DL-丙氨酸生产工艺的研究进展 被引量：6

1

作者 蒋光玉 《精细与专用化学品》 CAS 2011年第7期25-28,共4页

简要介绍了DL-丙氨酸用途。详细阐述了化学合成法、发酵法、丙氨酸消旋酶法等几种不同的DL-丙氨酸生产工艺,并分析了各工艺的优缺点。指出了丙氨酸消旋酶法生产工艺是DL-丙氨酸发展的方向。

关键词 DL-丙氨酸 丙氨酸 丙氨酸消旋酶 生产工艺 用途

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巴西苏木素对MRSA丙氨酸消旋酶抑制作用的初步研究

2

作者 黎瑞 陈泽慧 +3 位作者 周小仙 余孟飞 杨智芳 李明哲 《遵义医科大学学报》 2024年第1期47-52,61,共7页

目的 探讨巴西苏木素(BN)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)丙氨酸消旋酶(Alr)的抑制作用。方法 PCR扩增MRSA丙氨酸消旋酶基因Alr,通过使用酶切和连接技术构建重组表达质粒pET-28a-Alr,然后将其转化至E.coil BL21(DE3)中,利用IPTG诱导表... 目的 探讨巴西苏木素(BN)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)丙氨酸消旋酶(Alr)的抑制作用。方法 PCR扩增MRSA丙氨酸消旋酶基因Alr,通过使用酶切和连接技术构建重组表达质粒pET-28a-Alr,然后将其转化至E.coil BL21(DE3)中,利用IPTG诱导表达Alr,并通过镍离子亲和层析法进行纯化;试验分为对照组MOCK(不作任何处理)、不同浓度BN组(8、16、32、64μg/mL),分别测定不同浓度BN对Alr活性的影响;通过细胞热位移分析(CETSA)实验测定BN对Alr蛋白热稳定性的影响;利用软件AutoDock Vina将BN与Alr进行分子对接,预测两者之间的结合模式。结果 成功诱导表达纯化Alr蛋白,且其具备将L-丙氨酸外消旋为D-丙氨酸的活性。与对照组相比,不同浓度的BN均能够抑制Alr的活性,其中在64μg/mL BN作用下,抑制率达到50%(P<0.0001)。CETSA实验结果显示,在55.9~59.5℃下BN处理后的Alr蛋白热稳定性明显高于Mock组(P<0.0001)。分子对接结果显示BN与Alr之间的结合能为-8.0 kcal/mol,与Alr活性位点内的Gly221、Phe169、Arg219、Ser204、Ile222和Tyr43形成氢键,与其活性位点通道的Ile352、Tyr354形成π-π键及疏水作用,与Asn203形成疏水作用。结论 BN对Alr的活性具有抑制作用,可能是因为BN与Alr蛋白活性位点处的结合能力相关。 展开更多

关键词 巴西苏木素 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 丙氨酸消旋酶 分子对接

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抗菌药物治疗疾病的新靶位--丙氨酸消旋酶 被引量：4

3

作者 刘晓琴 石亚伟 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期104-108,共5页

丙氨酸消旋酶是以磷酸吡哆醛为辅酶,催化L-丙氨酸与D-丙氨酸相互转化的一种酶,它广泛分布在低等生物,而不存在于人类等高等真核生物中.来自不同物种的丙氨酸消旋酶一级结构同源性较高,其大多功能单位为同源二聚体,拥有2个相同的活性中心... 丙氨酸消旋酶是以磷酸吡哆醛为辅酶,催化L-丙氨酸与D-丙氨酸相互转化的一种酶,它广泛分布在低等生物,而不存在于人类等高等真核生物中.来自不同物种的丙氨酸消旋酶一级结构同源性较高,其大多功能单位为同源二聚体,拥有2个相同的活性中心,每个活性中心均是由来自不同亚基的2个保守残基共同组成.丙氨酸消旋酶催化生成的产物D-丙氨酸是合成细菌细胞壁肽聚糖的重要成分,也是调节细菌孢子萌芽的关键因子.因而丙氨酸消旋酶与由细菌引起的肺结核、炭疽热、中耳炎等疾病密切相关.近年来丙氨酸消旋酶已成为设计抗菌药物的又一理想靶位.本文从丙氨酸消旋酶的结构、功能、作用机理、抑制剂以及其与疾病的关系等方面进行了阐述. 展开更多

