋白带 ;体外结合与中和实验表明 ,表达纯化的 E6Sc Fv可与人 TNF-α结合并中和其细胞毒活性 ;进一步用酵母双杂交系统证明当表达于细胞内时 ,E6Sc Fv仍保持了与TNF-α相结合的能力 . 展开更多

关键词 人tnf-α 单链抗体 酵母双杂交 E6ScFV 胞内抗体

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小鼠抗人TNF-α Fab基因的定点突变及其在大肠杆菌中的表达 被引量：1

3

作者 张巍 沈倍奋 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期338-340,共3页

目的 :对小鼠抗人TNF αFab基因进行人源化改造 ,并获得人源化Fab段的可溶性表达产物。方法 :应用一步反向PCR法 ,分别对小鼠VH、VL 基因进行定点突变。将突变基因克隆入载体pComb3H并诱导表达。结果 :成功地将鼠抗VH88位Ser突变为Ala ,... 目的 :对小鼠抗人TNF αFab基因进行人源化改造 ,并获得人源化Fab段的可溶性表达产物。方法 :应用一步反向PCR法 ,分别对小鼠VH、VL 基因进行定点突变。将突变基因克隆入载体pComb3H并诱导表达。结果 :成功地将鼠抗VH88位Ser突变为Ala ,VL17位Glu和 18位Lys分别突变为Asp和Arg。成功地构建了人源化Fab的可溶性表达质粒 ,并用Western blot检测到其在上清液中有表达。结论 :得到人源化Fab的可溶性表达产物 。 展开更多

关键词 人tnf—α 单克隆抗体 定点突变 基因表达

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用一种新型的PCR方法快速制备人TNF-α缺失突变体 被引量：5

4

作者 张巍 沈倍奋 +2 位作者 黎燕 郭宁 冯健男 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期600-604,共5页

人肿瘤坏死因子 α(hTNF α)的 2个Loop区 2 9～ 36、141～ 146是受体的主要结合部位 .应用一种新型的PCR方法 ,快速制备了这 2个Loop区的缺失突变体 ,并对其活性进行了研究 .结果表明 :这种新型的PCR方法在制备缺失突变体中具有快速... 人肿瘤坏死因子 α(hTNF α)的 2个Loop区 2 9～ 36、141～ 146是受体的主要结合部位 .应用一种新型的PCR方法 ,快速制备了这 2个Loop区的缺失突变体 ,并对其活性进行了研究 .结果表明 :这种新型的PCR方法在制备缺失突变体中具有快速、简便、经济等优点 ,值得推广 ;缺失蛋白对L92 9细胞的毒性作用明显降低 ,表明这 2个区域为hTNF 展开更多

关键词 PCR方法 快速制备 人tnf-α缺失突变体

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抗人TNF-α单克隆抗体液质联用肽图分析方法的建立及验证 被引量：4

5

作者 桂芳 杨兰兰 +2 位作者 潘勇兵 张雅婷 张银川 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期51-63,共13页

