克雷伯氏菌产1,3-丙二醇ldhA基因缺失菌株的构建 被引量：7

1

作者 陈利飞 李猛 +1 位作者 马春玲 杨建楼 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期121-126,共6页

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)甘油歧化发酵生产1,3-丙二醇(1,3-PD)的过程中,乳酸是氧化途径最主要的副产物,乳酸的产生和积累,不仅限制了菌体本身的生长,而且严重影响了1,3-丙二醇的转化率。利用λRed重组技术对Klebsiella pneumo... 克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)甘油歧化发酵生产1,3-丙二醇(1,3-PD)的过程中,乳酸是氧化途径最主要的副产物,乳酸的产生和积累,不仅限制了菌体本身的生长,而且严重影响了1,3-丙二醇的转化率。利用λRed重组技术对Klebsiella pneumonia中的酶乳酸脱氢酶基因(ldhA)进行改造。在λRed重组系统作用下,将带有300 bp的线性同源片段ldhA1-Cm-ldh A2与基因组DNA的同源重组,经过抗性筛选和PCR鉴定最终获得了ldhA基因缺失菌株K.pneumonia2-1ΔldhA。经过24 h发酵可知,乳酸最大产出浓度由原来的10.16 g/L降为0.49 g/L,1,3-PD由原来的78.83 g/L增长为85.76 g/L,甘油转化率由60.64%增长到65.97%,提高了5.33%。 展开更多

关键词 克雷伯氏菌 ldhA基因 λred同源重组 1 3-丙二醇

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原核微生物基因敲除策略的研究进展 被引量：4

2

作者 阳燕 杨英明 胡涛 《国际口腔医学杂志》 CAS 北大核心 2016年第5期578-583,共6页

基因敲除是一项20世纪80年代末发展起来的新型分子生物学技术,在微生物领域的机制和功能研究中,具有极其重要的意义。经过数十年的发展,基因敲除技术从最传统的同源重组策略发展出λRed重组系统、Crelox P重组系统等方法,近年又诞生了... 基因敲除是一项20世纪80年代末发展起来的新型分子生物学技术,在微生物领域的机制和功能研究中,具有极其重要的意义。经过数十年的发展,基因敲除技术从最传统的同源重组策略发展出λRed重组系统、Crelox P重组系统等方法,近年又诞生了成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9等基于核酸内切酶原理的高效打靶技术,将微生物基因功能研究推向新的高度和方向。本文就这些应用于原核微生物的基因敲除策略的原理、现状和前景等研究进展作一综述。 展开更多

关键词 基因敲除 聚合酶链反应 连接诱变技术 λred重组系统 Cre-loxP重组系统 成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9技术

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大肠杆菌中dctA基因敲除及其苹果酸摄取功能鉴定 被引量：4

3

作者 姜巨全 张正来 +1 位作者 徐桐 孟琳 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期45-52,共8页

大肠杆菌(Escherichia coli)K12基因组中,仅dctA基因编码1个在有氧条件下负责摄取四碳-二羧酸的转运蛋白。为鉴定Dct A能否摄取四碳-2-羟基羧酸(如苹果酸),首先以p KD3为模版PCR扩增含有氯霉素抗性dctA基因同源臂,电转入E.coli K12/p K... 大肠杆菌(Escherichia coli)K12基因组中,仅dctA基因编码1个在有氧条件下负责摄取四碳-二羧酸的转运蛋白。为鉴定Dct A能否摄取四碳-2-羟基羧酸(如苹果酸),首先以p KD3为模版PCR扩增含有氯霉素抗性dctA基因同源臂,电转入E.coli K12/p KD46感受态细胞,筛选具有氯霉素抗性的基因敲除突变株E.coliΔdctA/p KD46。通过消除质粒p KD46构建大肠杆菌dctA基因敲除突变株E.coliΔdctA。构建dctA基因表达载体p Easy T3-dctA。通过苹果酸摄取功能互补试验,证实基因敲除菌株E.coliΔdctA丧失摄取苹果酸功能,四碳-二羧酸摄取蛋白Dct A具有摄取苹果酸功能。研究首次报道Dct A具有摄取苹果酸功能,该基因敲除突变株的构建可为其他菌株来源2-HCT转运蛋白的基因克隆与功能分析奠定基础。 展开更多

