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广东梅州柑橘黄龙病和病毒病的发生调查及其黄龙病菌原噬菌体多样性 被引量：7
1
作者 崔一平 彭埃天 +3 位作者 宋晓兵 程保平 凌金锋 陈霞 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期1572-1582,共11页
【目的】调查柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌(CLas)的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017-2... 【目的】调查柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌(CLas)的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017-2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘裂皮病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDa V)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)和柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的c DNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计的2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2),运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%-83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDa V没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型(SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2),经过PCR电泳和测序得出,来自梅州� 展开更多
关键词 柑橘黄龙病 韧皮部杆菌亚洲种 柑橘病毒病 原噬菌体 遗传多样性
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携带不同原噬菌体的黄龙病菌在柑橘木虱体内的增殖及致病力 被引量：6
2
作者 黄家权 李莉 +2 位作者 吴丰年 郑正 邓晓玲 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期719-728,共10页
【背景】在中国,柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)所引起的一种毁灭性病害,严重威胁着柑橘产业的可持续发展。前期研究表明CLas全基因组上鉴定出3种单独类... 【背景】在中国,柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)所引起的一种毁灭性病害,严重威胁着柑橘产业的可持续发展。前期研究表明CLas全基因组上鉴定出3种单独类型的原噬菌体基因序列,而广东黄龙病菌主要以Type-2原噬菌体类型和Type-1+3混合原噬菌体类型为主。这两种CLas菌株在传病媒介——柑橘木虱(Diaphorina citri)体内的增殖及其对寄主植物的致病力差异依然不清楚。【目的】比较Type-2-CLas菌株和Type-1+3-CLas菌株在柑橘木虱体内的增殖能力和对砂糖橘(Citrus reticulata Blanco cv.Shatangju)的致病力差异。【方法】嫁接准备含有不同CLas菌株的砂糖橘,分别将50头柑橘木虱若虫和50头成虫放置到含有不同CLas菌株的砂糖橘嫩梢上刺吸获菌6、12、18 d,利用荧光定量PCR检测并统计柑橘木虱若虫期、成虫期对Type-2-CLas和Type-1+3-CLas的获菌率和获菌量差异。饲养分别携带Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的柑橘木虱种群,分别将携带Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的20头柑橘木虱成虫置于健康砂糖橘嫩梢上刺吸2周,移除木虱后统计柑橘木虱获菌率和获菌量,每月追踪砂糖橘症状变化和叶片病菌浓度,利用光学显微镜观察接种360 d时叶片韧皮部和薄壁细胞形态学变化情况。【结果】柑橘木虱以若虫形态对Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的获菌率和获菌量无显著差异,但柑橘木虱以成虫形态对Type-2-CLas的获菌率和获菌量显著高于Type-1+3-CLas菌株。在虫传后120 d时接种Type-2-CLas菌株的叶片附近新叶会呈现更严重的斑驳症状。Type-2-CLas菌株侵染砂糖橘一年后抽出的新叶转绿不正常,出现均匀黄化、小叶的明显症状,而Type-1+3-CLas菌株新叶症状则为典型斑驳和革质化。叶片解剖观察结果发现,在叶片病菌浓度相近的情况下,相比于接种了Type-1+3-CLas的叶片,接� 展开更多
