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利用Gibson DNA组装技术构建人5型腺病毒感染性克隆
被引量：
4
1
作者
邹小辉
夏百成
+3 位作者
郭小娟
王敏
鲁茁壮
洪涛
《病毒学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第3期349-355,共7页
为了构建人5型腺病毒（HAdV-5）的感染性克隆,我们使用了Gibson DNA组装技术。设计1对引物用于扩增质粒骨架（包含卡那霉素抗性基因和质粒的复制起点,KAN-ORI）,在引物的5’端添加HAdV-5基因组末端序列（约30NT）和Pac I位点,以携带卡...
为了构建人5型腺病毒（HAdV-5）的感染性克隆,我们使用了Gibson DNA组装技术。设计1对引物用于扩增质粒骨架（包含卡那霉素抗性基因和质粒的复制起点,KAN-ORI）,在引物的5’端添加HAdV-5基因组末端序列（约30NT）和Pac I位点,以携带卡那霉素抗性基因的pShuttle-CMV质粒为模板,PCR扩增得到KAN-ORI片段,该片段的两端均含有约30bp的HAdV-5基因组序列。将KAN-ORI片段与利用野毒扩增纯化的HAdV-5基因组混合,进行Gibson DNA组装反应;反应产物直接转化E.coli感受态细胞,涂布含卡那霉素的LB琼脂平板。挑取菌落,提取质粒,命名为pKAd5。限制性酶切鉴定的结果显示,所鉴定的质粒均含有完整的HAdV-5基因组。使用Pac I酶切线性化pKAd5,利用脂质体转染293细胞,转染4d后单层细胞出现病毒噬斑。拯救的病毒能够在HEp-2细胞扩增;电子显微镜观察呈现典型的腺病毒形态;提取病毒DNA,酶切鉴定的结果与预期的HAdV-5基因组相同,证实HAdV-5得到成功拯救。上述研究结果说明使用Gibson DNA组装技术构建HAdV-5感染性克隆简便易行,为其他DNA病毒基因组的克隆提供了新思路。
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关键词
人
5
型
腺病毒
(
hadv
-
5
)
GIBSON
DNA组装
感染性克隆
病毒
拯救
透射电子显微镜
原文传递
纤维顶球改造增强了人5型腺病毒载体对造血细胞的感染
被引量：
2
2
作者
郭小娟
梅玲玲
+3 位作者
付鸿臣
邹小辉
鲁茁壮
洪涛
《病毒学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第5期1079-1088,共10页
基于人5型腺病毒(Human adenovirus type 5,HAdV⁃5)的腺病毒载体对造血细胞的基因转导效率低,将病毒fiber基因替换为HAdV⁃11p的同源基因F11p后,载体对造血细胞的感染效率增强。本研究拟在F11p纤维顶球(knob)结构域添加RGD4C多肽或HIV包...
基于人5型腺病毒(Human adenovirus type 5,HAdV⁃5)的腺病毒载体对造血细胞的基因转导效率低,将病毒fiber基因替换为HAdV⁃11p的同源基因F11p后,载体对造血细胞的感染效率增强。本研究拟在F11p纤维顶球(knob)结构域添加RGD4C多肽或HIV包膜糖蛋白(gp120)的V3结构域,观察重组HAdV⁃5对造血细胞感染效率的变化。在前期构建的pKAd5f11p153R⁃EPG腺病毒质粒基础上,结合限制性酶切和DNA组装技术,在F11p 153 aa后(knob AB loop,153位)、228位(FG loop)以及300位(IJ loop)插入RGD4C肽或者gp120的V3肽,构建了共6种重组腺病毒载体(F153RGD⁃EG、F228RGD⁃EG、F300RGD⁃EG、F153CV⁃EG、F228CV⁃EG和F300CV⁃EG),以fiber未改造的HAdV5⁃EG和改造为F11p的F11p⁃EG病毒作对照,观察了其对4种造血细胞系U937、K562、Jurkat和HL60以及人原代T细胞的感染效率。结果显示,对于U937细胞,当感染复数(MOI,vp/cell)为100时,HAdV5⁃EG感染效率最低,为2%;其次为F228CV⁃EG,感染率为45%;F300RGD⁃EG、F153CV⁃EG和F300CV⁃EG感染率为85%~90%;F153RGD⁃EG、F228RGD⁃EG高于阳性对照病毒F11p⁃EG,三者分别为99%、99%、95%。各病毒对于Jurkat细胞的感染率均较高,但HAdV5⁃EG明显低于F11p⁃EG、F153RGD⁃EG和F228RGD⁃EG,当MOI为100时分别为75%、93%、93%和96%。感染K562细胞的情况与U937细胞类似。各病毒对于HL60细胞感染效率最低,MOI为500时,F300RGD⁃EG和F300CV⁃EG的转导效率为28%和33%,是F11p⁃EG的10倍。对于人原代T细胞,F153RGD⁃EG和F228RGD⁃EG优于F11p⁃EG,当MOI为1000时,感染率分别为87%、90%和84%。研究结果表明,F11p knob插入RGD4C比单独F11p替换的HAdV⁃5对造血细胞的感染效率高,同时,本研究还发现HAdV⁃11p fiber knob的AB、FG或IJ loop可插入外源多肽,为腺病毒嗜向性改造增加了新靶点。
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关键词
人
5
型
腺病毒
(
hadv
⁃
5
)
纤维顶球
造血细胞
原文传递
题名
利用Gibson DNA组装技术构建人5型腺病毒感染性克隆
被引量：
4
1
作者
邹小辉
夏百成
郭小娟
王敏
鲁茁壮
洪涛
机构
中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所、传染病预防控制国家重点实验室
潍坊医学院公共卫生与管理学院
出处
《病毒学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第3期349-355,共7页
基金
