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基于二次判别的果蝇启动子识别 被引量:7
1
作者 林昊 李前忠 《生物物理学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期345-350,共6页
通过对果蝇polⅡ启动子和非启动子的序列特征分析,计算了序列每个位点单碱基保守性M1(l)值和六联体保守性M6(l)值。从而分别选取两个区域的六联体频数作为离散源参数,利用离散增量结合二次判别函数(IDQD)对启动子进行了预测。对于从编... 通过对果蝇polⅡ启动子和非启动子的序列特征分析,计算了序列每个位点单碱基保守性M1(l)值和六联体保守性M6(l)值。从而分别选取两个区域的六联体频数作为离散源参数,利用离散增量结合二次判别函数(IDQD)对启动子进行了预测。对于从编码区和内含子中选取的非启动子数据集,启动子的预测成功率分别达到93%和89%。比较结果显示IDQD模型能够有效地提高启动子预测成功率。 展开更多
关键词 POL 启动子 离散增量 二次判别函数 六联体
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sⅡ系列缺失启动子载体的构建
2
作者 石琰璟 黄淑燕 周志芳 《科学技术与工程》 2009年第3期568-571,共4页
为检测新型sⅡ根部特异启动子的功能,采用PCR的方法,扩增胡萝卜根部特异启动子sⅡ基因的启动子序列,得到该启动子-650bp和-1000bp区域片段。在启动子片段的5’和3’端分别引入了克隆所需的限制性酶切位点,分别定向克隆到经改造的质粒载... 为检测新型sⅡ根部特异启动子的功能,采用PCR的方法,扩增胡萝卜根部特异启动子sⅡ基因的启动子序列,得到该启动子-650bp和-1000bp区域片段。在启动子片段的5’和3’端分别引入了克隆所需的限制性酶切位点,分别定向克隆到经改造的质粒载体pBI121和pBITM2MARⅡ中,取代原有的组成型启动子CaMV35S,获得了四个含有胡萝卜根部特异启动子sⅡ基因不同缺失片段区域与GUS报告基因的融合检测载体。该系列载体通过农杆菌介导转入胡萝卜,检测sⅡ不同长度片段启动子在胡萝卜根部驱动报告基因的表达情况,分析该启动子的功能。 展开更多
关键词 根部特异启动子 s启动子 载体构建 农杆菌介导转化
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基于序列和结构特征分析植物TATA和TATA-less启动子 被引量:5
3
作者 左永春 李前忠 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2009年第7期863-871,共9页
分析启动子区域内调控元件是阐明基因转录起始机制的重要前提.利用从PlanPromDB数据库下载的植物Pol-ⅡTATA和TATA-less启动子数据,深入分析了两类启动子GC偏好、位点结构保守性、序列碱基组分、保守模体分布、TATAbox位点分布及关联位... 分析启动子区域内调控元件是阐明基因转录起始机制的重要前提.利用从PlanPromDB数据库下载的植物Pol-ⅡTATA和TATA-less启动子数据,深入分析了两类启动子GC偏好、位点结构保守性、序列碱基组分、保守模体分布、TATAbox位点分布及关联位点保守性等特点,统计出两类植物启动子许多特有的序列组分和结构规律,这些规律对进一步揭示植物Pol-Ⅱ启动子的转录调控机制有一定的帮助.通过构建能够同时考虑位点保守性和关联性的位点关联性权重矩阵扫描模型(PCWM),利用相应打分函数(Score)对两类启动子进行区分,得到了较好结果,说明PCWM的预测性能要优于单碱基的位点权重矩阵(PWM). 展开更多
关键词 植物Pol-启动子 序列组成偏好特征 TATA和TATA-less启动子 保守模体 位点关联权重矩阵(PCWM)
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胰岛素样生长因子Ⅱ基因启动子P3甲基化状态与涎腺多形性腺瘤发生的关系 被引量:1
4
作者 刘丽 马洪 《实用口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期517-521,共5页