关键词 大肠杆菌K12 dctA λred重组 基因敲除 四碳-2-羟基羧酸

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一种利用λRed重组技术在杀鱼爱德华氏菌基因组添加标签的方法

4

作者 张淑雅 李端友 +3 位作者 刘莹莉 贺甜甜 聂品 谢海侠 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期895-902,共8页

在杀鱼爱德华氏菌病原学研究中,在动物中制备杀鱼爱德华氏菌蛋白抗体耗时长,且获得的多克隆或多肽抗体在宿主细胞中特异性差,背景信号强。为解决这一问题,对在大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌(Salmonella)中建立起来的λRed基因... 在杀鱼爱德华氏菌病原学研究中,在动物中制备杀鱼爱德华氏菌蛋白抗体耗时长,且获得的多克隆或多肽抗体在宿主细胞中特异性差,背景信号强。为解决这一问题,对在大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌(Salmonella)中建立起来的λRed基因编辑方法进行调整和优化,建立了在杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)基因组基因上添加HA标签序列的方法,为使用标签抗体研究杀鱼爱德华氏菌基因功能提供便利。λRed重组系统利用同源线性DNA片段与基因组DNA进行重组。即以质粒pSU315为模板,在引物上引入目的基因的特异性序列,扩增FRT序列和抗生素抗性基因;以获得的PCR产物转化携带pKD46的杀鱼爱德华氏菌,在pKD46表达的λ噬菌体的3个重组蛋白(Exo、Beta和Gam)作用下,PCR产物与杀鱼爱德华氏菌基因组发生同源重组,获得引入了抗生素抗性的靶基因缺失或靶基因携带标签序列的菌株;接着利用pKD46的温敏型特性,消除引入的pKD46;最后向杀鱼爱德华氏菌引入文章构建的表达Flp重组酶的质粒pKD46-flp,在FLP作用下,两个FRT位点之间发生重组,消除抗生素抗性基因和一个FRT位点,获得携带一个FRT位点序列、靶基因缺失或靶基因添加标签序列的杀鱼爱德华氏菌菌株。该遗传操作平台的建立为杀鱼爱德华氏菌基因功能研究提供便利条件,亦为其他水产病原细菌遗传操作方法的建立提供借鉴。 展开更多

关键词 λred重组 基因组基因标签序列添加 pKD46-flp 杀鱼爱德华氏菌

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克雷伯氏菌产1,3-丙二醇aldH基因缺失菌株的构建 被引量：2

5

作者 杨建楼 郑海杰 +2 位作者 马春玲 王瑞明 陈利飞 《中国酿造》 CAS 北大核心 2016年第4期56-60,共5页

该研究利用λRed重组技术对克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)中的乙醛脱氢酶(ald H)基因进行敲除,成功构建缺失菌株K.pneumonia2-1Δald H,与原始菌株相比,缺失菌株K.pneumonia2-1Δald H发酵液中乙醇产量由原来的7.24 g/L降为0.47 g/L... 该研究利用λRed重组技术对克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)中的乙醛脱氢酶(ald H)基因进行敲除,成功构建缺失菌株K.pneumonia2-1Δald H,与原始菌株相比,缺失菌株K.pneumonia2-1Δald H发酵液中乙醇产量由原来的7.24 g/L降为0.47 g/L,降低了93.51%;1,3-丙二醇产量由原来的78.83 g/L增长至82.55 g/L,提高了4.72.%;甘油转化率由60.64%增长至63.50%,提高了2.86%。缺失菌株K.pneumonia2-1Δald H 50 L发酵罐小试试验中,1,3-丙二醇的产量为78.13 g/L,乙醇产量为0.50 g/L。 展开更多

关键词 克雷伯氏菌 1 3-丙二醇 aldH基因 λred同源重组

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大肠杆菌Zn2+敏感突变株构建及其功能验证

6

作者 王玉婷 徐桐 +1 位作者 华贝杰 姜巨全 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期2538-2549,共12页