关键词 丙氨酸消旋酶 结构 作用机理 功能 疾病

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变异链球菌丙氨酸消旋酶基因表达纯化及活性测定 被引量：4

4

作者 郭笑 邱伟 +2 位作者 周学东 程磊 李明云 《口腔医学研究》 CAS 北大核心 2018年第6期597-600,共4页

变异链球菌是口腔主要的龋病病原菌。丙氨酸消旋酶通过合成右旋丙氨酸(D-alanine,D-ala)参与细菌细胞壁肽聚糖的生物合成过程,与细菌性疾病密切相关,近年来成为抗菌药物的又一理想靶位。D-环丝氨酸(D-cycloserine,DCS)是丙氨酸消旋酶不... 变异链球菌是口腔主要的龋病病原菌。丙氨酸消旋酶通过合成右旋丙氨酸(D-alanine,D-ala)参与细菌细胞壁肽聚糖的生物合成过程,与细菌性疾病密切相关,近年来成为抗菌药物的又一理想靶位。D-环丝氨酸(D-cycloserine,DCS)是丙氨酸消旋酶不可逆性抑制剂。本研究通过聚合酶链反应克隆变异链球菌UA159的smu.1834c基因,经过酶切、连接,构建重组表达质粒pET-smu.1834c,诱导表达重组,纯化蛋白。测定DCS对丙氨酸消旋酶活性的抑制作用。成功诱导表达纯化smu.1834c基因编码蛋白,具有体外催化L-丙氨酸生成D-丙氨酸的活性。发现DCS能够抑制该蛋白的活性。本研究证实变异链球菌smu.1834c基因编码丙氨酸消旋酶。DCS能够抑制其活性,并且呈现一定的剂量相关性。 展开更多

关键词 变异链球菌 丙氨酸消旋酶 右旋丙氨酸 D-环丝氨酸

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腾冲嗜热厌氧菌丙氨酸消旋酶底物通道氨基酸位点的功能 被引量：4

5

作者 何广正 韩卿卿 +2 位作者 徐书景 赵宝华 鞠建松 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期1397-1406,共10页

【目的】通过定点突变探究腾冲嗜热厌氧菌MB4中生物合成型丙氨酸消旋酶Tt Alr底物通道内氨基酸位点A172和S173的功能。【方法】利用定点突变PCR技术构建突变体,通过亲和层析法纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性... 【目的】通过定点突变探究腾冲嗜热厌氧菌MB4中生物合成型丙氨酸消旋酶Tt Alr底物通道内氨基酸位点A172和S173的功能。【方法】利用定点突变PCR技术构建突变体,通过亲和层析法纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性及其稳定性。【结果】通过定点突变PCR成功得到8个突变体,酶学特性分析发现,A172位点突变为丝氨酸(S)后酶蛋白的相对活性有所提升,但含有该位点突变的酶蛋白稳定性均大幅下降;S173位点突变为天门冬氨酸(D)后导致突变体蛋白的最适反应温度提升了15°C,半衰期大幅延长,但相对活性明显下降。【结论】丙氨酸消旋酶Tt Alr底物通道内A172和S173位点均是影响酶蛋白催化活性和稳定性的关键位点。 展开更多

关键词 丙氨酸消旋酶 底物通道 保守氨基酸位点 定点突变 酶学特性

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丙氨酸消旋酶的研究进展 被引量：4

6

作者 邱伟 周学东 李明云 《国际口腔医学杂志》 CAS 北大核心 2016年第2期228-232,共5页

丙氨酸消旋酶(ALR)是以吡哆醛磷酸为辅酶,催化L-丙氨酸与D-丙氨酸相互转化的一类酶,广泛分布于低等生物,与由细菌引起的疾病密切相关。近年来ALR已成为设计抗菌药物的又一理想靶位。变异链球菌是口腔龋病主要致病菌,产酸耐酸、黏附能力... 丙氨酸消旋酶(ALR)是以吡哆醛磷酸为辅酶,催化L-丙氨酸与D-丙氨酸相互转化的一类酶,广泛分布于低等生物,与由细菌引起的疾病密切相关。近年来ALR已成为设计抗菌药物的又一理想靶位。变异链球菌是口腔龋病主要致病菌,产酸耐酸、黏附能力和合成细胞内外多糖能力是其主要的致龋毒力。本文对ALR的分类、结构特征、生理功能及实际应用等方面进行系统阐述,为进一步研究ALR与变异链球菌致病毒力的关系,发展龋病抗菌药物候选靶标提供理论基础。 展开更多