目的:检测胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)启动子P3在涎腺多形性腺瘤(SPA)中的甲基化状态。方法:收集26例SPA组织及瘤旁相对应的正常涎腺组织,10例涎腺恶性肿瘤(恶性多形性腺瘤除外)及10例正常涎腺组织,应用巢式甲基化特异性PCR(nMSP)检测I... 目的:检测胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)启动子P3在涎腺多形性腺瘤(SPA)中的甲基化状态。方法:收集26例SPA组织及瘤旁相对应的正常涎腺组织,10例涎腺恶性肿瘤(恶性多形性腺瘤除外)及10例正常涎腺组织,应用巢式甲基化特异性PCR(nMSP)检测IGF-Ⅱ启动子P3的甲基化状态。对其中10个样本(SPA及正常组织3对,恶性肿瘤及正常组织2对)采用焦磷酸测序(pyrosequencing)检测。结果:9例SPA中IGF-Ⅱ启动子P3呈低甲基化状态改变,其余为部分甲基化和甲基化。正常涎腺组织及涎腺恶性肿瘤组织未出现低甲基化改变。结论:IGF-Ⅱ启动子P3低甲基化可能在涎腺多形性腺瘤的发生发展中具有一定的作用。 展开更多
关键词 多形性腺瘤(SPA) 胰岛素样生长因(IGF-) IGF-启动子P3 甲基化 巢式甲基化特异性PCR 焦磷酸测序
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可诱导肿瘤靶向性IFN-α2a重组腺病毒的构建及其表达 被引量:1
5
作者 李祥 璩津生 +3 位作者 康帅 何哲耘 杨纪峰 高基民 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期265-271,共7页
腺病毒载体广泛应用于恶性肿瘤的靶向性基因治疗的研究,但这些肿瘤靶向载体缺乏可控性,其疗效和安全性受到很大的影响,因此开发新型可诱导的生物肿瘤靶向载体是当今抗肿瘤靶向药物研究的当务之急。该研究构建了可诱导肿瘤靶向性IFN-α2... 腺病毒载体广泛应用于恶性肿瘤的靶向性基因治疗的研究,但这些肿瘤靶向载体缺乏可控性,其疗效和安全性受到很大的影响,因此开发新型可诱导的生物肿瘤靶向载体是当今抗肿瘤靶向药物研究的当务之急。该研究构建了可诱导肿瘤靶向性IFN-α2a重组腺病毒。重组腺病毒能够有效感染人肝癌细胞株HepG2等多种肿瘤细胞株,RT-PCR和Western blot结果表明肿瘤细胞能高效表达IFN-α2a,而其非肿瘤细胞株L02几乎没有表达。诱导试验表明重组腺病毒Ad MT-Ⅱ-hTERT/IFN-α2a能被ZnSO4诱导表达。可诱导肿瘤靶向性重组腺病毒Ad MT-Ⅱ-hTERT/IFN-α2a成功构建为下一步体内外抑癌实验研究打下了基础。 展开更多
关键词 肿瘤靶向性 腺病毒 HTERT启动子 MT-启动子
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RNA聚合酶Ⅱ启动子调控RNA干扰在肿瘤治疗中的应用前景 被引量:2
6
作者 陈青 潘秋卫 +1 位作者 蔡荣 钱程 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2007年第8期806-815,共10页
RNA干扰是双链RNA介导的特异性转录后基因表达沉默现象.由于双链小干扰RNA介导的RNA干扰技术设计简便、作用迅速、效果明显,目前已被广泛应用于基因功能和重大疾病治疗的研究,尤其为肿瘤治疗提供了一条新途径.利用RNA干扰技术通过调节... RNA干扰是双链RNA介导的特异性转录后基因表达沉默现象.由于双链小干扰RNA介导的RNA干扰技术设计简便、作用迅速、效果明显,目前已被广泛应用于基因功能和重大疾病治疗的研究,尤其为肿瘤治疗提供了一条新途径.利用RNA干扰技术通过调节肿瘤发生发展相关基因的表达可制定出一系列有效的抗癌策略.然而在现行大多数策略中往往采用不可调控的RNA聚合酶Ⅲ启动子(H1,U6)表达经典的发夹结构RNA,经由Dicer酶切割成功能性siRNA,因此缺乏组织细胞靶向性和抗癌效率.最新研究表明,采用RNA聚合酶Ⅱ启动子可弥补由RNA聚合酶Ⅲ启动子调控RNA干扰缺陷和不足.此外,运用病毒载体特别是具有靶向和溶瘤效应的肿瘤特异性复制腺病毒,介导RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达siRNA有望成为更有效的治疗手段. 展开更多
关键词 RNA干扰 RNA聚合酶启动子 肿瘤治疗
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利用支持向量机和马氏判别式预测人类polⅡ启动子 被引量:1
7