【背景】Zn^(2+)在细胞解毒及许多生理过程中发挥着关键作用,Zn^(2+)转运蛋白已逐渐引起人们的重视。在大肠杆菌中,zntA和zitB是2个外排Zn^(2+)的关键基因。【目的】构建大肠杆菌Zn^(2+)敏感突变株,并对其功能进行验证。【方法】以Esche... 【背景】Zn^(2+)在细胞解毒及许多生理过程中发挥着关键作用,Zn^(2+)转运蛋白已逐渐引起人们的重视。在大肠杆菌中,zntA和zitB是2个外排Zn^(2+)的关键基因。【目的】构建大肠杆菌Zn^(2+)敏感突变株,并对其功能进行验证。【方法】以Escherichia coli DH5α为出发菌株,利用λRed重组系统,通过携带卡那霉素抗性基因的同源重组片段敲除zntA基因。在单基因敲除菌株基础上,利用携带庆大霉素抗性基因的同源重组片段敲除zitB基因,获得一株敲除了zntA和zitB的双基因敲除菌株KZAB04。通过功能互补实验检测基因敲除菌株及对照菌株对不同浓度Zn^(2+)的敏感程度。【结果】基因敲除菌株KZAB04比出发菌株E.coli DH5α具有更高的Zn^(2+)敏感性。【结论】大肠杆菌Zn^(2+)敏感突变株构建成功。该菌株的构建为zntA和zitB基因功能的研究提供了必要条件,同时也为其他Zn^(2+)转运蛋白基因的功能鉴定与分析奠定了基础。 展开更多

关键词 基因敲除 λred重组 Zn2+转运蛋白 zntA zitB

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尿道致病性大肠埃希菌新基因R049的敲除

7

作者 杨东靖 张维 +3 位作者 苏旭 李力 吕莉琨 陈锦英 《环境与健康杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期693-696,共4页

目的探讨尿道致病性大肠埃希菌(uropathogenic E.coli,UPEC)132株新基因R049的敲除,构建R049缺失突变株。方法对基因敲除所需的质粒pKD46和pCP20分别进行抗生素抗性改造,在其bla基因(Amp)r中插入带有启动子的Zeocin抗性基因(zeo),使其... 目的探讨尿道致病性大肠埃希菌(uropathogenic E.coli,UPEC)132株新基因R049的敲除,构建R049缺失突变株。方法对基因敲除所需的质粒pKD46和pCP20分别进行抗生素抗性改造,在其bla基因(Amp)r中插入带有启动子的Zeocin抗性基因(zeo),使其均具有Zeocin抗性(Zeo)r。然后进行Red同源重组,利用pKD46(Zeo)r携带的λ噬菌体重组酶将氯霉素抗性基因替换UPEC132基因组的R049基因,再利用pCP20(Zeo)r携带的FLP重组酶消除氯霉素抗性标记,在染色体上只保留1个FRT位点。结果质粒pKD46和pCP20抗生素抗性改造完成,并利用Red同源重组完成了对UPEC132的R049基因的敲除。结论构建了尿道致病性大肠埃希菌R049缺失突变株UPEC132ΔR049,为进一步对R049基因的功能研究奠定基础。 展开更多

关键词 尿道致病性大肠埃希菌 red同源重组 基因敲除

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工业微生物代谢途径调控的基因敲除策略 被引量：17

8

作者 于慧敏 马玉超 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期1199-1208,共10页

基因敲除技术是一项重要的分子生物学技术,在工业微生物代谢工程中具有广泛应用。以下从基因敲除技术的遗传重组原理出发,总结了基因敲除策略的类型、特征和应用,重点介绍了采用线性双链DNA的λRed同源重组系统、使用环状质粒载体介导... 基因敲除技术是一项重要的分子生物学技术,在工业微生物代谢工程中具有广泛应用。以下从基因敲除技术的遗传重组原理出发,总结了基因敲除策略的类型、特征和应用,重点介绍了采用线性双链DNA的λRed同源重组系统、使用环状质粒载体介导的单交换或双交换同源重组策略以及采用转座酶介导的转座重组等几种主要的基因敲除方法,进一步展望了基因敲除技术的发展前沿和应用前景。 展开更多