关键词 丙氨酸消旋酶 致龋毒力 生理功能

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食品级高产亮氨酸氨肽酶重组Bacillus subtilis的构建和发酵优化 被引量：4

7

作者 张大伟 刘德华 +1 位作者 黄钦钦 田亚平 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期1-6,共6页

为解决枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在发酵产亮氨酸氨肽酶(leucine aminopeptidase,LAP)需额外添加抗生素的问题,该研究构建了1株食品级产LAP重组B.subtilis。首先通过Cre/lox系统敲除B.subtilis 168基因组中D-丙氨酸消旋酶基因(dal... 为解决枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在发酵产亮氨酸氨肽酶(leucine aminopeptidase,LAP)需额外添加抗生素的问题,该研究构建了1株食品级产LAP重组B.subtilis。首先通过Cre/lox系统敲除B.subtilis 168基因组中D-丙氨酸消旋酶基因(dal)得到缺陷型菌株BS168(dal)^-。其次使用高斯组装的方法构建以dal作为标记基因的质粒pMA5-lap-dal(Amp^R,Ori)-并转化至BS168(dal)^-中得到食品级重组菌BS168(dal)-/p MA5-lap-dal(Amp^R,Ori)^-。该工程菌发酵产LAP无需添加抗生素且不含抗性基因。对该菌株进行5 L发酵罐条件优化,在转速300 r/min、温度33℃、p H 7.0、分阶段补料的条件下,酶活最高达到302 U/m L。结果表明,构建的食品级重组B.subtilis产LAP具有潜在的工业应用前景。 展开更多

关键词 亮氨酸氨肽酶 D-丙氨酸消旋酶 枯草芽孢杆菌 食品级表达 发酵优化

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生物合成D-丙氨酸研究进展 被引量：2

8

作者 陈哲 何广正 +1 位作者 徐书景 鞠建松 《河北师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2022年第1期76-83,共8页

D-丙氨酸不仅是细菌细胞壁肽聚糖结构中四肽尾的重要成分之一,在药物合成、食品添加剂、化妆品及农业等方面的应用也越来越广泛.由于自然界中并不存在游离形式的D-丙氨酸,因此,D-丙氨酸合成工艺的开发正受到广泛关注.介绍了不同的D-丙... D-丙氨酸不仅是细菌细胞壁肽聚糖结构中四肽尾的重要成分之一,在药物合成、食品添加剂、化妆品及农业等方面的应用也越来越广泛.由于自然界中并不存在游离形式的D-丙氨酸,因此,D-丙氨酸合成工艺的开发正受到广泛关注.介绍了不同的D-丙氨酸合成技术的优缺点,如化学合成法,微生物发酵法和酶法合成等,并展望了酶法合成D-丙氨酸的发展前景. 展开更多

关键词 D-丙氨酸 合成工艺 酶法合成 丙氨酸消旋酶

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丙氨酸消旋酶的研究进展 被引量：3

9

作者 张彩凤 徐书景 +4 位作者 李艳红 薛张伟 马宁 赵宝华 鞠建松 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2011年第15期8836-8839,共4页

简要介绍了丙氨酸消旋酶的分类、结构特征和催化机制。

关键词 丙氨酸消旋酶 催化机制 D-丙氨酸 5'-磷酸吡哆醛

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以丙氨酸消旋酶为靶点的高通量抗结核药物筛选模型的建立及应用 被引量：3