关键词 柑橘黄龙病 候选韧皮部杆菌亚洲种 原噬菌体 柑橘木虱 致病力
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膜吸附法结合可视化环介导等温扩增技术检测柑橘黄龙病菌 被引量：4
3
作者 李镇希 李文婷 +3 位作者 黄家权 郑正 许美容 邓晓玲 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期74-84,共11页
【背景】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)侵染引起的一种柑橘病害。对于该病害的防治主要采取综合措施,包括实施检疫、种植无病苗木、及时挖除病树和集中大面积联... 【背景】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)侵染引起的一种柑橘病害。对于该病害的防治主要采取综合措施,包括实施检疫、种植无病苗木、及时挖除病树和集中大面积联防联控柑橘木虱等。前3种方法都需要依靠准确的柑橘黄龙病诊断技术。【目的】利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),结合膜吸附法DNA快速提取和Gelgreen荧光染料可视化,建立黄龙病田间核酸快速检测方法。【方法】以黄龙病菌β-操纵子与原噬菌体DNA聚合酶基因为模板设计LAMP特异性引物,包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP、环引物LoopF/LoopB和茎引物StemF/StemB。通过对环引物和茎引物设定不同的用量组合,对LAMP引物体系进行优化,确定合适的引物浓度。用优化后的LAMP引物体系对188份田间柑橘叶片进行检测,并构建受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析实时荧光LAMP(qLAMP)在CLas检测上的准确性。对qLAMP预混反应液进行两步的常温干燥,分别设定不同的存放条件,评估LAMP常温干燥试剂的稳定性。用本研究建立的CLas可视化LAMP快速检测方法,对田间71个柑橘叶片样品和35个柑橘果实样品进行检测,与实时荧光定量PCR(qPCR)比较两者的符合率。【结果】在LAMP体系中加入环引物、茎引物或增加其浓度都能促进反应速率的提升,并且同时加入终浓度均为1.6μmol·L-1的环引物和茎引物能进一步提高LAMP反应速率。LAMP预混液通过两步法干燥在不同温度存放1—4周均能保持反应活性基本不变,表明制备的两步法干燥LAMP试剂检测性能较好,在低温和常温环境下的稳定性尚可,仅35℃高温存放会略微增加LAMP试剂的反应时间。使用孔径0.1μm尼龙膜代替纤维素滤纸作为核酸吸附材料能提升CLas快速诊断技术的灵敏度。结合DNA快速提� 展开更多
关键词 柑橘黄龙病 候选韧皮部杆菌亚洲种 田间检测 膜吸附法 DNA快速提取 可视化环介导等温扩增技术
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马蜂柑响应黄龙病菌不同侵染时期的生物学和转录组学分析 被引量：5
4
作者 滕彩玲 钟晰 +3 位作者 吴昊娣 胡燕 周常勇 王雪峰 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期1368-1380,共13页
【目的】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是制约柑橘产业发展的重大病害,我国发生的黄龙病由韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)引起。本研究通过分析潜在耐黄龙病柑橘品种马蜂柑(Citrus hystrix)在感染黄龙... 【目的】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是制约柑橘产业发展的重大病害,我国发生的黄龙病由韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)引起。