关键词 基因敲除 λred重组系统 单交换和双交换 同源重组 转座重组

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大肠杆菌基因无痕敲除技术及策略 被引量：11

9

作者 胡逢雪 丁锐 +4 位作者 崔震海 于金龙 刘丽霏 敖永华 张立军 《生物技术通讯》 CAS 2013年第4期552-557,共6页

基因敲除技术是大肠杆菌基因组减小和代谢途径改造的有效手段,其中基于同源重组原理的基因无痕敲除技术显现出其他技术所不具备的应用优势和发展潜力。该技术可以快速敲除大肠杆菌基因组中的目标基因,并且在基因组中不残留任何外源片段... 基因敲除技术是大肠杆菌基因组减小和代谢途径改造的有效手段,其中基于同源重组原理的基因无痕敲除技术显现出其他技术所不具备的应用优势和发展潜力。该技术可以快速敲除大肠杆菌基因组中的目标基因,并且在基因组中不残留任何外源片段,所以不会干扰后续的基因操作。我们分类介绍了无痕敲除技术中所涉及载体的结构、功能及其相应的敲除策略,着重介绍了无痕敲除技术的原理及载体构建方法。 展开更多

关键词 大肠杆菌 基因无痕敲除 基因替换 red重组系统 代谢工程

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禽致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH基因缺失突变株的构建及部分生物学特性的分析 被引量：10

10

作者 何素芬 原志伟 朱国强 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期252-256,共5页

基于禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因的已知序列,利用λ噬菌体的Red重组系统构建禽致病性大肠杆菌国内分离株A2(血清型02:K89)Ⅰ型菌毛黏附素.fimH基因缺失突变株A2△fimH∷Cat,在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶的质... 基于禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因的已知序列,利用λ噬菌体的Red重组系统构建禽致病性大肠杆菌国内分离株A2(血清型02:K89)Ⅰ型菌毛黏附素.fimH基因缺失突变株A2△fimH∷Cat,在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20(温度敏感性)以去除上述缺失突变株中抗性基因标志,结合PCR扩增和测序结果,证明.fimH基因缺失株A2ΔfimH的正确构建。通过fimH基因互补试验使A2ΔfimH缺失突变株恢复了与野生株具有相同的凝集活性。红细胞和酵母细胞凝集试验结果表明,野生株呈现良好的凝集效果,并能被0.5%甘露糖完全抑制,而A2△fimH缺失突变株未呈现任何凝集现象。体外生长试验结果表明,在同样的培养条件下,A2△fimH缺失突变株生长周期的各个阶段都要稍慢于野生株。禽致病性大肠杆菌国内分离株Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因缺失突变株成功构建,为进一步深入研究禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛与机体相互作用的分子机制,肠道外感染的致病机理及对国内禽大肠杆菌病的防控策略奠定了一定基础。 展开更多

关键词 red重组系统 Ⅰ型菌毛 fimH基因 生物学特性

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利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌rfaH基因 被引量：6

11

作者 姜娜 王芃 +5 位作者 王艳春 袁盛凌 展德文 陶好霞 王令春 刘纯杰 《生物技术通讯》 CAS 2009年第2期173-176,共4页

目的:利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌的rfaH基因。方法:以伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi Ty2,S.ty2)基因组为模板扩增得到的同源臂,与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段共同构建同源重组载体;以重组载体为模板扩增打靶片段,... 目的:利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌的rfaH基因。方法:以伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi Ty2,S.ty2)基因组为模板扩增得到的同源臂,与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段共同构建同源重组载体;以重组载体为模板扩增打靶片段,将其转化S.ty2;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,打靶片段和菌体基因组发生同源重组,通过卡那抗性筛选得到带有抗性标记的重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以去除抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;通过PCR鉴定重组菌,并经透射电子显微镜分析表型。结果:在S.ty2中敲除了rfaH基因,经PCR扩增和序列测定正确;初步的表型分析表明突变体的鞭毛合成显著减少。结论:获得了S.ty2突变株,为将沙门氏菌进一步减毒成为疫苗表达载体奠定了基础。 展开更多

关键词 伤寒沙门氏菌 λred重组系统 rfaH基因 基因敲除

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利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因 被引量：6

12

作者 王强 郭忠建 +2 位作者 姚勤 王海燕 陈克平 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期801-805,共5页

用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPVorf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPVbacmid,将其电转化到含有质粒pKD46(能表达Red重组酶)的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于B... 用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPVorf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPVbacmid,将其电转化到含有质粒pKD46(能表达Red重组酶)的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物(5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列),以pKD3质粒(含cat)为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPVbacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPVorf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。 展开更多

关键词 red重组系统 orf60 基因敲除

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利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因 被引量：5