10

作者 周爽 蒙建洲 +3 位作者 关艳 胡辛欣 司书毅 肖春玲 《中国医药生物技术》 2014年第2期116-123,共8页

目的建立以结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶为靶点的新型高通量抗结核药物筛选模型，筛选丙氨酸消旋酶的抑制剂，获得以丙氨酸消旋酶为靶点的新型抗结核药物先导物。 方法以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组为模板，pET28a表达质粒为载体，将 alr ... 目的建立以结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶为靶点的新型高通量抗结核药物筛选模型，筛选丙氨酸消旋酶的抑制剂，获得以丙氨酸消旋酶为靶点的新型抗结核药物先导物。 方法以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组为模板，pET28a表达质粒为载体，将 alr 基因克隆至 pET28a ，构建pET28a：alr 重组表达质粒，表达并纯化得到重组结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶；通过测定反应产物 NADH 在340 nm处光密度变化速率，检测酶反应活性，构建并优化该酶抑制剂的高通量筛选模型；应用该模型对化合物库进行筛选；测定活性化合物 IC50以及对结核分枝杆菌的 MIC。 结果成功构建了结核分枝杆菌 alr 基因的表达载体；得到了纯度较高的重组丙氨酸消旋酶，测得该酶的比活力为13.53 kU/mg；所建立的丙氨酸消旋酶高通量筛选模型稳定性高，符合高通量筛选的要求；通过对70000个化合物进行筛选，得到了5个活性较高的化合物，其中，IMB-XZ5对结核分枝杆菌的 MIC 为4-8μg/ml，且对结核分枝杆菌的作用具有较高的特异性。 结论建立了稳定性好、灵敏度较高的结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶抑制剂高通量筛选模型，应用该模型筛选得到了具有较好抗结核活性的丙氨酸消旋酶抑制剂。 展开更多

关键词 丙氨酸消旋酶 抗结核药 酶抑制剂 高通量筛选

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以结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶为靶点的抗结核药物筛选及其与D-环丝氨酸的共结晶 被引量：3

11

作者 马娟娟 张国防 +2 位作者 陈帅 姚丽娜 刘祥 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期1613-1620,共8页

【目的】阐释结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶原有抑制剂D-环丝氨酸的作用机制,建立丙氨酸消旋酶抑制剂的高通量筛选模型,并用此模型筛选到新的抑制剂分子。【方法】将结核分枝杆菌中丙氨酸消旋酶基因克隆到pET-28a表达载体中,在大肠杆菌BL21(... 【目的】阐释结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶原有抑制剂D-环丝氨酸的作用机制,建立丙氨酸消旋酶抑制剂的高通量筛选模型,并用此模型筛选到新的抑制剂分子。【方法】将结核分枝杆菌中丙氨酸消旋酶基因克隆到pET-28a表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到可溶性的大量表达。表达后的蛋白质通过镍离子亲和层析和阴离子交换层析得到纯化,一方面将纯化后的蛋白和D-环丝氨酸共结晶以解析其抑制剂作用的分子机制。另一方面建立并优化丙氨酸消旋酶抑制剂的高通量筛选体系,用D-环丝氨酸验证体系的可行性并用该体系筛选本实验室药物库中的384种小分子片段、792种化合物及2 200种中药样品。【结果】得到的共晶晶体衍射能力2.50?,晶体空间群为P41212,晶胞参数a=b=163.92?,c=57.44?。结构分析表明,D-环丝氨酸进入活性位点之后与磷酸吡哆醛相互作用形成磷酸吡哆胺,使得磷酸吡哆醛的C4?原子与K42之间的相互作用被破坏,从而改变了结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶的活性中心氢键网络。同时经D-环丝氨酸验证建立的抑制剂筛选体系可行,获得阳性化合物分子2个。【结论】依据我们所建立的高通量筛选体系可以有效地为结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶筛选到可信的抑制剂分子。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 丙氨酸消旋酶 抗结核药物 D-环丝氨酸 药物筛选 蛋白质结晶

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恶臭假单胞菌丙氨酸消旋酶基因的克隆、序列分析及表达 被引量：2

12

作者 曹芹 赵智 +2 位作者 张英姿 王宇 丁久元 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期80-84,共5页