作者 林昊 杨科利 《生物信息学》 2009年第2期117-119,127,共4页
通过选取人类启动子与非启动子序列中不同的k-mer作为预测算法的基础特征,分别以三个区域(-249^-1;0^+50;-30^+30)的6-mer频数作为离散源参数构建离散增量,同时选取24个位点(-31^-21;-4^+2;+25^+29)的3-mer频数作为位置打分函数的参数,... 通过选取人类启动子与非启动子序列中不同的k-mer作为预测算法的基础特征,分别以三个区域(-249^-1;0^+50;-30^+30)的6-mer频数作为离散源参数构建离散增量,同时选取24个位点(-31^-21;-4^+2;+25^+29)的3-mer频数作为位置打分函数的参数,分别利用支持向量机和马氏判别式为判别函数对启动子进行预测。用10折叠交叉检验来衡量两种算法的预测能力,预测结果成功率分别达到87.0%和87.9%。对于独立检验集,敏感性分别为62.7%和76.0%,特异性分别为77.5%和66.8%。 展开更多
关键词 pol启动子 离散增量 位置打分函数 支持向量机 贝叶斯判别函数
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理论预测果蝇polⅡ启动子
8
作者 林昊 李前忠 《生物信息学》 2008年第1期25-27,共3页
基于果蝇polⅡ启动子的序列特征,利用结合了离散增量和位置权重矩阵的贝叶斯判别函数对果蝇启动子进行了预测。对预测算法进行10交叉检验。通过比较不同大小训练集对结果的影响,说明了参数选取的合理性和算法的预测能力。同时比较了不... 基于果蝇polⅡ启动子的序列特征,利用结合了离散增量和位置权重矩阵的贝叶斯判别函数对果蝇启动子进行了预测。对预测算法进行10交叉检验。通过比较不同大小训练集对结果的影响,说明了参数选取的合理性和算法的预测能力。同时比较了不同参数的选取对预测结果的影响,从而获得最佳启动子预测结果。预测结果显示成功率达到93%,相互关联系数达到83%。 展开更多
关键词 pol启动子 离散增量 位置打分函数 贝叶斯判别函数
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RNA聚合酶Ⅱ启动子驱动的长双链RNA干扰载体的构建与验证 被引量:1
9
作者 曹柯 孙朕 +1 位作者 黄培华 樊宝良 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第8期1-5,190,共6页
为了探索构建由RNA聚合酶Ⅱ型启动子驱动、能有效避免干扰素反应的表达长双链RNA的RNA干扰载体,试验在转录单元两端各添加了一个自剪切核酶序列,在转录后切成RNA出核所必要的5'帽子和3'polyA尾,以绿色荧光蛋白(EGFP)基因为报告... 为了探索构建由RNA聚合酶Ⅱ型启动子驱动、能有效避免干扰素反应的表达长双链RNA的RNA干扰载体,试验在转录单元两端各添加了一个自剪切核酶序列,在转录后切成RNA出核所必要的5'帽子和3'polyA尾,以绿色荧光蛋白(EGFP)基因为报告基因插入2个核酶之间作为试验载体,以表达红色荧光蛋白基因的载体作转染效率校准,通过瞬间转染对荧光蛋白的表达情况进行观察和RT-PCR分析。结果表明:在转染效率基本一致的情况下,试验组未观察到绿色荧光;2个核酶能够完全自剪切,试验组细胞质中有EGFP mRNA的存在,但与正常对照组相比下降了46.1%。说明研究设计的载体达到了延迟表达RNA出核的目的,为用该载体表达长双链RNA时在其出核之前被Dicer酶有效切割成小双链RNA从而避免其出核引起干扰素反应提供了时间保障。 展开更多
关键词 RNA干扰 RNA聚合酶启动子 长双链RNA 核酶
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瑞氏木霉木聚糖酶Ⅱ启动子功能区缺失分析的初探
10
作者 刘谨 李晓 汪天虹 《山东大学学报(理学版)》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期102-105,共4页