目的:建立液相色谱-质谱联用肽图分析方法用于抗人肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)单抗的专属性鉴别。方法:TNF-α单抗样品经盐酸胍变性、还原,释放出的游离半胱氨酸残基进行烷化,还原剂中和过量的烷化剂。超滤置... 目的:建立液相色谱-质谱联用肽图分析方法用于抗人肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)单抗的专属性鉴别。方法:TNF-α单抗样品经盐酸胍变性、还原,释放出的游离半胱氨酸残基进行烷化,还原剂中和过量的烷化剂。超滤置换酶切缓冲液后进行胰酶酶切并终止。色谱条件:采用Waters UPLC BEH 300 C_(18)(2.1 mm×150mm,1.7μm)色谱柱,以0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)为流动相,梯度洗脱(5-120 min,2%B→45%B),流速为0.2 mL·min^(-1),检测波长为214 nm;质谱条件:采用电喷雾离子源及正离子模式,数据采集范围m/z为100~1990。结果:TNF-α单抗重链及轻链的6个互补决定区(CDR)对应肽段由质谱鉴定出,HC CDR2及HC CDR3在色谱峰图中共流出;利妥昔单抗用于评估本方法的专属性,结果显示本方法专属性强,且不受基质的干扰;选定m/z 1 344(M^(+5))的色谱峰为参考峰,根据CDR的相对保留时间考察该方法的变异程度,5次重复测定CDR相对保留时间的RSD在0.57%~1.19%之间;中间精密度考察测定的相对保留时间的RSD在0.00%~1.08%之间;胰酶酶切比例在20:1~30:1,酶切时间在17~23h范围内变化时,相对保留时间的均较小,符合方法耐用性的要求;样品消化后在8℃储存24h以及-20℃储存5d的稳定性良好。结论:基于CDR相关肽段鉴别的液质联用肽图分析方法可定性鉴定出TNF-α单抗,方法学验证结果显示该方法适用于抗人TNF-α单抗的专属性鉴别,可用于其质量控制及批检验放行。 展开更多

关键词 单克隆抗体 肿瘤坏死因子α(tnf-α) 抗人tnf-α单抗 液质联用 肽图分析 互补决定区(CDR) 鉴别试验 方法学验证

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噬菌体展示技术构建重组人TNF-α单链抗体库 被引量：2

6

作者 柴蔚然 杨涛 +1 位作者 胡晓年 牛勃 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期155-158,共4页

目的应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)的单链抗体库。方法利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经免疫BALB/c小鼠淋巴细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库。由L in... 目的应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)的单链抗体库。方法利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经免疫BALB/c小鼠淋巴细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库。由L inker-prim erm ix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体。再用RS prim erm ix以单链抗体为模板进行第二次聚合酶链反应,从而获得全套抗rhTNF-α的单链抗体基因。以SfiⅠ/NotⅠ,位点定向插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,转化大肠杆菌TG1后,经M13KO7辅助噬菌体拯救,构建成全套抗rhTNF-α单链抗体表面展示文库。结果成功构建了rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库。经M13KO7超感染后,噬斑计数滴度为2.1×1011pfu。结论rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建,为研究rhTNF-α抗体结合位点,了解其结构与功能的关系以及研究用于临床免疫治疗的新型抗体打下了基础。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子-α 单链抗体 噬菌体展示技术 重组人tnf-α单链抗体库

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依那西普治疗斑块状银屑病随机对照试验的系统评价 被引量：1

7

作者 陈声利 闫军 +2 位作者 刘毅 徐秀莲 孙建方 《中华皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期180-181,共2页

近年开发的生物制剂依那西普（Etanercept）是一种重组人TNF-α与IgG Fc段形成的融合蛋白，通过竞争性抑制TNF-α与细胞表面受体的结合而拮抗内源性TNF-α的作用。2004年美国FDA批准依那西普用于治疗成人中、重度斑块状银屑病。本文对... 近年开发的生物制剂依那西普（Etanercept）是一种重组人TNF-α与IgG Fc段形成的融合蛋白，通过竞争性抑制TNF-α与细胞表面受体的结合而拮抗内源性TNF-α的作用。2004年美国FDA批准依那西普用于治疗成人中、重度斑块状银屑病。本文对依那西普治疗斑块状银屑病的疗效和不良作用进行了系统评价，以期为临床医生和卫生决策者提供更多可靠信息。 展开更多

关键词 斑块状银屑病 依那西普 随机对照试验 治疗 系统 重组人tnf-α 内源性tnf-α 细胞表面受体

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抗人TNF-α单克隆抗体对银屑病患者血清TNF-α的中和研究