从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)200的基因组出发,用PCR方法克隆到两个独立作用的丙氨酸消旋酶基因,称之为dadX和alr。DadX编码357个氨基酸长的多肽,计算分子量为38.82kDa,alr编码409个氨基酸长的多肽,计算分子量为44.182kDa。序列... 从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)200的基因组出发,用PCR方法克隆到两个独立作用的丙氨酸消旋酶基因,称之为dadX和alr。DadX编码357个氨基酸长的多肽,计算分子量为38.82kDa,alr编码409个氨基酸长的多肽,计算分子量为44.182kDa。序列分析显示,DadX的氨基酸序列与Pseudomonas putidaKT2440,铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌(Escherichia coli)的DadX比较,相似性分别为96.64%、71.99%、44.88%和47.37%。Alr的氨基酸序列与Pseudomonas putidaKT2440比较,同源性为94.38%,而与铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和大肠杆菌(E.coli)的Alr比较,同源性均较低,分别为22.89%、25.72%和26.44%。在P.putida200的DadX和Alr氨基酸序列中部发现有对于酶活性至关重要的保守区域,如磷酸吡哆醛(PLP)结合位点。DadX和alr在大肠杆菌中得到表达,DadX丙氨酸消旋酶只对丙氨酸有消旋作用,而Alr丙氨酸消旋酶可以作用于丙氨酸和丝氨酸两种底物,且对丝氨酸特异性更高。Alr的表达不依赖于外源启动子,说明在其结构基因上游存在启动子结构。 展开更多

关键词 恶臭假单胞菌 丙氨酸消旋酶 基因克隆 表达

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西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组来源的丙氨酸消旋酶的异源表达及性质研究 被引量：1

13

作者 杨金茹 范琴 +2 位作者 黄遵锡 韩楠玉 许波 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期1362-1378,共17页

丙氨酸消旋酶是异构酶家族中一类重要的酶,既能作为新型抗菌药物筛选的靶标,又是酶法合成D-氨基酸的关键酶之一,有巨大的研究价值。【目的】为挖掘动物胃肠道中未培养微生物的丙氨酸消旋酶基因资源,探究不同微生物来源丙氨酸消旋酶基因... 丙氨酸消旋酶是异构酶家族中一类重要的酶,既能作为新型抗菌药物筛选的靶标,又是酶法合成D-氨基酸的关键酶之一,有巨大的研究价值。【目的】为挖掘动物胃肠道中未培养微生物的丙氨酸消旋酶基因资源,探究不同微生物来源丙氨酸消旋酶基因及其酶的功能和性质。【方法】本研究从西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组出发,基于序列分析和基因功能注释,克隆丙氨酸消旋酶基因并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功异源表达,进行酶功能鉴定和性质研究。【结果】从宏基因组中获得2个丙氨酸消旋酶基因NCalr 1和NCalr 6并进行了重组表达,2基因全长均为1170 bp,编码389个氨基酸;理论分子量分别为43.58 kDa和43.94 kDa。重组酶的最适pH均为12.0,最适温度为40℃和37℃。在pH 9.0–12.0条件下处理1 h,重组酶相对酶活性仍在90%以上,表明重组酶具有较好的耐碱性;在30–45℃处理1 h,相对酶活仍在85%以上,说明重组酶在30–45℃条件下稳定性好。重组酶的最适PLP浓度为10μmol/L,添加10μmol/L PLP时,可使得重组酶的相对活性提高30%和7%左右;但当PLP的结合位点由赖氨酸突变为丙氨酸后,相对酶活仅为初始酶活的1%和27%。两重组酶的K_(m)分别为(14.81±1.66)mmol/L和(25.87±1.95)mmol/L。10 mmol/L的Hg^(2+)、Ag^(+)、Zn^(2+)和SDS对重组酶具有强烈的抑制作用;Fe^(3+)对重组酶有极强的激活作用,10 mmol/L的Fe^(3+)可将酶活性提高2.6–5.1倍。【结论】本研究首次利用宏基因组学技术从西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组中获得2个新型丙氨酸消旋酶,具有较好的应用前景。 展开更多

关键词 丙氨酸消旋酶 粪便微生物宏基因组 异源表达 酶学性质

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通过易错PCR提高鼠伤寒沙门氏菌丙氨酸消旋酶催化活性 被引量：2