本研究通过分析潜在耐黄龙病柑橘品种马蜂柑(Citrus hystrix)在感染黄龙病后不同时期的生物学症状、显微结构和转录组学差异,揭示马蜂柑不同时期对黄龙病菌具有耐性的分子机理,为进一步深入挖掘抗性基因及开展抗病育种打下基础。【方法】以嫁接在两年生卡里佐枳橙砧木上的马蜂柑作为供试材料,使用只感染CLas、其他常见柑橘病毒类病原均呈阴性的毒源为接毒材料对马蜂柑进行接种,并在接种毒源后每隔15 d进行定期的荧光定量PCR检测。将马蜂柑接种毒源4个月(最早检测到CLas阳性)作为感病前期处理,接种毒源14个月作为感病后期处理,以健康植株为对照,进行生物学症状和显微结构观察,分析其感病后不同时期的结构变化。结合比较转录组学分析与荧光定量PCR验证,解析其耐病相关机制。【结果】症状观察发现,马蜂柑在感病前期和感病后期,植株叶片几乎不显症;显微结构观察表明,马蜂柑在感病前期中脉组织结构清晰,细胞形态正常,无淀粉粒积累的现象,仅在后期出现韧皮部极少数的筛管被堵塞;对转录组测序结果进行筛选鉴定,马蜂柑感病前期共筛选鉴定到181个差异表达基因,感病后期共筛选鉴定到1384个差异表达基因;比较转录组分析表明,马蜂柑感病前期和后期的差异表达基因主要涉及细胞壁代谢、防御反应、淀粉与蔗糖代谢、胼胝质合成以及信号转导等方面,其中在感病前期,淀粉与蔗糖代谢、细胞壁代谢相关的调控基因下调表达,在感病后期,水杨酸代谢及其信号转导途径、病程相关蛋白和谷胱甘肽转移酶相关的调控基因上调表达。【结论】马蜂柑响应CLas早期侵染主要表现为物理结构稳定、淀� 展开更多
关键词 柑橘黄龙病 韧皮部杆菌亚洲种 马蜂柑 耐病性 转录组
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柑橘SAR及其信号转导基因CsSABP2在黄龙病菌侵染中的响应特征 被引量：3
5
作者 赵珂 郑林 +4 位作者 杜美霞 龙俊宏 何永睿 陈善春 邹修平 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第8期1638-1652,共15页
【背景】柑橘系统获得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)在柑橘抗黄龙病(Huanglongbing,HLB)过程中起着重要作用。水杨酸(SA)和水杨酸甲酯(MeSA)信号互换是激活植物SAR的关键信号转导途径,但其在抗HLB危害中的作用依然不清楚。... 【背景】柑橘系统获得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)在柑橘抗黄龙病(Huanglongbing,HLB)过程中起着重要作用。水杨酸(SA)和水杨酸甲酯(MeSA)信号互换是激活植物SAR的关键信号转导途径,但其在抗HLB危害中的作用依然不清楚。【目的】以柑橘HLB不同耐病品种为材料,研究柑橘SAR及其信号转导的关键酶基因CsSABP2(salicylic acid binding protein 2)在HLB病原菌‘Candidatus Liberibacter asiaticus’(CLas)侵染中的响应特征,了解柑橘SAR及CsSABP2响应CLas侵染的作用。【方法】从SAR Marker基因CsPR1、CsPR2、CsPR5表达、活性氧H_(2)O_(2)水平和淀粉含量变化等方面分析CLas侵染、外施SA和MeSA调控柑橘SAR的特征。进一步,基于易感HLB锦橙(Citrus sinensis)和耐HLB酸柚(C.grandis)感染CLas转录组测序比较分析,筛选和克隆响应CLas侵染的CsSABP2差异表达基因;生物信息学分析预测差异基因的生物学功能;qRT-PCR分析差异表达基因在锦橙、酸柚和耐HLB马蜂柑(C.hystrix)中响应CLas感染的表达变化;以锦橙叶片为试材分析差异表达基因响应外源SA和MeSA诱导的表达特征。【结果】SAR Marker基因响应CLas表达分析表明,CsPR1、CsPR2和CsPR5均正向响应CLas侵染上调表达,CsPR2和CsPR5在酸柚和马蜂柑中表达水平高于锦橙,特别是叶肉中两个基因的表达水平均显著高于锦橙;相反,CsPR1在叶脉中上调表达水平明显高于叶肉,且在锦橙叶脉中表达水平显著高于酸柚和马蜂柑叶脉中。离体模拟SA和MeSA调控柑橘SAR反应显示,与SA处理相比,MeSA处理明显诱导CsPR1、CsPR2和CsPR5上调表达,同时非处理部位基因(特别是CsPR5)表达水平也明显上调。H_(2)O_(2)检测结果表明,外源MeSA诱导非处理部位H_(2)O_(2)积累显著强于SA。同时,通过对外施MeSA、SA的感病叶片进行连续5周的淀粉含量检测,发现MeSA能明显减少感病叶片中淀粉的积累。进一步转录组数据和生物信息学分析表� 展开更多
