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不依赖连接反应的高通量克隆方法
被引量：
5
1
作者
李华琴
林陈水
张文倩
《氨基酸和生物资源》
CAS
2013年第4期43-46,共4页
基因表达及功能分析需要高通量的表达系统,因而简单、经济且高效地将PCR产物或其他来源的目的基因片段构建到质粒载体中就成为了亟需解决的问题。传统克隆方法使用限制性内切酶和连接酶,其缺点是受到基因序列中原有的酶切位点的限制以...
基因表达及功能分析需要高通量的表达系统,因而简单、经济且高效地将PCR产物或其他来源的目的基因片段构建到质粒载体中就成为了亟需解决的问题。传统克隆方法使用限制性内切酶和连接酶,其缺点是受到基因序列中原有的酶切位点的限制以及依赖连接酶导致的较低的连接转化率。为了克服这些缺点,一些不需要限制酶和连接酶的克隆方法被开发出来并运用到基因克隆中,获得了更佳的实验结果。该文就LIC、UDG克隆和Gateway重组克隆这三种不依赖连接反应的高通量克隆方法的原理及特性进行介绍。
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关键词
不
依赖
连接
克隆
Gateway重组
克隆
UDG
克隆
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职称材料
一种新的产生天然蛋白的不依赖于连接的克隆载体
被引量：
3
2
作者
谈蓉
马立新
《湖北大学学报（自然科学版）》
CAS
北大核心
2009年第4期415-418,共4页
报道一种新的不依赖于连接的克隆(LIC)载体.该载体被缺刻的内切酶N.BbvCIA和限制性内切酶SwaⅠ作用产生长的粘性末端.靶向基因的PCR片段在4 mmol/L dGTP的孵育下被T4 DNA聚合酶处理生成互补粘性末端.将处理过的载体和PCR产物共转化到大...
报道一种新的不依赖于连接的克隆(LIC)载体.该载体被缺刻的内切酶N.BbvCIA和限制性内切酶SwaⅠ作用产生长的粘性末端.靶向基因的PCR片段在4 mmol/L dGTP的孵育下被T4 DNA聚合酶处理生成互补粘性末端.将处理过的载体和PCR产物共转化到大肠杆菌体内,插入载体的接合能够被宿主酶和给定的重组质粒修复.接着引入到大肠杆菌表达系统,该融合蛋白能够被表达和纯化,再用烟草蚀刻病毒TEV蛋白酶处理将移去靶蛋白的N末端,产生天然蛋白.两个基因,绿色荧光蛋白基因egfp和硫氧环蛋白基因txn已被用于这个系统.结果表明LIC策略对于高通量克隆和表达是高效的,对于天然蛋白的产生也同样高效.
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关键词
不
依赖
连接
的
克隆
烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶
天然蛋白
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职称材料
弗氏志贺菌5a型M90T株ClpB蛋白在大肠杆菌中的融合表达和纯化
被引量：
1
3
作者
王羽
周围
+6 位作者
廖翔
魏波
冉金宝
高原
呼和巴特尔
岳俊杰
梁龙
《生物技术通讯》
CAS
2012年第6期781-784,共4页
目的:构建弗氏志贺菌clpB基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,纯化带T7标签的ClpB蛋白。方法与结果:PCR扩增得到线性化表达载体pET24a与2574 bp的clpB基因片段,利用不依赖连接反应的克隆法(LIC)进行克隆,得到重组质粒pET-ClpB,转入...