14

作者 郑豆豆 罗素亚 +3 位作者 杜穆花 何广正 徐书景 鞠建松 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期2475-2486,共12页

【目的】通过易错PCR技术提高鼠伤寒沙门氏菌中丙氨酸消旋酶的催化活性。【方法】利用易错PCR技术构建丙氨酸消旋酶基因alrSt的突变体文库,采用缺陷菌株UT5028筛选突变体基因,以D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性,通过凝胶过滤... 【目的】通过易错PCR技术提高鼠伤寒沙门氏菌中丙氨酸消旋酶的催化活性。【方法】利用易错PCR技术构建丙氨酸消旋酶基因alrSt的突变体文库,采用缺陷菌株UT5028筛选突变体基因,以D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性,通过凝胶过滤层析法分析酶蛋白寡聚化状态,并采用HPLC检测酶蛋白的动力学参数。【结果】经过易错PCR及定点突变技术最终获得了3个催化活性有所提高的突变体A3V、Y343H和A3VY343H,酶学特性分析发现,与野生型蛋白StAlr相比,突变体Y343H仅对底物L/D-丝氨酸的催化效率略有提高,kcat/Km值分别是StAlr的2.01和3.68倍;而突变体A3V则对底物L/D-丙氨酸或L/D-丝氨酸的Km、kcat和kcat/Km值均有较大幅度的改变,其kcat/Km值分别是StAlr的105.51、97.36、4.63和10.73倍。凝胶过滤层析结果显示,突变体A3V在蛋白含量极低时就呈现出单体和二聚体共存状态,且随着蛋白含量的增加,其向二聚体状态迁移的速率最为明显。【结论】丙氨酸消旋酶StAlr的第3位点是影响其催化活性和低聚合状态的关键位点。 展开更多

关键词 鼠伤寒沙门氏菌 丙氨酸消旋酶 易错PCR 低聚化 催化活性

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变异链球菌alr缺失突变株的构建及初步观察 被引量：2

15

作者 陆慧 李永亮 +1 位作者 孙育杰 魏世成 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2013年第4期9-13,共5页

已知右旋氨基酸参与了细菌细胞壁肽聚糖的形成,但尚未有实验对其如何影响致龋菌变异链球菌进行研究。本实验成功构建了变异链球菌丙氨酸消旋酶alr缺失型突变菌IFD140Δalr。表型观察突变株菌落外观和生长情况与野生株无明显差异,但生长... 已知右旋氨基酸参与了细菌细胞壁肽聚糖的形成,但尚未有实验对其如何影响致龋菌变异链球菌进行研究。本实验成功构建了变异链球菌丙氨酸消旋酶alr缺失型突变菌IFD140Δalr。表型观察突变株菌落外观和生长情况与野生株无明显差异,但生长曲线提示对数生长期之后比野生株生长快,且饱和浓度较高。扫描电镜显示突变株相较野生株形成了更厚更致密的生物膜。通过变异链球菌alr缺失突变菌株的构建成功,提示右旋氨基酸可能对维持变异链球菌的正常生长和形成生物膜有重要作用。 展开更多

关键词 变异链球菌 丙氨酸消旋酶 右旋氨基酸 缺失突变

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铜绿假单胞菌中丙氨酸消旋酶的酶学特性及菌株检测 被引量：2

16

作者 牛晓平 韩卿卿 +2 位作者 何广正 鞠建松 徐书景 《河北师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2019年第1期67-75,共9页

