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应用双抗体夹心ELISA检测产志贺毒素大肠杆菌Ⅱ型志贺毒素 被引量：1
1
作者 史凤娟 曾晓燕 +3 位作者 宋路 史智扬 郭喜玲 焦永军 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期771-774,共4页
目的：构建双抗体夹心ELISA检测Ⅱ型志贺毒素（ StxⅡ）,以利于产志贺毒素大肠杆菌（ STEC）感染的临床快速诊断。方法应用业已制备的StxⅡ特异性杂交瘤细胞株,筛选、鉴定最佳抗体配对,构建双抗体夹心ELISA检测体系,对16株STEC临床分离... 目的：构建双抗体夹心ELISA检测Ⅱ型志贺毒素（ StxⅡ）,以利于产志贺毒素大肠杆菌（ STEC）感染的临床快速诊断。方法应用业已制备的StxⅡ特异性杂交瘤细胞株,筛选、鉴定最佳抗体配对,构建双抗体夹心ELISA检测体系,对16株STEC临床分离株培养上清中StxⅡ进行检测,并对该体系的特异性和敏感性进行评价。结果从获得的多株单抗分子中,成功筛选出最佳配对抗体S2D8和S2C6,构建基于S2D8/S2C6的双抗体夹心ELISA检测体系,该体系对StxⅡ纯品的检测底限是4 ng/ml,并成功从STEC培养上清中检测出StxⅡ及其变种,而与StxⅠ不结合。其检测效能与商业化胶体金试剂一致,显示出良好的敏感性和特异性。结论 S2 D8/S2 C6单抗的双抗体夹心法ELISA检测试剂的制备为基于毒素分子作为靶分子的STEC 免疫诊断、治疗研究提供基础资料。 展开更多
关键词 产志贺毒素大肠杆菌 ⅱ型志贺毒素 单克隆抗体 双抗体夹心 ELISA
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肠出血性大肠杆菌Ⅱ型志贺毒素的原核表达和活性研究
2
作者 张勇 董靖 +2 位作者 刘水 邓旭明 杨振国 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第5期45-49,共5页
为了通过原核表达和纯化得到生物活性良好的重组Ⅱ型志贺毒素并研究其体内外生物学活性,试验以肠出血性大肠杆菌O157:H7 EDL933菌株为模板,从全基因组中扩增出能表达Ⅱ型志贺毒素全长的stx2基因,通过基因克隆技术构建了p ET32a-stx2原... 为了通过原核表达和纯化得到生物活性良好的重组Ⅱ型志贺毒素并研究其体内外生物学活性,试验以肠出血性大肠杆菌O157:H7 EDL933菌株为模板,从全基因组中扩增出能表达Ⅱ型志贺毒素全长的stx2基因,通过基因克隆技术构建了p ET32a-stx2原核表达载体,并高表达了Ⅱ型志贺毒素全毒素,进一步对重组毒素进行了精细纯化并通过体内外2种方法对其生物学活性进行了评价。结果表明:该毒素纯度较高,对He La细胞的半数致死剂量为21.01 pg,对小鼠的半数致死量为2μg/kg。 展开更多
关键词 肠出血性大肠杆菌 ⅱ型志贺毒素 活性 药物 毒力因子 蛋白 载体
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Ⅱ型志贺毒素单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的表达和功能鉴定
3
作者 郭喜玲 吴涛 +6 位作者 曾晓燕 张晓 陈银 史智扬 詹峰 金秋 焦永军 《医学分子生物学杂志》 CAS CSCD 2010年第5期382-387,共6页
目的从分泌抗肠出血性大肠埃希菌Ⅱ型志贺毒素中和单克隆抗体杂交瘤细胞株S2C4中克隆抗体可变区基因，构建单链抗体（ScFv），进行原核表达，并对其功能进行鉴定。方法从杂交瘤细胞株S2C4中提取总RNA，逆转录成cDNA。在cDNA3’-OH末端添... 目的从分泌抗肠出血性大肠埃希菌Ⅱ型志贺毒素中和单克隆抗体杂交瘤细胞株S2C4中克隆抗体可变区基因，构建单链抗体（ScFv），进行原核表达，并对其功能进行鉴定。方法从杂交瘤细胞株S2C4中提取总RNA，逆转录成cDNA。在cDNA3’-OH末端添加poly．G。PCR扩增包括5’非翻译区和信号肽序列在内的抗体重、轻链可变区基因VH和VL,PCR产物装入T—A载体测序。根据测序结果，设计引物分别扩增VH和VL编码区，再通过重叠PCR，在VH和VL．编码区基因之间引入连接链，构建Scn基因，并克隆到表达载体pComb3xSS中。重组载体导入E．coliTop10F’进行表达，重组蛋白经纯化后，分别用ELISA和动物保护性实验鉴定其生物学活性。结果VH和VL编码区基因全长分别为396bp和378bp，ScFv基因能在大肠埃希菌中高效表达，表达产物的分子量为34000，用NiSO4亲和层析柱成功纯化。功能性实验表明纯化的重组蛋白可以与Stx2毒素有效结合，能保护动物抵御毒素分子的攻击。结论成功地克隆S2C4单抗可变区基因，并构建、表达其单链抗体ScFv，为下一步进行该抗体人源化奠定实验基础。 展开更多
关键词 ⅱ型志贺毒素 单克隆抗体 单链抗体 表达 功能鉴定
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Ⅱ型志贺样毒素B亚单位的重组表达及其受体结合活性 被引量：1
4
作者 包士中 史晶 +2 位作者 蔡昆 荫俊 王慧 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期23-27,共5页
目的:在大肠杆菌中重组表达Ⅱ型志贺样毒素B亚单位(Stx2B),并对其表达形式和受体结合活性进行分析。方法:PCR方法从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7中钓取Stx2B编码基因,利用基因克隆技术构建重组大肠杆菌pET-stx2B/BL21,IPTG诱导目的蛋... 目的:在大肠杆菌中重组表达Ⅱ型志贺样毒素B亚单位(Stx2B),并对其表达形式和受体结合活性进行分析。方法:PCR方法从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7中钓取Stx2B编码基因,利用基因克隆技术构建重组大肠杆菌pET-stx2B/BL21,IPTG诱导目的蛋白高效表达并对表达的包涵体进行变性和复性处理,离子交换层析纯化蛋白。通过SDS-PAGE变性和非变形蛋白电泳,分析重组Stx2B的表达形式,并利用Hela细胞结合模型,评价重组Stx2B与细胞受体的结合活性。结果:构建的重组大肠杆菌pET-stx2B/BL21能高效表达Stx2B,经变性、复性及离子交换层析操作,获得高纯度的目的蛋白。SDS-PAGE变性和非变形蛋白电泳分析显示,重组Stx2B以二聚体形式存在,单体之间通过二硫键相连。细胞结合试验显示,重组Stx2B与Hela细胞具有特异结合活性。结论:成功构建表达Stx2B的基因工程菌,Stx2B的受体结合活性不依赖于五聚体形式。 展开更多
关键词 ⅱ型志贺样毒素B亚单位 重组表达 受体结合活性
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