目的:构建弗氏志贺菌clpB基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,纯化带T7标签的ClpB蛋白。方法与结果:PCR扩增得到线性化表达载体pET24a与2574 bp的clpB基因片段,利用不依赖连接反应的克隆法(LIC)进行克隆,得到重组质粒pET-ClpB,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,通过一系列条件优化,确定可溶性表达条件为在30℃下、用1 mmol/L IPTG诱导2 h;利用抗T7单克隆抗体琼脂糖珠进行亲和纯化,得到了纯度很高的相对分子质量为95×103的ClpB-T7融合蛋白。结论:实现了ClpB-T7在大肠杆菌中的可溶性表达,并纯化获得了高纯度的融合蛋白。
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关键词
ClpB蛋白
不
依赖
连接
反应的
克隆
法
融合表达
弗氏志贺菌
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职称材料
题名
不依赖连接反应的高通量克隆方法
被引量：
5
1
作者
李华琴
林陈水
张文倩
机构
浙江工业大学药学院
出处
《氨基酸和生物资源》
CAS
2013年第4期43-46,共4页
文摘
基因表达及功能分析需要高通量的表达系统,因而简单、经济且高效地将PCR产物或其他来源的目的基因片段构建到质粒载体中就成为了亟需解决的问题。传统克隆方法使用限制性内切酶和连接酶,其缺点是受到基因序列中原有的酶切位点的限制以及依赖连接酶导致的较低的连接转化率。为了克服这些缺点,一些不需要限制酶和连接酶的克隆方法被开发出来并运用到基因克隆中,获得了更佳的实验结果。该文就LIC、UDG克隆和Gateway重组克隆这三种不依赖连接反应的高通量克隆方法的原理及特性进行介绍。
关键词
不
依赖
连接
克隆
Gateway重组
克隆
UDG
克隆
Keywords
ligation independent cloning
gateway recombinational cloning
uracil DNA glycosylase cloning
分类号
Q784 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
一种新的产生天然蛋白的不依赖于连接的克隆载体
被引量：
3
2
作者
谈蓉
马立新
机构
南通大学生命科学学院
湖北大学生命科学学院
出处
《湖北大学学报（自然科学版）》
CAS
北大核心
2009年第4期415-418,共4页
基金
863计划(2004BA711A19)资助
文摘
报道一种新的不依赖于连接的克隆(LIC)载体.该载体被缺刻的内切酶N.BbvCIA和限制性内切酶SwaⅠ作用产生长的粘性末端.靶向基因的PCR片段在4 mmol/L dGTP的孵育下被T4 DNA聚合酶处理生成互补粘性末端.将处理过的载体和PCR产物共转化到大肠杆菌体内,插入载体的接合能够被宿主酶和给定的重组质粒修复.接着引入到大肠杆菌表达系统,该融合蛋白能够被表达和纯化,再用烟草蚀刻病毒TEV蛋白酶处理将移去靶蛋白的N末端,产生天然蛋白.两个基因,绿色荧光蛋白基因egfp和硫氧环蛋白基因txn已被用于这个系统.结果表明LIC策略对于高通量克隆和表达是高效的,对于天然蛋白的产生也同样高效.
关键词
不
依赖
连接
的
克隆
烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶
天然蛋白
Keywords
ligation-independent cloning
tobacco etch virus（TEV） protease
native protein
分类号
Q782 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
弗氏志贺菌5a型M90T株ClpB蛋白在大肠杆菌中的融合表达和纯化
被引量：
1
3
作者
王羽
周围
廖翔
魏波
冉金宝
高原
呼和巴特尔
岳俊杰
梁龙
机构
军事医学科学院生物工程研究所
内蒙古农业大学兽医学院
出处
《生物技术通讯》
CAS
2012年第6期781-784,共4页
基金
国家自然科学基金(30970122)
文摘
目的:构建弗氏志贺菌clpB基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,纯化带T7标签的ClpB蛋白。方法与结果:PCR扩增得到线性化表达载体pET24a与2574 bp的clpB基因片段,利用不依赖连接反应的克隆法(LIC)进行克隆,得到重组质粒pET-ClpB,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,通过一系列条件优化,确定可溶性表达条件为在30℃下、用1 mmol/L IPTG诱导2 h;利用抗T7单克隆抗体琼脂糖珠进行亲和纯化,得到了纯度很高的相对分子质量为95×103的ClpB-T7融合蛋白。结论:实现了ClpB-T7在大肠杆菌中的可溶性表达,并纯化获得了高纯度的融合蛋白。
关键词
ClpB蛋白
不
依赖
连接
反应的
克隆
法
融合表达
弗氏志贺菌
Keywords
ClpB protein
ligation-independent cloning
fusion expression
Shigella flexneri
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
下载PDF
职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
不依赖连接反应的高通量克隆方法
李华琴
林陈水
张文倩
《氨基酸和生物资源》
CAS
2013
5
下载PDF
职称材料
2
一种新的产生天然蛋白的不依赖于连接的克隆载体
谈蓉
马立新
《湖北大学学报（自然科学版）》
CAS
北大核心
2009
3
下载PDF
职称材料
3
弗氏志贺菌5a型M90T株ClpB蛋白在大肠杆菌中的融合表达和纯化
王羽
周围
廖翔
魏波
冉金宝
高原
呼和巴特尔
岳俊杰
梁龙
《生物技术通讯》
CAS
2012
1
下载PDF
职称材料
已选择
0
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