8

作者 冯峥 王建平 +2 位作者 葛萍 李恒进 黎燕 《军医进修学院学报》 CAS 北大核心 2005年第3期225-227,共3页

目的:研究抗人TNF-α单克隆抗体对寻常型银屑病患者血清TNF-α的中和效应。方法:应用双抗体夹心ELISA方法检测正常人及患者血清应用单克隆抗体中和前后TNF-α的浓度改变。应用L929细胞检测正常人和患者血清抗体中和前后的生物学活性变... 目的:研究抗人TNF-α单克隆抗体对寻常型银屑病患者血清TNF-α的中和效应。方法:应用双抗体夹心ELISA方法检测正常人及患者血清应用单克隆抗体中和前后TNF-α的浓度改变。应用L929细胞检测正常人和患者血清抗体中和前后的生物学活性变化情况。结果:正常人与银屑病患者血清TNF-α的浓度分别为:(3.146±6.184)pg/ml及(62.723±38.379)pg/ml;其生物学活性分别为:(6.817±5.086)%及(57.498±9.125)%。抗体中和后患者血清TNF-α的浓度为:(0.503±1.178)pg/ml;中和后的生物学活性为:(25.378±14.863)%。结论:寻常型银屑病患者血清中TNF-α的浓度及生物学活性均高于正常对照,而抗人TNF-α单克隆抗体在体外可以很好地中和患者血清中TNFα的浓度及其生物学活性。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子 抗人tnf-α 单克隆抗体 中和试验 银屑病 血清tnf-α 血清抗体

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rhTNF-α对TB-LCL趋化作用的研究

9

作者 闵密克 马超武 +2 位作者 徐建中 孙浩 金伯泉 《临床军医杂志》 CAS 2006年第1期4-7,共4页

目的研究重组人TNF-α(recomb inant hum an tumor necrosis factor-,αrhTNF-α)对扁桃体B原淋巴细胞(tonsil B lymphob lastoid cellline,TB-LCL)的趋化作用,建立一个模型以研究细胞因子与B细胞相互间的作用。方法用EB病毒(Epste in-B... 目的研究重组人TNF-α(recomb inant hum an tumor necrosis factor-,αrhTNF-α)对扁桃体B原淋巴细胞(tonsil B lymphob lastoid cellline,TB-LCL)的趋化作用,建立一个模型以研究细胞因子与B细胞相互间的作用。方法用EB病毒(Epste in-Bar virus,EBV)转化扁桃体B细胞建立TB-LCL系,以小室法研究rhTNF-α)对TB-LCL的趋化作用。结果rhTNF-α对TB-LCL有明显趋化作用,并呈剂量依赖关系。这种作用能为抗TNF-α的单抗E6所阻断。结论以上为研究细胞与细胞因子间的相互作用提供了有用而简便的模型。 展开更多

关键词 重组人tnf-α 扁桃体B原淋巴细胞 趋化

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注射用人源化抗人TNF-α单克隆抗体在中国健康成年志愿者中抗药性抗体的产生对其药代动力学行为的影响

10

作者 张坦 祖丽安 +14 位作者 谢新遥 韩敏 王茜 吴全睿 习娜娜 臧彦楠 陈适 王梅 汪进 陶涛 廖庆平 郑青山 栗占国 宋海峰 方翼 《中国临床药理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期385-388,共4页

目的研究人源化抗人TNF-α单克隆抗体在中国健康成年志愿者中单次皮下注射后,产生的抗药性抗体(ADA)对其药代动力学的影响。方法 60例健康志愿者分为6个递增剂量组,每组依次单次腹部皮下注射人源化抗人TNF-α单克隆抗体5,15,30,50,75或1... 目的研究人源化抗人TNF-α单克隆抗体在中国健康成年志愿者中单次皮下注射后,产生的抗药性抗体(ADA)对其药代动力学的影响。方法 60例健康志愿者分为6个递增剂量组,每组依次单次腹部皮下注射人源化抗人TNF-α单克隆抗体5,15,30,50,75或100 mg,测定给药前、给药后第4,12,24,36,48,60,72,96,120,144,168,216,264,312,360,408,456,504,576和672 h的血药浓度,以及给药前、给药后168、360、504和672 h的ADA。结果 5～100 mg剂量组ADA阳性率分别为100%,100%,100%,80%,90%和70%,总体阳性率高达90%。检出ADA后,ADA+者的血药浓度迅速下降,其平均血药浓度均低于ADA-者,差异均有统计学意义(均P <0. 05)。ADA+者半衰期(t_(1/2))显著低于ADA-者,75～100 mg组ADA+者的清除率(CL)高于ADA-者。结论注射用人源化抗人TNF-α单克隆抗体的ADA阳性率较高,血药浓度、t_(1/2)的降低,CL的升高可能与ADA的产生有关。 展开更多

