卵巢上皮性癌相关抗原的筛选和血清学检测 被引量：19

1

作者 阳志军 杨光 +6 位作者 蒋燕明 冉宇靓 杨治华 张玮 张洁清 潘忠勉 李力 《中华妇产科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期834-839,共6页

目的构建卵巢上皮性癌(卵巢癌)腹水肿瘤细胞的 cDNA 文库,从中筛选能用于卵巢癌早期诊断和免疫治疗靶点的卵巢癌相关抗原。方法用3例卵巢浆液性囊腺癌、1例卵巢黏液性囊腺癌、1例卵巢子宫内膜样癌患者的腹水肿瘤细胞构建 cDNA 文库,采... 目的构建卵巢上皮性癌(卵巢癌)腹水肿瘤细胞的 cDNA 文库,从中筛选能用于卵巢癌早期诊断和免疫治疗靶点的卵巢癌相关抗原。方法用3例卵巢浆液性囊腺癌、1例卵巢黏液性囊腺癌、1例卵巢子宫内膜样癌患者的腹水肿瘤细胞构建 cDNA 文库,采用改良的重组克隆表达抗原的血清学鉴定(SEREX)技术与抑制性消减杂交(SSH)方法相结合的策略从文库中筛选卵巢癌相关抗原基因,并对其进行酶切鉴定、核苷酸测序分析。采用重组肿瘤抗原的微型血清学检测(SMARTA)法检测筛选出的卵巢癌相关抗原与96例卵巢癌患者和96例正常妇女的血清中相应自身抗体的阳性反应情况。结果经两轮血清学筛选和核苷酸测序分析,最终得到55个候选的卵巢癌相关抗原基因片段,代表45个基因,分为6类:(1)与已知的卵巢癌相关基因同源的基因,如 BARD1基因等;(2)与其他肿瘤相关基因同源的基因,如 TM4SF1基因等;(3)在一些特殊组织中表达的基因,如 ILF3、FXR1基因等;(4)与一些特殊功能蛋白基因同源的基因,如 TIZ、C1D 基因等;(5)与胚胎来源的基因同源的基因,如 PKHD1基因等;(6)其余为在基因库 GenBank 中无同源序列可比对的未知基因,如 OV-189基因等。TMdSF1、C1D、BARD1、FXR1、OV-189基因的噬菌体重组融合抗原与卵巢癌患者血清中相应IgG 型自身抗体反应的阳性率分别为28%、21%、23%、25%、31%,与正常妇女血清反应的阳性率分别为9%、6%、5%、8%、13%,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.01);TIZ、FXR1、OV-189基因的重组抗原与卵巢癌患者血清中相应 IgM 型自身抗体反应的阳性率分别为26%、28%、18%,与正常妇女血清反应的阳性率分别为8%、11%、7%,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。FXR1、OV-189基因的重组抗原与Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者血清中相应 IgG 型自身抗体反应的阳性率(分别为34%、46%)高于Ⅲ～Ⅳ期者(分别为16%、23%),两者� 展开更多

关键词 卵巢肿瘤 CA-125抗原 双杂交系统技术 基因文库 血清学试验

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反相斑点杂交快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变 被引量：11

2

作者 刘洋 王甦民 +6 位作者 郭艳玲 姜广路 刘宇红 付育红 毕志强 赵丽萍 李云絮 《中华检验医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期394-396,共3页

目的建立以聚合酶链反应(PCR)为基础的寡核甘酸探针反相斑点杂交方法快速检测对利福平耐药的结核菌相关的rpoB基因突变,并评价其临床应用价值。方法应用PCR反相斑点杂交方法对利福平耐药的62株结核菌和对其敏感的40株结核菌进行检测,所... 目的建立以聚合酶链反应(PCR)为基础的寡核甘酸探针反相斑点杂交方法快速检测对利福平耐药的结核菌相关的rpoB基因突变,并评价其临床应用价值。方法应用PCR反相斑点杂交方法对利福平耐药的62株结核菌和对其敏感的40株结核菌进行检测,所得结果与传统药敏试验结果以及102株结核菌的直接测序结果进行比较。结果62株对利福平耐药的菌株中,54株碱基突变被准确鉴定,灵敏度为87.1%(54/62),阳性预测值为100%;40株对利福平敏感的菌株均被准确鉴定,特异性为100%,阴性预测值为83.3%(40/48);准确度为92.2%(94/102)。与测序法结果符合率为99%。结论以PCR为基础的反相斑点杂交方法其敏感度和特异性均高,无假阳性结果,因此适用于大批量结核菌对利福平耐药性的初筛。 展开更多

