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大肠杆菌诺氟沙星超敏感多基因敲除株KYAH06构建与功能验证
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作者 姜巨全 宋阳 +1 位作者 Heba Abdel-Motaal 邹俏 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期49-55,86,共8页
以E.coli DH5α为出发菌株采用pKD46质粒提供λRed重组系统完成以下三步基因敲除:大肠杆菌中RND超家族多药物抗性蛋白acrAB基因并借助其与pKD3质粒的氯霉素抗性片段同源重组被敲除;大肠杆菌中MATE家族多药物抗性蛋白ydhE基因通过卡那霉... 以E.coli DH5α为出发菌株采用pKD46质粒提供λRed重组系统完成以下三步基因敲除:大肠杆菌中RND超家族多药物抗性蛋白acrAB基因并借助其与pKD3质粒的氯霉素抗性片段同源重组被敲除;大肠杆菌中MATE家族多药物抗性蛋白ydhE基因通过卡那霉素抗性筛选和蔗糖反向筛选被无痕敲除;大肠杆菌中主要负责诺氟沙星外排的MFS超家族转运蛋白mdtH基因通过与pK18mobSacB质粒中的抗性片段的同源重组被敲除。以上基因敲除不同程度导致大肠杆菌对诺氟沙星的敏感性变化,最终获得诺氟沙星敏感性为0.0125μg·mL^(-1)的E.coli KYAH06,为大肠杆菌MdtH详细转运机制以及其他诺氟沙星外排转运蛋白鉴定和功能分析奠定试验基础。 展开更多
关键词 诺氟沙星 λred重组系统 多药物逆向转运蛋白 AcrAB YdhE MdtH
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肠出血性大肠杆菌Ⅲ型分泌系统ATP水解酶escN基因突变株的构建
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作者 陈芳红 李涛 王慧 《生物技术通讯》 CAS 2015年第3期346-348,共3页
目的:利用λ噬菌体的Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的Ⅲ型分泌系统ATP水解酶Esc N,构建大肠杆菌esc N基因缺失突变株。方法:以O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列,分别酶切连接于p UC19-kan质粒上,PCR获得中间... 目的:利用λ噬菌体的Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的Ⅲ型分泌系统ATP水解酶Esc N,构建大肠杆菌esc N基因缺失突变株。方法:以O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列,分别酶切连接于p UC19-kan质粒上,PCR获得中间嵌合卡那霉素抗性基因(带有FRT位点)的同源线性片段,利用质粒p KD46和p CP20介导的重组技术敲除esc N基因,并去除抗性标记;PCR及测序验证目的基因缺失后,测定缺失株及野生菌株的生长曲线。结果:敲除了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的esc N基因,突变株与野生株的生长曲线相近。结论:构建了Ⅲ型分泌系统缺陷菌株,为进一步研究Ⅲ型分泌系统因子在肠出血性大肠杆菌致病过程中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 Ⅲ型分泌系统 red重组系统
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肠出血性大肠杆菌z5150毒素基因在细胞黏附过程中的作用
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作者 何志利 谭琳琳 +4 位作者 王建新 李崭 陈芳红 李涛 王慧 《军事医学》 CSCD 北大核心 2017年第12期978-982,共5页
目的通过体内过度表达验证z5150基因毒性,利用Red重组系统构建肠出血性大肠杆菌(EHEC)z5150基因缺失突变株并探究其致病力。方法在菌体内过度表达z5150基因,测定细菌生长曲线验证其毒性。应用PCR技术扩增出含有卡那霉素抗性基因的目的... 目的通过体内过度表达验证z5150基因毒性,利用Red重组系统构建肠出血性大肠杆菌(EHEC)z5150基因缺失突变株并探究其致病力。方法在菌体内过度表达z5150基因,测定细菌生长曲线验证其毒性。应用PCR技术扩增出含有卡那霉素抗性基因的目的基因上下游同源臂片段,电转入含有p KD46质粒的EHEC中,在阿拉伯糖诱导下使打靶片段重组到基因组。卡那霉素基因的两端包含FRT位点,p FLP2质粒可介导FLP位点专一性重组去除抗性标记。经DNA测序验证目的基因缺失后,通过菌株感染HT29细胞和BALB/c雌鼠检测缺失株细胞黏附能力和毒力的改变。结果与结论成功构建EHEC△z5150缺失突变株。z5150的缺失不影响细菌的正常生长,但过度表达后明显抑制细菌生长,发挥毒素效应。与野生株相比,EHEC△z5150缺失突变株对肠上皮细胞黏附能力明显增强;小鼠致死率增高,提示其致病力增强。该研究为EHEC基因功能研究提供了基因敲除技术,证明了Rel E家族z5150参与EHEC细胞黏附,并增强菌株毒力,为进一步研究EHEC致病机制奠定了基础。 展开更多