铜绿假单胞菌为条件致病菌,是目前各种医院内感染最广泛、最严重的致病菌之一.以分离自公共场所洗手液的菌株6-3为研究对象,其16S rRNA基因与Pseudomonas aeruginosa DSM 50071的16S rRNA基因的一致性为99.8%,初步确定其为铜绿假单胞菌... 铜绿假单胞菌为条件致病菌,是目前各种医院内感染最广泛、最严重的致病菌之一.以分离自公共场所洗手液的菌株6-3为研究对象,其16S rRNA基因与Pseudomonas aeruginosa DSM 50071的16S rRNA基因的一致性为99.8%,初步确定其为铜绿假单胞菌;根据同源蛋白的核苷酸序列设计菌株6-3中丙氨酸消旋酶的扩增引物,通过PCR从6-3菌株中克隆获得了丙氨酸消旋酶基因(alrPa),基因序列与P. aeruginosa PAO1中丙氨酸消旋酶Alr_(PAO1)的氨基酸同源率为98.9%,存在4个不一致的氨基酸位点;经原核表达、Ni-NTA亲和层析法纯化获得了蛋白PaAlr,酶学特性分析表明,重组蛋白PaAlr的最适反应温度为40℃,最适反应pH=10.0;最适底物是L-Ala,具有严格的底物特异性,K_(m,L-Ala)=10.96mmol/L,V_(max,L-Ala)=1 562μmol/(L·min),K_(m,D-Ala)=8.45mmol/L,V_(max,D-Ala)=881.9μmol/(L·min),其最大反应速率约为Alr_(PAO1)的7倍;以铜绿假单胞菌中丙氨酸消旋酶为检测对象,以PCR和Western-blotting 2种方法对铜绿假单胞菌进行检测,实验发现,在目的基因序列已知的前提下,采用PCR法具有较好的检测灵敏性和专一性. 展开更多

关键词 铜绿假单胞菌 丙氨酸消旋酶 16S RRNA基因 菌株检测

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抗菌药物靶标丙氨酸消旋酶及其抑制剂研究进展 被引量：1

17

作者 杨金茹 范琴 +3 位作者 韩楠玉 黄遵锡 吴倩 许波 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期4894-4903,共10页

抗生素的滥用和人口的大量流动使得病原菌耐药性增强并与其他病原体产生共感染等问题,严重威胁人类的生命安全,因此,研发新型抗菌药物成为人类亟待解决的问题。丙氨酸消旋酶是以磷酸吡哆醛为辅酶催化L-丙氨酸与D-丙氨酸旋光结构互换的... 抗生素的滥用和人口的大量流动使得病原菌耐药性增强并与其他病原体产生共感染等问题,严重威胁人类的生命安全,因此,研发新型抗菌药物成为人类亟待解决的问题。丙氨酸消旋酶是以磷酸吡哆醛为辅酶催化L-丙氨酸与D-丙氨酸旋光结构互换的一类异构酶,其消旋产物D-丙氨酸对细菌细胞壁的形成具有决定性作用,与细菌性疾病密切相关。抑制丙氨酸消旋酶的活性会影响细菌的生存,近年来成为设计抗菌药物的一个理想靶位,其抑制剂的开发已成为抗菌药物研发的热点。本文从丙氨酸消旋酶的来源、结构、功能、应用及抑制剂等方面进行系统阐述,并对丙氨酸消旋酶的研究提出新的策略,为进一步研究丙氨酸消旋酶与致病菌的关系及抗菌药物候选靶标的研究提供理论基础。 展开更多

关键词 D-丙氨酸 丙氨酸消旋酶 抗菌药物靶点 抑制剂

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丙氨酸消旋酶C-端结构域重组体的构建及其功能初探 被引量：1

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作者 何广正 韩卿卿 +2 位作者 翟浠佐 徐书景 鞠建松 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期1983-1996,共14页

【目的】将嗜碱芽孢杆菌丙氨酸消旋酶OF4DadX的N-端结构域分别与多个不同种属的丙氨酸消旋酶C-端结构域重组,探究丙氨酸消旋酶C-端结构域功能。【方法】利用基因拼接构建丙氨酸消旋酶重组基因,通过镍亲和层析纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧... 【目的】将嗜碱芽孢杆菌丙氨酸消旋酶OF4DadX的N-端结构域分别与多个不同种属的丙氨酸消旋酶C-端结构域重组,探究丙氨酸消旋酶C-端结构域功能。【方法】利用基因拼接构建丙氨酸消旋酶重组基因,通过镍亲和层析纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测重组酶蛋白的酶学特性,借助分子筛和HPLC液相色谱分析其聚合状态及动力学参数。【结果】通过基因拼接构建了12个重组基因,经检测,表达、纯化获得的重组酶蛋白中只有OF4TtDadX240c具有催化活性,其活性仅为OF4DadX的60.54%,酶催化动力学结果显示OF4TtDadX240c催化反应速率Vmax/Km下降约10倍,但其稳定性大幅提高,半衰期比OF4DadX延长约5倍,耐热性提高较明显;聚合状态表明OF4DadX、OF4TMDadX226c和OF4TtDadX240c为二聚体结构,其他酶蛋白均为单体,但OF4TMDadX226c未检测到活性,推测可能是酶催化活性中心移位,未能形成质子转移而失去活性。【结论】丙氨酸消旋酶C-端折叠结构域对消旋酶低聚化、稳定性和酶催化功能具有重要作用。 展开更多