关键词 RPOB基因突变 快速检测 结核分枝杆菌 反相斑点杂交 聚合酶链反应(PCR) 斑点杂交方法 利福平耐药 寡核甘酸探针 临床应用价值 结核菌 阳性预测值 阴性预测值 假阳性结果 直接测序 试验结果 碱基突变 特异性 灵敏度 准确度

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反向杂交法检测23种人乳头瘤病毒型别的研究 被引量：10

3

作者 何进才 周小梅 +1 位作者 黄涛 任维 《中华检验医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期44-47,共4页

目的建立一种同时检测人乳头瘤病毒(HPV)5种低危型和18种高危型的反向杂交方法。方法将23种 HPV 型别(低危型:HPV6、11、42、43和44型,高危型:HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83和 MM4型)特异性... 目的建立一种同时检测人乳头瘤病毒(HPV)5种低危型和18种高危型的反向杂交方法。方法将23种 HPV 型别(低危型:HPV6、11、42、43和44型,高危型:HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83和 MM4型)特异性探针固定于尼龙膜条上,生物素标记的通用引物介导 PCR(GP-PCR)扩增 HPV DNA,扩增产物与膜条经反向杂交检测 HPV 型别,并与 HC-Ⅱ法及扩增和测序法平行检测136例临床标本,对检测结果进行对比。结果 3种方法 HPV 阳性检出率分别为41.9%、42.6%和40.4%;反向杂交法与后二者检测结果之间均具有良好一致性(Kappa 值分别为0.8644和0.9089);以扩增和测序法为金标准,反向杂交法检测敏感度、特异度和准确性分别为96.36%、95.06%、95.59%。结论本法能一次性检测23种 HPV 具体型别,敏感度、特异度高,操作简便,结果易于判读,适合临床应用。 展开更多

关键词 乳头状瘤病毒 人 聚合酶链反应 双杂交系统技术

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蛋白质酵母双杂交系统的建立及其在大肠癌肝转移研究中的意义 被引量：7

4

作者 左富义 李世拥 +2 位作者 安萍 于波 蔡慧芸 《中华外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第11期672-674,共3页

目的　建立酵母双杂交系统 ,筛选与FasL相互作用的蛋白 ,探讨FasL与大肠癌肝转移的关系。方法　以FasL基因构建诱饵蛋白质粒 ,筛选人胎肝cDNA文库 ,鉴定与FasL相互作用的蛋白 ,通过生物信息学分析FasL及其相互作用蛋白在大肠癌肝转移中... 目的　建立酵母双杂交系统 ,筛选与FasL相互作用的蛋白 ,探讨FasL与大肠癌肝转移的关系。方法　以FasL基因构建诱饵蛋白质粒 ,筛选人胎肝cDNA文库 ,鉴定与FasL相互作用的蛋白 ,通过生物信息学分析FasL及其相互作用蛋白在大肠癌肝转移中的作用。结果　筛选出 10个与FasL特异性相互作用的蛋白 ,包括金属硫蛋白 1K、1G、2A ,组织蛋白酶B ,脂肪酸合成酶 ,干扰素α诱导蛋白 2 7,磷脂清除酶 ,丝氨酸 /苏氨酸样激酶 ,锚着黏附蛋白以及纤维微丝蛋白 5等。结论　成功建立了筛选FasL相互作用蛋白的酵母双杂交系统 ,并初步证明FasL与组织蛋白酶、金属硫蛋白。 展开更多

关键词 蛋白质 酵母双杂交系统 大肠癌 肝转移

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着床窗口期子宫内膜差异表达基因的研究 被引量：8

5

作者 杜国平 张炜 +2 位作者 王丽 刘银坤 周剑萍 《中华妇产科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期187-191,共5页