木聚糖酶Ⅱ (XylanaseⅡ )是瑞氏木霉中两种主要的内切木聚糖酶之一 .序列分析显示其 1.1kb的启动子区含有多种丝状真菌转录因子结合位点 ,可受多种激活因子、抑制因子、增强子的转录调控 .以编码 β -葡糖苷酸酶(GUS)的E .coliuidA基... 木聚糖酶Ⅱ (XylanaseⅡ )是瑞氏木霉中两种主要的内切木聚糖酶之一 .序列分析显示其 1.1kb的启动子区含有多种丝状真菌转录因子结合位点 ,可受多种激活因子、抑制因子、增强子的转录调控 .以编码 β -葡糖苷酸酶(GUS)的E .coliuidA基因为报告基因 ,分别与木聚糖酶Ⅱ启动子及功能区 (- 312~ - 10 80 )缺失启动子融合 ,构建报告质粒pXIIPU与pXIIPΔEXU ,引入瑞氏木霉蛋白酶缺陷株TrichodermareeseiRutC30U4 .先后对转化子进行发酵实验 ,测定GUS活性 ,结果显示功能区 - 312~ - 10 80缺失后的启动子活性是原启动子活性的 19% .结果表明在缺失的木聚糖酶Ⅱ启动子 - 312~ - 10 80区仍存在调节转录活性的顺式作用元件 ,值得进一步研究 . 展开更多
关键词 瑞氏木霉 木聚糖酶启动子 缺失分析 GUS
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非完全互补shRNA对RNA聚合酶Ⅱ启动子调控的RNAi的影响
11
作者 丁晶晶 任雪玲 +3 位作者 宋雨 张丹丹 张振中 张云 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期568-573,共6页
RNA干扰(RNAi)是一种转录后基因沉默技术,可有效诱导序列特异性基因沉默.由RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达的小发卡RNA可有效介导RNAi效应,为组织特异性基因沉默提供了一条新的途径.但是,由RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达的小发卡RNA(shRNA)在... RNA干扰(RNAi)是一种转录后基因沉默技术,可有效诱导序列特异性基因沉默.由RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达的小发卡RNA可有效介导RNAi效应,为组织特异性基因沉默提供了一条新的途径.但是,由RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达的小发卡RNA(shRNA)在序列上与靶基因非完全互补对RNAi效应的影响鲜有报道.本文初步探索RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达的shRNA碱基发生突变或缺失对RNAi效应的影响.研究表明,靶向hTERT mRNA的碱基突变shRNA显著降低RNAi效应,而靶向GFP mRNA的碱基缺失shRNA对RNAi效应没有显著影响.本研究为非完全互补shRNA对RNAi效应的进一步深入研究提供了理论与实验依据. 展开更多
关键词 小发卡RNA RNA干扰 RNA聚合酶启动子 突变 缺失
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玉米淀粉合成酶SSⅡa启动子的克隆及功能分析
12
作者 陈展宇 王阔 +2 位作者 王晓梅 刘相国 崔喜艳 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期15-22,共8页
【目的】克隆玉米Zea mays淀粉合成酶SSⅡa启动子,并分析其功能,为进一步研究和应用SSⅡa启动子奠定基础。【方法】通过NCBI上公布的玉米基因组序列,在网站Maize GDB上BLAST查找到SSⅡa 5'侧翼序列,利用PCR方法从玉米B73中克隆SSⅡ... 【目的】克隆玉米Zea mays淀粉合成酶SSⅡa启动子,并分析其功能,为进一步研究和应用SSⅡa启动子奠定基础。【方法】通过NCBI上公布的玉米基因组序列,在网站Maize GDB上BLAST查找到SSⅡa 5'侧翼序列,利用PCR方法从玉米B73中克隆SSⅡa启动子;通过Plant Care在线分析启动子顺式作用元件,用特异性引物分别克隆出长度为1 407、867、633、483和365 bp的片段,与植物表达载体p CAMBIA3301连接,构建5种5'缺失体的植物表达载体,命名为P1、P2、P3、P4和P5。用农杆菌介导法转化拟南芥Arabidopsis thaliana,获得转基因拟南芥。【结果】以玉米B73基因组DNA为模板,用特异性引物SSⅡa F/SSⅡaR进行扩增,得到2 526 bp序列;除草剂筛选的阳性拟南芥植株PCR验证均检测出gus基因;GUS组织化学分析表明,5种类型启动子构建的表达载体在成熟期叶片、果荚中均显蓝色;gus基因定量分析表明,成熟期5种转基因拟南芥叶片中,gus基因表达量P1最高,其他基本一致;种子中gus基因表达量P1和P2相近,且高于P3、P4和P5。【结论】成功克隆玉米SSⅡa启动子;构建的5种SSⅡa启动子缺失体表达载体在转基因拟南芥中均具有活性,长度为1 407 bp(P1)和867 bp(P2)的启动子具有胚乳特异性。 展开更多