13

作者 李晔 张西轩 +3 位作者 郭梦征 王素英 张坤生 阮海华 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期171-177,共7页

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的(Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,S.typhimurium LT2)sopB基因。以pKD4质粒为模板,扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打... 利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的(Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,S.typhimurium LT2)sopB基因。以pKD4质粒为模板,扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打靶片段,将其转化至表达Red重组酶的S.typhimurium LT2感受态细胞中;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,同源片段和菌体sopB基因发生同源重组,通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;利用PCR技术鉴定重组菌,并通过检测沙门氏菌效应蛋白SopB的分泌以及沙门氏菌感染HeLa细胞后pAKT的激活反应来鉴定sopB基因是否被敲除。构建的ΔsopB突变菌株失去了分泌SopB蛋白的能力,且不能够像野生型菌株那样在感染HeLa细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S.typhimurium LT2的sopB基因缺失突变株,为沙门氏菌感染宿主过程中SopB的功能研究提供工具,同时也为进一步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索。 展开更多

关键词 鼠伤寒沙门氏菌LT2λred 重组系统 sopB 基因敲除 同源重组

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一种基于温敏质粒的新型基因敲除方法 被引量：2

14

作者 姜娜 王艳春 +2 位作者 马志宏 罗琳 刘纯杰 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期85-89,共5页

基于温敏型质粒而不用线性DNA的方法用于快速敲除沙门氏菌染色体上的目的基因。以伤寒沙门氏菌S.ty2基因组为模板扩增得到的ssaV基因的上下游同源臂,与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段连接到温敏型质粒pHY304,共同构建同源重组载... 基于温敏型质粒而不用线性DNA的方法用于快速敲除沙门氏菌染色体上的目的基因。以伤寒沙门氏菌S.ty2基因组为模板扩增得到的ssaV基因的上下游同源臂,与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段连接到温敏型质粒pHY304,共同构建同源重组载体;然后转化S.ty2,通过筛选得到带有抗性标记的重组菌。通过转入重组酶表达质粒pCP20,去除抗性标记,得到ssaV基因缺失的重组菌,并在DNA水平进行了鉴定。建立了一种改进的基于温敏质粒的沙门氏菌的基因敲除方法,此方法也值得在其他革兰氏阴性菌的基因敲除中尝试应用。 展开更多

关键词 伤寒沙门氏菌 温敏质粒 λred重组系统 ssaV 基因敲除

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一种快速筛选海藻糖合成酶突变体体系的建立 被引量：1

15

作者 李庆业 韦宇拓 +2 位作者 王倩倩 刘一 黄日波 《工业微生物》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期22-26,共5页

利用λRed重组系统对大肠杆菌JM109的6-磷酸海藻糖合成酶基因OtsA和6-磷酸海藻糖酯酶基因otsB进行敲除,获得otsA和otsB基因失活的大肠杆菌突变体,该突变体由于对渗透压变得非常敏感,在含5%NaCl和0.5%麦芽糖的培养基中生长缓慢,然而当导... 利用λRed重组系统对大肠杆菌JM109的6-磷酸海藻糖合成酶基因OtsA和6-磷酸海藻糖酯酶基因otsB进行敲除,获得otsA和otsB基因失活的大肠杆菌突变体,该突变体由于对渗透压变得非常敏感,在含5%NaCl和0.5%麦芽糖的培养基中生长缓慢,然而当导入有活力的外源海藻糖合成酶基因后,由于能在胞内合成海藻糖,增强了细胞抗高渗透压培养基的能力,因而可让otsA和otsB基因缺失后的JM109得以恢复其生长能力。通过比较它们在高渗透压的培养基中的生长速度,可以筛选出含有不同活力的海藻糖合成酶突变体。 展开更多

关键词 λred重组系统 海藻糖合成酶基因 基因缺失

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λRed重组系统用于沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株的构建 被引量：1

16

作者 高嵩 燕婧 +2 位作者 储元元 李嫄渊 吴淑燕 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期367-371,共5页