目的筛选在着床窗口期子宫内膜差异表达的基因,以了解子宫内膜容受性形成的分子基础。方法采用抑制性消减杂交技术(SSH),建立人子宫内膜着床窗口期基因表达的消减文库,并通过测序和同源性比较确定差异表达的基因;用 RT-PCR 技术验证其... 目的筛选在着床窗口期子宫内膜差异表达的基因,以了解子宫内膜容受性形成的分子基础。方法采用抑制性消减杂交技术(SSH),建立人子宫内膜着床窗口期基因表达的消减文库,并通过测序和同源性比较确定差异表达的基因;用 RT-PCR 技术验证其中的核糖体蛋白(RP)L7基因、RPL7假基因(RPL7p)、RPL19基因、酪氨酸3-单氧化酶/色氨酸5-单氧化酶激活蛋白 zeta 多肽(YWHAZ)基因在增生期晚期和分泌期中期子宫内膜中的表达。结果对消减文库中50个差异表达的克隆进行测序与同源性比较,筛选出35个在增生期晚期和分泌期中期有差异表达的基因。其中23个为已知功能的人类基因,12个为未知功能基因。RPL7、RPL7p、RPL19和 YWHAZ 基因在分泌期中期的表达水平有不同程度的升高,分别为0.75±0.21、1.72±0.30、1.23±0.31、1.28±0.08,分别与增生期晚期(分别为0.45±0.12、1.04±0.10、0.74±0.21、1.09±0.12)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论应用 SSH 可有效地筛选出着床窗口期子宫内膜差异表达基因,为今后进一步研究子宫内膜容受性形成的分子机理提供新的线索。 展开更多

关键词 子宫内膜 胚胎植入 基因表达 双杂交系统技术

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酵母双杂交技术筛选并回转验证在胞内与PML-C结构域相互作用的蛋白 被引量：8

6

作者 朱丹 王翀 +3 位作者 刘北忠 钟梁 王春光 吴燕 《医学分子生物学杂志》 CAS CSCD 2010年第3期242-246,共5页

目的 利用酵母双杂交技术在活细胞内筛选并回转验证与PML-C结构域相互作用的蛋白质.方法 通过诱饵质粒pGBKT7-PML-C,利用酵母双杂交系统从白血病细胞cDNA文库中筛选与PML-C结构域相互作用的蛋白质.结果 利用酵母双杂交技术筛选到43个能... 目的 利用酵母双杂交技术在活细胞内筛选并回转验证与PML-C结构域相互作用的蛋白质.方法 通过诱饵质粒pGBKT7-PML-C,利用酵母双杂交系统从白血病细胞cDNA文库中筛选与PML-C结构域相互作用的蛋白质.结果 利用酵母双杂交技术筛选到43个能与PML-C结构域相互作用的克隆;经进一步的归类与酵母回转试验得到9个阳性克隆.结论 在细胞内PML-C结构域能与多种蛋白质有相互作用.中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase,NE）介导的急性早幼粒细胞白血病的发生可能与这些相互作用所致的生物学功能改变有关. 展开更多

关键词 PML—C 酵母双杂交技术 蛋白质相互作用

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丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定研究 被引量：5

7

作者 张丹 翟永贞 冯国和 《临床和实验医学杂志》 2014年第16期1329-1331,共3页

目的构建含丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心(core,C)蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体,为C蛋白与宿主蛋白相互作用机制研究奠定基础。方法聚合酶链反应(PCR)法扩增HCV 1b基因型C蛋白基因,经EcoR I和Pst I双酶切后插入到诱饵载体pG... 目的构建含丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心(core,C)蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体,为C蛋白与宿主蛋白相互作用机制研究奠定基础。方法聚合酶链反应(PCR)法扩增HCV 1b基因型C蛋白基因,经EcoR I和Pst I双酶切后插入到诱饵载体pGBKT7中,构建含HCV C蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Core,经酶切分析及核酸测序分析加以鉴定。醋酸锂法将pGBKT7-Core转化入酵母菌株Y2HGold,蛋白印迹法检测C蛋白的表达,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母细胞的毒性作用及对报告基因的激活作用。结果重组质粒pGBKT7-Core中的C蛋白基因为576 bp,经核酸测序分析与NCBI中注册的HCV 1b基因型C蛋白基因序列一致;转化酵母菌后检测到C蛋白的表达;HCV C蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性,且对报告基因无激活作用。结论含HCV C蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体构建成功,表达稳定。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 病毒核心蛋白质类 酵母双杂交技术