关键词 丙氨酸消旋酶 C-端结构域 酶学特性 二聚化 基因重组

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丙氨酸消旋酶的纯化及活性测定方法 被引量：1

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作者 张彩凤 《河北渔业》 2011年第12期38-39,共2页

丙氨酸消旋酶广泛分布于原核生物中,在人和其他高等生物中没有它的存在。丙氨酸消旋酶用于催化L-丙氨酸和D-丙氨酸的相互转化,归为5′-磷酸吡哆醛依赖型酶,属于异构酶家族。

关键词 丙氨酸消旋酶 纯化 活性

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CRISPR/Cas9和λ-Red基因敲除技术在大肠杆菌中的应用比较 被引量：1

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作者 吕言 任晓昕 徐大庆 《微生物前沿》 2022年第1期1-10,共10页

λ-Red和CRISPR/Cas9基因敲除技术已被广泛应用于染色体基因敲除。本研究分别采用λ-Red和CRISPR/Cas9技术对大肠杆菌BL21菌株染色体丙氨酸消旋酶基因alr进行了敲除,并比较了其敲除效率。对于Red敲除技术而言,首先构建由alr上下游同源... λ-Red和CRISPR/Cas9基因敲除技术已被广泛应用于染色体基因敲除。本研究分别采用λ-Red和CRISPR/Cas9技术对大肠杆菌BL21菌株染色体丙氨酸消旋酶基因alr进行了敲除,并比较了其敲除效率。对于Red敲除技术而言,首先构建由alr上下游同源臂和卡那抗性盒FLT-kanR-FLT组成的打靶片段Lalr-FLT-kanR-FLT-Ralr,转化E. coli BL21/pKD46感受态细胞,在pKD46表达的Red重组酶作用下发生同源重组,使染色体alr被卡那抗性盒FLT-kanR-FLT替换;然后,质粒pCP20转化上述发生了alr替换的E. coli菌株感受态细胞,在pCP20表达的FLP重组酶作用下发生位点特异性重组,删除卡那抗性基因kanR;最后,对温敏型质粒进行消除,获得alr敲除突变株E. coli BL21 Δalr-Red。对于CRISPR/Cas9技术而言,首先构建敲除质粒pTargetF-alr,制备打靶供体DNA片段L-alr-R;接着,pTargetF-alr和L-alr-R共转化E. coli BL21/pCas感受态细胞,在pTargetF-alr编码的sgRNA序列引导下,质粒pCas编码的Cas9蛋白结合到alr基因切割靶点DNA,通过对双链断裂的同源重组修复实现对alr基因的无痕敲除,获得alr敲除突变株E. coli BL21 Δalr-CRISPR。实验结果显示:使用基于短、长同源臂靶打靶片段的Red技术,E. coli BL21 Δalr-Red阳性转化子检出率分别为5%和55%;而使用CRISPR/Cas技术,E. coli BL21 Δalr-CRISPR阳性转化子检出率为95%。实验结果表明:在E. coli中,使用短同源臂靶打靶片段的Red敲除技术,转化子脱靶率超高,这使阳性转化子鉴定工作量大增;使用长同源臂打靶片段的Red敲除技术,较为容易检测到阳性转化子;使用CRISPR/Cas9技术,敲除效率显著优于λ-Red技术。 展开更多

关键词 大肠杆菌 CRISPR/Cas9 λ-Red 基因敲除 丙氨酸消旋酶基因

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