[目的]利用λRed重组系统敲除沙门菌质粒毒力基因spvC。[方法]首先以质粒p KD4为模板,扩增得到两侧含spvC同源臂、中间为卡那霉素抗性基因的线性DNA片段。再将此线性片段电转入具重组功能的感受态沙门菌菌株,发生重组后,卡那霉素平板筛... [目的]利用λRed重组系统敲除沙门菌质粒毒力基因spvC。[方法]首先以质粒p KD4为模板,扩增得到两侧含spvC同源臂、中间为卡那霉素抗性基因的线性DNA片段。再将此线性片段电转入具重组功能的感受态沙门菌菌株,发生重组后,卡那霉素平板筛选阳性转化子。最后利用表达FLP重组酶的质粒p CP20,将FRT位点之间的卡那霉素抗性基因消除,用PCR鉴定。Western Blot检测野生沙门菌和spvC敲除株感染的He La细胞ERK磷酸化水平。[结果]沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株构建成功,spvC敲除株感染的He La细胞内ERK磷酸化水平升高。[结论]成功构建沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株,验证了spvC基因的功能。 展开更多

关键词 λred重组系统 沙门菌 SPVC 基因敲除 质粒

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肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espG基因缺失株的构建及其生物学特性分析 被引量：1

17

作者 延凯娜 王湘雨 万成松 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2020年第10期1144-1150,共7页

目的利用λRed重组系统构建肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espG基因缺失株,并研究其生物特性,对EspG蛋白进行初步生物信息学分析。方法设计并合成一对同源臂引物,每条引物5’端与espG基因同源,3’端与卡那霉素抗性基因同源,扩增卡那霉素抗... 目的利用λRed重组系统构建肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espG基因缺失株,并研究其生物特性,对EspG蛋白进行初步生物信息学分析。方法设计并合成一对同源臂引物,每条引物5’端与espG基因同源,3’端与卡那霉素抗性基因同源,扩增卡那霉素抗性基因片段,制备含有pKD46质粒的EHEC O157:H7 EDL933w感受态细菌。将该抗性基因片段电击转化入制备的感受态菌株中,利用pKD46介导的Red重组系统,通过同源重组替换EHEC O157:H7 EDL933w espG基因,经PCR和测序验证后,通过革兰染色、测A600值、姬姆萨染色比较EHEC O157:H7 EDL933w野生株(Wild type,WT)与突变株的形态结构、生长能力和黏附性的差异性。以EDL933w菌株为研究对象,用在线软件VaxiJen v2.0对EspG蛋白抗原性进行评分,在ProParam软件中分析EspG蛋白序列的基本理化性质,利用SOPMA软件进行二级结构预测,采用SWISS-Model预测三级结构,通过Bcepred软件对EspG蛋白序列B抗原表位进行预测分析。结果PCR及序列分析证实构建了espG基因缺失并含有卡那霉素抗性的EHEC O157:H7 EDL933w突变菌株,野生株与突变株均为革兰染色阴性短棒状杆菌,野生株对Caco2细胞的黏附率明显高于突变株(P<0.01)。应用Bcepred等软件对EspG蛋白表位参数综合分析,预测到10条B细胞潜在优势抗原表位。结论构建了肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espG基因缺失株,探索了EHEC O157:H7 EDL933w野生株与突变株的生物学特性,为进一步研究肠出血型大肠埃希菌LEE毒力岛中espG基因的调控机制提供实验基础。明确了EspG蛋白二三级结构以及其生物信息学特性,为优势表位的鉴定和筛选奠定了基础。 展开更多

关键词 肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espG基因 λred重组系统 B细胞表位 生物信息学

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BmNPV or f98对家蚕核型多角体杆状病毒复制、转录及包装的影响 被引量：1

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作者 史利利 蒋彩英 +4 位作者 于威 陈琛 蒋磊 巩成见 童富淡 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期623-630,共8页