关键词 肠出血性大肠杆菌 red重组系统 毒素 REL E 致病性
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鸡白痢沙门菌sifA基因缺失株的构建及其生物学特性的研究 被引量:7
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作者 殷俊磊 徐黎娟 +4 位作者 王志鹏 蔺志杰 李求春 耿士忠 焦新安 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期345-351,共7页
为研究sifA基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,采用λ-red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌S06004株的sifA基因缺失株S06004ΔsifA,同时构建该基因缺失株的回补株S06004ΔsifA(pBR322-sifA),并对该缺失株的生长特性、生化特性、遗传稳定性和... 为研究sifA基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,采用λ-red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌S06004株的sifA基因缺失株S06004ΔsifA,同时构建该基因缺失株的回补株S06004ΔsifA(pBR322-sifA),并对该缺失株的生长特性、生化特性、遗传稳定性和毒力等生物学特性进行了研究。PCR和测序鉴定结果表明,成功构建了sifA基因缺失株S06004ΔsifA和该基因缺失株的回补株S06004ΔsifA(pBR322-sifA);生物学特性研究结果显示,sifA基因的缺失不影响鸡白痢沙门菌的生长特性和生化特性,且该缺失株具有良好的遗传稳定性,但其对3日龄雏鸡的LD50升高了39.3倍。本研究获得的减毒鸡白痢沙门菌sifA基因缺失株S06004ΔsifA为进一步研究鸡白痢沙门菌sifA基因的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 鸡白痢沙门菌 λ-red同源重组 sifA基因 生物学特性
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鸡白痢沙门菌S06004株致病岛-2缺失株的构建及其生物学特性 被引量:4
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作者 殷俊磊 吴颖斐 +5 位作者 蔺志杰 王晓春 胡亚辰 李求春 耿士忠 焦新安 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期1154-1159,共6页
【目的】了解致病岛-2(Salmonella Pathogenicity Island 2,SPI-2)对鸡白痢沙门菌致病性的影响,初步探讨研制安全有效的鸡白痢沙门菌减毒株的可行性。【方法】采用λ-red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌S06004株的SPI-2(约40 kb)缺失株S06... 【目的】了解致病岛-2(Salmonella Pathogenicity Island 2,SPI-2)对鸡白痢沙门菌致病性的影响,初步探讨研制安全有效的鸡白痢沙门菌减毒株的可行性。【方法】采用λ-red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌S06004株的SPI-2(约40 kb)缺失株S06004ΔSPI2。并与野生型相比较,对该缺失株的生长特性、生化特性、遗传稳定性和致病性等基本生物学特性进行鉴定。【结果】成功构建SPI-2缺失株S06004ΔSPI2,SPI-2的缺失不影响鸡白痢沙门菌的生长特性和生化特性,且该缺失株具有良好的遗传稳定性,其对2日龄雏鸡的LD50是野生株的252倍。【结论】SPI-2的缺失引起鸡白痢沙门菌毒力的明显下降,这为进一步研究鸡白痢沙门菌SPI-2的功能及制备减毒疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 鸡白痢沙门菌 λ-red同源重组 致病岛-2 生物学特性
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肠炎沙门氏菌rpoS基因缺陷株的构建及其生长特性观察 被引量:2
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作者 曾红亮 曾庆梅 +2 位作者 乔向欣 杨晋 刘坤 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2013年第8期690-694,共5页