关键词 人源化抗人tnf-α单克隆抗体 抗药性抗体 药代动力学

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TNF-α、IL-6基因多态性在HCV相关肝病中的分布特征

11

作者 邢培祥 王传新 +2 位作者 王立水 王洪春 邢全台 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期217-217,共1页

本研究对中国汉族人TNF-α、IL-6血清水平及其基因单核苷酸多态性（SNP）与HCV相关肝病的关系进行了探讨。

关键词 人tnf-α 基因多态性 IL-6 HCV 肝病 单核苷酸多态性 中国汉族 血清水平

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一项针对重度持续性哮喘患者使用TNF-α阻断剂的随机双盲安慰剂对照研究

12

作者 张静（摘译） 《中华医学信息导报》 2009年第10期10-10,共1页

戈利木单抗（golimumab）是针对人TNF-α的单克隆抗体，其在重症哮喘中的治疗价值尚不明确。为了评价golimumab对于重度持续性哮喘患者的安全性及有效性，美国匹兹堡大学的Wenzel SE等人对此进行了研究，

关键词 人tnf-α 哮喘患者 持续性 安慰剂对照 随机双盲 阻断剂 项针 单克隆抗体

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重组人抗TNFα单抗制品中CHO宿主细胞蛋白质残留夹心ELISA检测方法的建立及验证 被引量：3

13

作者 邓春平 梅雄 +2 位作者 陈航 何水华 刘翠华 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2020年第8期925-928,933,共5页

目的建立检测重组人抗TNFα单抗制品中CHO宿主细胞蛋白质(host cell protein,HCP)残留的夹心ELISA法,并进行验证。方法采用二维电泳-Western blot(2D-Western blot)法筛选兔抗CHO HCP多克隆抗体(产品号:AB000103-A、AB000103-C)及羊抗CH... 目的建立检测重组人抗TNFα单抗制品中CHO宿主细胞蛋白质(host cell protein,HCP)残留的夹心ELISA法,并进行验证。方法采用二维电泳-Western blot(2D-Western blot)法筛选兔抗CHO HCP多克隆抗体(产品号:AB000103-A、AB000103-C)及羊抗CHO HCP多克隆抗体(批号:3G-0016-PA)中识别重组人抗TNFα单抗特异性CHO HCP覆盖率最高的一种作为检测抗体,建立检测样品中残余HCP的夹心ELISA法,并验证方法的线性、基质干扰、稀释线性、灵敏度、精密度及准确性。结果以覆盖率达57%的AB000103-C号兔抗CHO HCP多克隆抗体作为检测抗体;样品基质干扰HCP检测,样品需稀释6倍;HCP标准品浓度在3.33~810 ng/mL范围与A450值曲线拟合良好,R2=1,试验内及试验间精密性验证的CV均小于12%,检测限及定量限分别为2.4和20 ng/mL;20、150及300 ng/mL的加标样品回收率分别为99.5%、97.1%及100.3%。结论成功建立了重组人抗TNFα单抗HCP残留的夹心ELISA检测方法,该方法灵敏度高,准确性、精密性及线性良好,适用于重组人抗TNFα单抗制品的残留HCP检测。 展开更多

关键词 重组人抗tnfα单抗 CHO细胞 宿主细胞蛋白质 酶联免疫吸附测定

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重组的抗人TNFα基因工程抗体

14

《科技开发动态》 2002年第12期36-36,共1页

关键词 抗人tnfα 基因工程抗体 肿瘤 基因重组

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