国家自然科学基金(项目号:31400156),题目:人腺病毒E1B55K与E4orf6蛋白相互作用的型特异性研究及应用
国家重点研发计划(项目号:2017YFC1200503),题目:畜禽四大症候群病原鉴定技术体系与应急响应机制研究~~
文摘
为了构建人5型腺病毒（HAdV-5）的感染性克隆,我们使用了Gibson DNA组装技术。设计1对引物用于扩增质粒骨架（包含卡那霉素抗性基因和质粒的复制起点,KAN-ORI）,在引物的5’端添加HAdV-5基因组末端序列（约30NT）和Pac I位点,以携带卡那霉素抗性基因的pShuttle-CMV质粒为模板,PCR扩增得到KAN-ORI片段,该片段的两端均含有约30bp的HAdV-5基因组序列。将KAN-ORI片段与利用野毒扩增纯化的HAdV-5基因组混合,进行Gibson DNA组装反应;反应产物直接转化E.coli感受态细胞,涂布含卡那霉素的LB琼脂平板。挑取菌落,提取质粒,命名为pKAd5。限制性酶切鉴定的结果显示,所鉴定的质粒均含有完整的HAdV-5基因组。使用Pac I酶切线性化pKAd5,利用脂质体转染293细胞,转染4d后单层细胞出现病毒噬斑。拯救的病毒能够在HEp-2细胞扩增;电子显微镜观察呈现典型的腺病毒形态;提取病毒DNA,酶切鉴定的结果与预期的HAdV-5基因组相同,证实HAdV-5得到成功拯救。上述研究结果说明使用Gibson DNA组装技术构建HAdV-5感染性克隆简便易行,为其他DNA病毒基因组的克隆提供了新思路。
关键词
人
5
型
腺病毒
(
hadv
-
5
)
GIBSON
DNA组装
感染性克隆
病毒
拯救
透射电子显微镜
Keywords
Human adenovirus type
5
（
hadv
-
5
）
Gibson DNA assembly
Infectious clone
Virus rescue
Transmission electron microscope
分类号
R373.9 [医药卫生—病原生物学]
原文传递
题名
纤维顶球改造增强了人5型腺病毒载体对造血细胞的感染
被引量：
2
2
作者
郭小娟
梅玲玲
付鸿臣
邹小辉
鲁茁壮
洪涛
机构
中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
潍坊医学院公共卫生与管理学院
出处
《病毒学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第5期1079-1088,共10页
基金
国家科技重大专项(项目号:2018ZX10734404),题目:重要传染病病原标准化鉴定关键技术研究和参比库的建立。
文摘
基于人5型腺病毒(Human adenovirus type 5,HAdV⁃5)的腺病毒载体对造血细胞的基因转导效率低,将病毒fiber基因替换为HAdV⁃11p的同源基因F11p后,载体对造血细胞的感染效率增强。本研究拟在F11p纤维顶球(knob)结构域添加RGD4C多肽或HIV包膜糖蛋白(gp120)的V3结构域,观察重组HAdV⁃5对造血细胞感染效率的变化。在前期构建的pKAd5f11p153R⁃EPG腺病毒质粒基础上,结合限制性酶切和DNA组装技术,在F11p 153 aa后(knob AB loop,153位)、228位(FG loop)以及300位(IJ loop)插入RGD4C肽或者gp120的V3肽,构建了共6种重组腺病毒载体(F153RGD⁃EG、F228RGD⁃EG、F300RGD⁃EG、F153CV⁃EG、F228CV⁃EG和F300CV⁃EG),以fiber未改造的HAdV5⁃EG和改造为F11p的F11p⁃EG病毒作对照,观察了其对4种造血细胞系U937、K562、Jurkat和HL60以及人原代T细胞的感染效率。结果显示,对于U937细胞,当感染复数(MOI,vp/cell)为100时,HAdV5⁃EG感染效率最低,为2%;其次为F228CV⁃EG,感染率为45%;F300RGD⁃EG、F153CV⁃EG和F300CV⁃EG感染率为85%~90%;F153RGD⁃EG、F228RGD⁃EG高于阳性对照病毒F11p⁃EG,三者分别为99%、99%、95%。各病毒对于Jurkat细胞的感染率均较高,但HAdV5⁃EG明显低于F11p⁃EG、F153RGD⁃EG和F228RGD⁃EG,当MOI为100时分别为75%、93%、93%和96%。感染K562细胞的情况与U937细胞类似。各病毒对于HL60细胞感染效率最低,MOI为500时,F300RGD⁃EG和F300CV⁃EG的转导效率为28%和33%,是F11p⁃EG的10倍。对于人原代T细胞,F153RGD⁃EG和F228RGD⁃EG优于F11p⁃EG,当MOI为1000时,感染率分别为87%、90%和84%。研究结果表明,F11p knob插入RGD4C比单独F11p替换的HAdV⁃5对造血细胞的感染效率高,同时,本研究还发现HAdV⁃11p fiber knob的AB、FG或IJ loop可插入外源多肽,为腺病毒嗜向性改造增加了新靶点。
关键词
人
5
型
腺病毒
(
hadv
⁃
5
)
纤维顶球
造血细胞
Keywords
Human adenovirus type
5
(
hadv
⁃
5
)
Fiber knob domain
Hematopoietic cells
分类号
R373.9 [医药卫生—病原生物学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
利用Gibson DNA组装技术构建人5型腺病毒感染性克隆
邹小辉
夏百成
郭小娟
王敏
鲁茁壮
洪涛
《病毒学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018
4
原文传递
2
纤维顶球改造增强了人5型腺病毒载体对造血细胞的感染
郭小娟
梅玲玲
付鸿臣
邹小辉
鲁茁壮
洪涛
《病毒学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021
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