为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)基因orf98的功能,通过λRed重组系统定点敲除BmNPVorf98基因,构建缺失型重组病毒Bm98-ko-Bacmid;以Bac-to-Bac系统补回BmNPVorf98基因,构建补回型重组病毒Bm98-re-B... 为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)基因orf98的功能,通过λRed重组系统定点敲除BmNPVorf98基因,构建缺失型重组病毒Bm98-ko-Bacmid;以Bac-to-Bac系统补回BmNPVorf98基因,构建补回型重组病毒Bm98-re-Bacmid;将野生型病毒(wtBacmid)、缺失型病毒(Bm98-koBacmid)和补回型病毒(Bm98-re-Bacmid)分别转染家蚕细胞BmN。病毒滴度检测结果显示,Bm98-ko-Bacmid可形成侵染性的病毒粒子,但数量显著降低(P<0.05).透射电子显微镜观察发现,Bm98-ko-Bacmid只产生游离的杆状病毒粒子,数量明显减少,而wtBacmid和Bm98-re-Bacmid产生大量具有囊膜结构的成熟病毒粒子。荧光定量聚合酶链反应分析结果表明,BmNPVorf98基因缺失对BmNPV病毒复制没有影响,而早期基因lef3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平显著降低(P<0.05)。综上所述,BmNPVorf98基因对病毒复制是非必需的,但显著影响病毒的繁殖速度和包装(P<0.05);对病毒各个时期的基因转录也具有重要影响。 展开更多

关键词 家蚕核型多角体病毒 λred重组系统 BAC-TO-BAC系统 病毒复制 基因转录

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利用重组工程技术标记鼠疫菌rpoS基因

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作者 张建山 陈泽良 +5 位作者 宋亚军 郭兆彪 王津 王红霞 翟俊辉 杨瑞馥 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期27-32,共6页

目的:为便于研究鼠疫菌基因及其产物的功能,利用重组工程技术,建立一种表位标记细菌染色体基因的方法,以分析基因的表达规律。方法:将标签序列合成于引物中,通过融合PCR法将标签序列与抗性筛选基因连接,克隆到pBluescript载体,获得模板... 目的:为便于研究鼠疫菌基因及其产物的功能,利用重组工程技术,建立一种表位标记细菌染色体基因的方法,以分析基因的表达规律。方法:将标签序列合成于引物中,通过融合PCR法将标签序列与抗性筛选基因连接,克隆到pBluescript载体,获得模板载体pBSMH。设计与待标记基因末端及其下游同源的引物,从模板载体上扩增标签与抗性基因的融合模块,获得两端带同源区的PCR产物,电击转化鼠疫菌感受态细胞。在λRed重组系统的辅助下,标签和抗性基因重组到目的基因的下游,得到表位标签与目的基因C末端融合的重组子。利用针对表位标签的单克隆抗体进行Westernblot分析,验证C末端标记目的蛋白的表达。结果:成功构建了组氨酸标签与抗性基因融合的质粒,以该质粒作为模板,扩增标记标签盒,对鼠疫菌的rpoS基因进行了标记,利用针对组氨酸标签的抗体能够检测到rpoS基因的表达。结论:基于重组工程的基因标记技术可以为基因功能研究提供一个有价值的研究手段。 展开更多

关键词 融合PCR λred重组系统 基因标记 WESTERN BLOT

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家蚕核型多角体病毒Bm90基因缺失对病毒增殖和组装的影响

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作者 巩成见 田星 +4 位作者 蒋磊 于威 舒建洪 吴银丽 童富淡 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期458-465,共8页

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)基因组中的orf90基因(Bm90)是一个未知功能的保守基因。利用λRed重组系统和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒Wt Bacmid-polh-egfp、Bm90基因缺失型病毒Bm90ko-polh-egfpBacmi... 家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)基因组中的orf90基因(Bm90)是一个未知功能的保守基因。利用λRed重组系统和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒Wt Bacmid-polh-egfp、Bm90基因缺失型病毒Bm90ko-polh-egfpBacmid及Bm90基因补回型病毒Bm90re-polh-egfp-Bacmid,并制备Bm90蛋白的多克隆抗体,研究Bm90基因在病毒感染周期中的表达以及对病毒增殖和组装的影响。将3种重组病毒分别转染Bm N细胞,Western blot检测显示Bm90蛋白在病毒转染Bm N细胞后72 h有表达;但用荧光显微镜观察Bm90基因缺失型病毒转染的Bm N细胞中没有出现绿色荧光,且检测其病毒滴度为0;用透射电子显微镜观察在Bm90基因缺失型病毒转染的Bm N细胞中没有子代病毒粒子出现。研究结果表明,Bm90基因缺失会抑制子代病毒粒子的组装和产生,使病毒失去侵染性,Bm90基因是病毒增殖及组装的必需基因。 展开更多

关键词 家蚕核型多角体病毒 Bm90基因 λred重组系统 BAC-TO-BAC系统 病毒增殖 病毒组装

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