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乙型肝炎病毒感染胎盘组织差异表达基因的筛选与确定 被引量：5

8

作者 白桂芹 岳亚飞 +4 位作者 张树林 成军 刘妍 李淑红 张新娥 《中华妇产科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期76-78,共3页

目的了解乙型肝炎病毒(HBV)感染胎盘组织基因表达的改变,确定与 HBV 感染胎盘相关的基因,以探讨 HBV 宫内感染的分子机制。方法选择2002年1月至2003年12月,在西安交通大学第一医院未临产以剖宫产分娩的30例 HBsAg、HBV DNA 双阳性(实验... 目的了解乙型肝炎病毒(HBV)感染胎盘组织基因表达的改变,确定与 HBV 感染胎盘相关的基因,以探讨 HBV 宫内感染的分子机制。方法选择2002年1月至2003年12月,在西安交通大学第一医院未临产以剖宫产分娩的30例 HBsAg、HBV DNA 双阳性(实验组)和30例 HBsAg、HBV DNA 双阴性(对照组)妇女的胎盘组织,采用抑制消减杂交技术(SSH)建立 HBV 感染胎盘组织cDNA 消减文库,经反向斑点杂交技术证实差异表达基因。RT-PCR 验证部分基因在 HBV 感染胎盘组织中的表达。结果两组差异表达基因35个,对其中含有插入片段的阳性克隆进行测序分析,获得33个已知基因序列,两个未知基因;并初步判定磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)基因在 HBV 感染的胎盘组织中表达明显增强。结论 HBV 感染胎盘时,基因表达可发生明显变化;PI3K 基因表达变化,对了解 HBV 宫内感染的分子机制有重要意义。 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 双杂交系统技术 胎盘 1-磷脂酰肌醇3-激酶 基因表达

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HLH缺失型Id2候选相互作用蛋白 被引量：5

9

作者 伍志强 孟元光 +4 位作者 赵亚力 杨洁 田丽媛 司艺玲 韩为东 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2007年第4期317-321,共5页

目的:筛选可以与螺旋-环-螺旋(HLH)结构域缺失的Id2相互作用的蛋白。方法:用重叠延伸PCR方法将Id2中的HLH结构域缺失,并插入到pGBKT7载体,构建BD:Id2-DBM-δHLH融合诱饵质粒;构建MCF-7细胞的dscDNA文库;采用共转化方法进行1d2-DBM-δHL... 目的:筛选可以与螺旋-环-螺旋(HLH)结构域缺失的Id2相互作用的蛋白。方法:用重叠延伸PCR方法将Id2中的HLH结构域缺失,并插入到pGBKT7载体,构建BD:Id2-DBM-δHLH融合诱饵质粒;构建MCF-7细胞的dscDNA文库;采用共转化方法进行1d2-DBM-δHLH相互作用蛋白的酵母双杂交筛选,采用PCR方法扩增阳性克隆中的AD:cDNA序列并测序;将获得的AD:cDNA质粒分别与BD:Id2-DBM-δHLH诱饵质粒共转化酵母进行配对验证。结果:酵母双杂交方法共筛选到19个阳性克隆,PCR方法在这19个克隆中共扩增到28条片段,序列测定证实含18个不同的基因,对其中的13个进行配对验证后证实了其中8个与HLH缺失型Id2相互作用,这8个基因分别是:UXT、VIM、KRT7、FHL2、SEI1、PCBP1、SIVA和LSM2。结论:本研究首次利用HLH缺失型Id2作为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选识别了一族新的Id2相互作用蛋白,为进一步研究Id2的功能调控以及非HI.H依赖的功能活性奠定基础。 展开更多