关键词 玉米 淀粉合成酶 SSa启动子 克隆 载体构建 功能分析
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TOPO Ⅱα启动子调控因子组蛋白甲基化修饰在苯中毒致造血毒性中的作用 被引量:3
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作者 施益芬 郑周懿 +3 位作者 陈晶晶 钱珊瑚 历嘉琪 俞康 《温州医学院学报》 CAS 2015年第6期391-396,共6页
目的:研究拓扑异构酶(TOPO)Ⅱα启动子调控因子(SP1、ATF-2、SP3、NF-YA、NF-M、P53、CMYB、C-JUN、ICBP90)组蛋白甲基化修饰在苯中毒致造血毒性中的作用。方法:25例临床慢性苯中毒患者骨髓单个核细胞为病例组,25例正常人骨髓单个核细... 目的:研究拓扑异构酶(TOPO)Ⅱα启动子调控因子(SP1、ATF-2、SP3、NF-YA、NF-M、P53、CMYB、C-JUN、ICBP90)组蛋白甲基化修饰在苯中毒致造血毒性中的作用。方法:25例临床慢性苯中毒患者骨髓单个核细胞为病例组,25例正常人骨髓单个核细胞为对照组,染色质免疫沉淀分析(Ch IP)技术探讨TOPOⅡα启动子各调控因子组蛋白甲基化水平的变化,RT-PCR法测定TOPO Ⅱα启动子各调控因子m RNA表达水平的改变。结果:1与对照组比较,病例组TOPO Ⅱα启动子调控因子NF-M、C-JUN组蛋白H3K4甲基化水平下降,差异有统计学意义(P<0.05),SP1、ATF-2、SP3、NF-YA、P53、C-MYB、ICBP90组蛋白H3K4甲基化水平无明显改变(P>0.05);SP1、NF-M组蛋白H3K9甲基化水平升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),而ATF-2、SP3、NF-YA、P53、C-MYB、C-JUN、ICBP90组蛋白H3K9甲基化水平无明显改变(P>0.05)。2与对照组比较,病例组TOPO Ⅱα启动子调控因子SP1、NF-YA、C-MYB、NF-M及C-JUN m RNA表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),ATF-2、ICBP90 m RNA表达水平不变(P>0.05),SP3、P53 m RNA表达水平则升高(P<0.05或P<0.01)。结论:1慢性苯中毒TOPO Ⅱα启动子调控因子组蛋白化学修饰水平的改变伴随着调控因子m RNA水平的变化。2TOPO Ⅱα启动子调控因子组蛋白甲基化修饰在苯中毒所致的造血毒性中发挥一定的作用。 展开更多
关键词 拓扑异构酶α启动子调控因 组蛋白甲基化 染色质免疫沉淀分析法
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MISⅡR启动子的克隆及其组织特异性鉴定 被引量:1
14
作者 雷俊川 刘忠湘 +1 位作者 赵亚 韩骅 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2009年第11期823-826,共4页
目的克隆苗勒氏管抑制物Ⅱ型受体启动子(mullerian inhibiting substance typeⅡreceptor promoter,MISⅡRpr)并鉴定其在卵巢器官中的特异性表达活性。方法利用PCR从C57BL/6小鼠基因组中扩增苗勒氏管抑制物Ⅱ型受体启动子并将其克隆入载... 目的克隆苗勒氏管抑制物Ⅱ型受体启动子(mullerian inhibiting substance typeⅡreceptor promoter,MISⅡRpr)并鉴定其在卵巢器官中的特异性表达活性。方法利用PCR从C57BL/6小鼠基因组中扩增苗勒氏管抑制物Ⅱ型受体启动子并将其克隆入载体pMD18-T,测序正确后将其亚克隆入pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体。将重组质粒pGL3-Basic/MISⅡRpr分别转染卵巢癌细胞系SKOV3、HT-8910,宫颈癌细胞系Hela、Si Ha,绿猴肾细胞系COS-7,乳腺癌细胞系MDA-MB-231和结肠癌细胞系HT-29,通过双荧光素酶检测系统检测荧光素酶在上述细胞系中的活性,以确定克隆的苗勒氏管抑制物Ⅱ型受体启动子是否具有卵巢特异性活性。结果构建的pGL3-Basic/MISⅡRpr质粒用SacⅠ和EcoRⅠ双酶切,片段大小分别为600 bp和1 000 bp,证明MISⅡRpr插入正确。重组质粒转染卵巢细胞系SK-OV3、HT-8910,荧光素酶高表达;对照细胞HT-29等转染后,荧光素酶低表达。结论克隆得到的MISⅡRpr具有明显的卵巢特异性活性。可以利用MISⅡRpr进行相关基因的卵巢特异性表达。 展开更多