目的利用λ-red同源重组系统构建食源性肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis,SE)CICC21482rpoS基因缺陷株SE/⊿rpoS,观察其在胁迫环境中的生长特性,以探讨rpoS基因的生物学作用。方法通过PCR扩增两侧为肠炎沙门氏菌rpoS基因同源臂,中... 目的利用λ-red同源重组系统构建食源性肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis,SE)CICC21482rpoS基因缺陷株SE/⊿rpoS,观察其在胁迫环境中的生长特性,以探讨rpoS基因的生物学作用。方法通过PCR扩增两侧为肠炎沙门氏菌rpoS基因同源臂,中间为卡那霉素抗性基因(kmr)的打靶片段,再电击转入含质粒pkD46的肠炎沙门氏菌中,替换rpoS基因,筛选阳性转化子SE/⊿rpoS并用PCR法验证。结果成功构建了肠炎沙门氏菌rpoS基因缺陷株。在常规LB培养基中37℃培养的缺陷株和野生株生长曲线差异无统计学意义(P>0.05);SE/⊿rpoS菌株在45℃、2%NaCl和pH4.0应激条件下的生存能力较野生株弱(P<0.05)。结论成功构建SE/⊿rpoS基因缺陷株。该基因在肠炎沙门氏菌克服高温、高渗、酸应激时被诱导表达从而发挥作用。此结果为进一步研究rpoS基因在应激过程中的作用机制提供了基础资料。 展开更多
关键词 肠炎沙门氏菌 λ-red重组系统 rpoS基因 基因敲除 生长特性
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减毒鸡白痢沙门菌△aroA株的构建与致病性分析 被引量:1
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作者 程伊洛 邵华斌 +2 位作者 罗青平 刘国平 张腾飞 《湖北农业科学》 2016年第23期6195-6199,共5页
以鸡白痢沙门氏菌c79-3强毒株为亲本,通过λ-red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌aroA基因缺失株△aroA,并进行了测序验证和毒力试验。结果表明,aroA基因缺失株的生长速度较亲本株缓慢,且该缺失株具有良好的遗传稳定性;相比野生菌株,aroA... 以鸡白痢沙门氏菌c79-3强毒株为亲本,通过λ-red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌aroA基因缺失株△aroA,并进行了测序验证和毒力试验。结果表明,aroA基因缺失株的生长速度较亲本株缓慢,且该缺失株具有良好的遗传稳定性;相比野生菌株,aroA基因缺失株的毒力发生了下降,雏鸡攻毒死亡率较亲本株低。本研究获得的减毒鸡白痢沙门氏菌aroA基因缺失株△aroA,为进一步研究鸡白痢沙门氏菌aroA基因的功能和后续减毒活疫苗开发奠定了基础。 展开更多
关键词 鸡白痢沙门氏菌 λ-red同源重组 aroA基因 生物学特性 活疫苗
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雏沙门菌S06004株毒力岛1缺失株的构建及其基本生物学特性的测定 被引量:1
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作者 殷俊磊 程瞾 +5 位作者 夏静 谢晓蕾 陶明新 李求春 耿士忠 焦新安 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期639-643,共5页
为了解毒力岛1(SPI1)对雏沙门菌致病性的影响,初步探索研制安全有效的雏沙门菌减毒株,采用λ-red同源重组系统成功构建了雏沙门菌S06004株的SPI1(约40kb)缺失株S06004ΔSPI1。进一步的生物学特性研究显示,SPI1的缺失不影响雏沙门菌的生... 为了解毒力岛1(SPI1)对雏沙门菌致病性的影响,初步探索研制安全有效的雏沙门菌减毒株,采用λ-red同源重组系统成功构建了雏沙门菌S06004株的SPI1(约40kb)缺失株S06004ΔSPI1。进一步的生物学特性研究显示,SPI1的缺失不影响雏沙门菌的生化特性和生长特性,且该缺失株具有良好的遗传稳定性,它对3日龄雏鸡的LD50是野生株的21倍。结果表明,SPI1的缺失则引起雏沙门菌毒力明显下降,这为进一步研究雏沙门菌SPI1的功能及制备减毒活疫苗奠定了一定的基础。 展开更多
关键词 雏沙门菌 λ-red同源重组 毒力岛1 生物学特性
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弗氏志贺菌2a GadB蛋白的功能研究
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作者 赵天 朱力 +3 位作者 冯尔玲 马姗姗 廖祥儒 王恒樑 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期921-927,共7页
目的探究gadB基因的潜在功能及其对弗氏志贺菌2a 301株致病能力的影响。方法利用λ-Red重组系统构建弗氏志贺菌2a 301株的gadB缺失突变株,随后进行基本的表型实验测评,并初步评价其毒力,最后制备突变株和野生株全菌蛋白样品,利用双向电... 目的探究gadB基因的潜在功能及其对弗氏志贺菌2a 301株致病能力的影响。方法利用λ-Red重组系统构建弗氏志贺菌2a 301株的gadB缺失突变株,随后进行基本的表型实验测评,并初步评价其毒力,最后制备突变株和野生株全菌蛋白样品,利用双向电泳技术比较二者在蛋白表达谱上的差异。结果成功获得gadB基因缺失株;生化实验发现缺失株不能利用甘油发酵;而豚鼠角膜实验发现突变株炎症反应稍轻于野生株;全菌蛋白表达谱中发现10个差异蛋白。结论利用双向电泳鉴定到一些可能与GadB有关的蛋白,为gadB潜在功能的研究提供了线索。 展开更多
关键词 志贺菌 弗氏 GadB蛋白 λ-red重组系统 基因敲除 双向电泳
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