关键词 ID2 螺旋-环-螺旋构型 酵母菌 双杂交系统技术 蛋白相互作用

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丙型肝炎病毒核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在哺乳动物细胞中的相互作用 被引量：4

10

作者 李小权 成军 +3 位作者 张树林 王琦 李国力 洪源 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期790-792,共3页

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在哺乳动物细胞中的相互作用。方法分别扩增HCV核心蛋白core及其结合蛋白HCBP6的cDNA片段,克隆入pGEM-T载体。测序正确后应用双杂交技术把目的片段分别插入哺乳动物细胞双杂交... 目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在哺乳动物细胞中的相互作用。方法分别扩增HCV核心蛋白core及其结合蛋白HCBP6的cDNA片段,克隆入pGEM-T载体。测序正确后应用双杂交技术把目的片段分别插入哺乳动物细胞双杂交系统的表达质粒pBIND和pACT中构建重组载体。将构建的pBIND-core和pACT-HCBP6重组载体和报告质粒pG5luc共转染HepG2细胞,并设背景对照组(pBIND+pACT)、阳性对照组(pBIND-Myod+pACT-Id)、2个阴性对照组(pBIND-core+pACT、pBIND+pACT-HCBP6)和空白对照组。采用Dual-荧光检测系统和TurnerBiosystemsVeritas微孔板化学发光检测仪检测荧虫素酶活性。结果成功构建重组载体pBIND-core和pACT-HCBP6,共转染HepG2细胞之后,其荧虫素酶活性与海肾素酶活性的比值与各对照组相比有统计学差异(P≤0·05)。结论HCV核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在肝癌细胞系中确有一定的相互作用,为进一步阐明HCV核心蛋白在细胞凋亡及细胞恶变中的作用机制提供了新的思路。 展开更多

关键词 肝炎病毒 病毒核心蛋白质类 双杂交系统技术

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人胰腺细胞cDNA文库中丙型肝炎病毒NS4B结合蛋白基因的筛选 被引量：4

11

作者 温少芳 张锦前 +5 位作者 孙荣华 李卓 高萍 王琦 刘顺爱 成军 《中华临床医师杂志（电子版）》 CAS 2011年第9期2523-2526,共4页

目的从人胰腺细胞cDNA文库中,采用酵母双杂交方法筛选HCV NS4B包膜蛋白的相互作用蛋白。方法人胰腺细胞cDNA文库先进行扩增,随后纯化及鉴定,然后将鉴定好的人胰腺细胞cDNA文库质粒转化入酵母菌株Y187。构建pGBKT7-NS4B作为诱饵质粒,随... 目的从人胰腺细胞cDNA文库中,采用酵母双杂交方法筛选HCV NS4B包膜蛋白的相互作用蛋白。方法人胰腺细胞cDNA文库先进行扩增,随后纯化及鉴定,然后将鉴定好的人胰腺细胞cDNA文库质粒转化入酵母菌株Y187。构建pGBKT7-NS4B作为诱饵质粒,随之转化酵母菌株AH109,用色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)筛选阳性菌落。配合两种重组酵母菌株AH109与Y187,用四缺培养基及X-α-gal筛选蓝色酵母菌落,提取相应质粒,电转化感受态菌DH5α后再提取质粒,测序仪测序,结果使用PUBMED进行序列比对。结果成功构建pGBKT7-HCV NS4B重组质粒,并从人胰腺cDNA文库中筛选出7种与HCV NS4B蛋白相结合的蛋白基因,包括CDK5RAP3、辅脂肪酶、胰石蛋白、凝乳蛋白、弹性蛋白酶2A、糜蛋白酶和胆盐刺激酯酶。结论 HCV NS4B蛋白可能通过与所筛选出前述蛋白中参与代谢过程的相关蛋白结合,影响糖、脂类代谢过程。 展开更多

关键词 肝炎病毒属 基因文库 胰腺 载体蛋白质类 双杂交系统技术 NS4B

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PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者结核分枝杆菌耐药性的价值 被引量：4