关键词 苗勒氏管抑制物型受体启动子 (MISRpr) 组织特异性 荧光素酶
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CaMKⅡα基因启动子的克隆和神经细胞特异性Cre表达载体的构建 被引量:2
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作者 徐瑛 周常文 +1 位作者 林炤华 柯琦 《中国优生与遗传杂志》 2008年第3期42-44,共3页
目的克隆和鉴定CaMKⅡα基因启动子序列,构建神经细胞特异性Cre重组酶的真核表达载体。方法采用高保真PCR方法分步扩增CaMKⅡα基因5′端8.1kb的调控区DNA片段,该片段包括了CaMKⅡα基因5′端调控区的所有序列。经克隆和部分序列测定后... 目的克隆和鉴定CaMKⅡα基因启动子序列,构建神经细胞特异性Cre重组酶的真核表达载体。方法采用高保真PCR方法分步扩增CaMKⅡα基因5′端8.1kb的调控区DNA片段,该片段包括了CaMKⅡα基因5′端调控区的所有序列。经克隆和部分序列测定后,依次与pCre-IRES-EGFP质粒框架连接,构建载体。结果克隆的CaMKⅡα基因5′端侧翼区酶切图谱与公布的C57BL/6J小鼠相应序列的酶切位点相一致,其中文献报道的富含顺式调控元件的序列与公布的小鼠序列完全相同。CaMKⅡα基因启动子正确地连接于Cre基因的5′端,构建了目标载体。结论这一载体的构建为建立前脑神经细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠奠定了基础,有助于神经系统相关疾病的研究。 展开更多
关键词 CaMKα基因启动子 克隆 CRE重组酶 表达载体 神经细胞特异性
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大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子克隆与功能验证 被引量:1
16
作者 韦玲静 黄玥萌 +3 位作者 严雪瑜 蒋钦杨 兰干球 郭亚芬 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期1861-1865,共5页
【目的】克隆大鼠胰岛素II基因启动子(RIP2)序列并对其功能进行验证,为培育胰岛特异性表达外源基因的转基因动物奠定基础。【方法】根据Gen Bank中已发表的RIP2序列(J00748.1)设计引物,以大鼠基因组DNA为模板,PCR扩增RIP2序列,连接p MD1... 【目的】克隆大鼠胰岛素II基因启动子(RIP2)序列并对其功能进行验证,为培育胰岛特异性表达外源基因的转基因动物奠定基础。【方法】根据Gen Bank中已发表的RIP2序列(J00748.1)设计引物,以大鼠基因组DNA为模板,PCR扩增RIP2序列,连接p MD18-T载体后用Hind III和Bam H I进行双酶切,回收RIP2片段并连接至不含启动子的p EGFP-1载体上构建真核表达载体p EGFP-1-RIP2。重组质粒转染PK15细胞,24 h后观察细胞荧光蛋白表达情况。【结果】克隆获得的RIP2序列与参考序列(J00748.1)的同源性为99.9%,存在3处碱基差异,即从起始密码子ATG(+1)上游-57处有一个G碱基缺失,-387处C突变为A,-707处插入一个G碱基。RIP2序列存在一个TATA-box(-206^-201位点)和一个CAAT-box(-343^-339位点)。以重组质粒p EGFP-1-RIP2转染PK15细胞,24 h后能观察到绿色荧光。【结论】克隆获得的大鼠RIP2序列具有启动子功能,但活性较CMV启动子弱。 展开更多
关键词 大鼠 胰岛素基因启动子 克隆 功能验证 真核表达载体
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