关键词 柑橘黄龙病 韧皮部杆菌亚洲种 系统获得性抗性 水杨酸 水杨酸甲酯 SABP2 基因表达
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广西柑橘黄龙病发生情况及黄龙病菌的遗传多样性分析 被引量：4
6
作者 高方栏 耿雪欣 +2 位作者 张木清 何新华 邹承武 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期128-138,共11页
【目的】了解广西柑橘主产区黄龙病(Huanglongbing,HLB)危害情况及黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas)的遗传多样性,为黄龙病的田间诊断和科学防控提供参考。【方法】对广西柑橘主产区8个地级市有代表性的柑橘园进行2... 【目的】了解广西柑橘主产区黄龙病(Huanglongbing,HLB)危害情况及黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas)的遗传多样性,为黄龙病的田间诊断和科学防控提供参考。【方法】对广西柑橘主产区8个地级市有代表性的柑橘园进行2个年度(2020和2021年)的跟踪调查并随机采集1048份柑橘叶片样品,利用qPCR技术对采集的样品进行CLas检测,并对阳性样品CLas菌株的基因组高变区的扩增产物进行测序,分析CLas菌株的遗传多样性。【结果】与2020年相比,除采自百色的柑橘样品CLas检出率2个年度保持不变(14.29%)外,2021年采自玉林、桂林、河池、梧州、南宁、贺州和来宾的柑橘样品CLas检出率均呈上升趋势,其中2021年采自梧州的柑橘样品CLas检出率最高(52.94%)。不同种类柑橘的CLas检出率差异明显,2021年甜橙类、柚类、杂交柑类和金柑类的样品CLas检出率均较2020年升高,2个年度的宽皮柑橘类CLas检出率相同(14.29%)。不同症状类型的柑橘样品CLas检出率也存在较大差异,其中2021年采集的缺素黄化型样品CLas检出率最高(61.64%),其次是均匀黄化型(24.00%)和褪绿斑驳型(20.00%),无症状样品的CLas检出率亦高达11.54%,均较2020年的检出率增加。通过对CLas基因组高变区的PCR产物进行测序,发现CLas菌株存在丰富的遗传多样性,37株CLas菌株可聚为7个类群,与寄主柑橘的种类有一定关系,但其与症状类型及地理来源无明显的相关性。【结论】不同年份、地理来源、柑橘种类和症状类型的CLas检出率差异较大,且发病率有逐年上升趋势。田间缺素黄化型植株确诊为感染黄龙病的概率最大,其次是均匀黄化型和褪绿斑驳型,无症状植株也有很大概率感染黄龙病。CLas菌株存在丰富的遗传多样性,与寄主柑橘的种类有一定关系,但与症状类型及地理来源无明显的相关性。 展开更多
关键词 柑橘黄龙病 韧皮部杆菌亚洲种 检出率 遗传多样性
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长春花法尼基转移酶β-亚基基因的克隆及其在黄龙病菌感染过程中的表达分析
7
作者 李亚 王珠娜 《河南农业科学》 北大核心 2019年第5期78-84,共7页
为了探讨长春花法尼基转移酶β-亚基(crFTB)在黄龙病菌侵染过程中的表达模式及作用,采用RACE技术扩增长春花 crFTB 基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术检测叶片组织中 crFTB 在黄龙病菌(CLas)侵染长春花... 为了探讨长春花法尼基转移酶β-亚基(crFTB)在黄龙病菌侵染过程中的表达模式及作用,采用RACE技术扩增长春花 crFTB 基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术检测叶片组织中 crFTB 在黄龙病菌(CLas)侵染长春花不同时间点的表达变化。结果显示, crFTB cDNA全长为1 826 bp,包含150 bp 5′UTR、308 bp 3′UTR和1 368 bp开放阅读框,编码455个氨基酸,理论分子质量和等电点分别为50.45 ku和4.67。FTB蛋白在物种间有较好的保守性,系统进化树表明,crFTB与油橄榄樟子松变种FTB蛋白的亲缘关系最近。CLas侵染长春花过程中, crFTB 在叶片组织中的表达量呈现先升后降的模式,从接种后4 d开始 crFTB 基因的表达量升高,到24 d时达到峰值,然后表达量开始下降,直到试验结束时仍显著高于健康植株中 crFTB 基因的表达量。分析认为,crFTB在长春花抵抗CLas侵染过程中起重要作用。 展开更多
关键词 长春花 法尼基转移酶β-亚基 基因克隆 黄龙病菌 表达模式
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