12

作者 刘轾彬 吴敏 +3 位作者 吴小翠 韩敏 肖和平 张青 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 2021年第1期47-51,共5页

目的评估PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者痰标本中MTB耐药性的价值。方法收集2015年6月至2019年1月上海市肺科医院诊治的400例复治涂阳肺结核患者的痰标本,每份标本量均不少于2ml;每例患者采用同一标本进行PCR-反向点杂交法MTB耐药基... 目的评估PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者痰标本中MTB耐药性的价值。方法收集2015年6月至2019年1月上海市肺科医院诊治的400例复治涂阳肺结核患者的痰标本,每份标本量均不少于2ml;每例患者采用同一标本进行PCR-反向点杂交法MTB耐药基因检测、GeneXpert MTB/RIF检测和BACTEC MGIT960液体培养、菌种鉴定、微孔板法药物敏感性试验(简称"药敏试验"),最终纳入357例(株)为研究对象。以微孔板法药敏试验结果为参考标准,评价PCR-反向点杂交法的检测效能。结果以微孔板法药敏试验结果为参考标准,PCR-反向点杂交法检测MTB对利福平耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kappa值分别为97.5%(115/118)、97.1%(232/239)、94.3%(115/122)、98.7%(232/235)、97.2%(347/357)和0.937,对异烟肼耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kappa值分别为82.5%(113/137)、99.1%(218/220)、98.3%(113/115)、90.1%(218/242)、92.7%(331/357)和0.841,对链霉素耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kappa值分别为86.5%(115/133)、99.1%(222/224)、98.3%(115/117)、92.5%(222/240)、94.4%(337/357)和0.877,对乙胺丁醇耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kappa值分别为60.7%(37/61)、98.6%(292/296)、90.2%(37/41)、92.4%(292/316)、92.2%(329/357)和0.682。结论 PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者痰标本中MTB耐药性有较好的效能。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 结核 抗多种药物性 微生物敏感性试验 聚合酶链反应 双杂交系统技术 评价研究 数据说明 统计

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酵母双杂交技术筛选胞内氯离子通道蛋白1结合蛋白 被引量：2

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作者 戴寒晶 刘晓颖 +1 位作者 钟子琳 范礼斌 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2006年第2期175-177,共3页

目的应用酵母双杂交技术研究胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)的结合蛋白,以进一步了解其功能。方法首先将CLIC1的全长cDNA连接到pGBKT7载体中,重组质粒pGBKT7CLIC1转化入酵母菌株AH109,再将人Hela细胞的cDNA文库转化AH109细胞,用αgal检测... 目的应用酵母双杂交技术研究胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)的结合蛋白,以进一步了解其功能。方法首先将CLIC1的全长cDNA连接到pGBKT7载体中,重组质粒pGBKT7CLIC1转化入酵母菌株AH109,再将人Hela细胞的cDNA文库转化AH109细胞,用αgal检测阳性克隆。所获得阳性克隆测序后进行BLAST检索。结果用酵母双杂交方法筛选到了16个阳性克隆,其中有4个是已知蛋白的基因。结论利用酵母双杂交系统筛选到了数个结合蛋白。 展开更多

关键词 酵母菌 双杂交系统技术 氯化物通道

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酵母双杂交研究肾癌中Wnt/Frizzled信号通路的传导 被引量：2

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作者 龚侃 林桂亭 +2 位作者 张志文 常智杰 那彦群 《中华医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第14期1270-1273,共4页

目的　为研究肾癌中Wnt/Frizzled信号通路的传导 ,尤其是TCF4 (TCellFactor)的作用。方法　构建肾癌酵母双杂交文库及hTCF4酵母双杂交表达载体 ;通过酵母双杂交技术 ,以hTCF4为诱饵蛋白 ,自肾癌酵母双杂交文库中钓出与hTCF4相互作用的... 目的　为研究肾癌中Wnt/Frizzled信号通路的传导 ,尤其是TCF4 (TCellFactor)的作用。方法　构建肾癌酵母双杂交文库及hTCF4酵母双杂交表达载体 ;通过酵母双杂交技术 ,以hTCF4为诱饵蛋白 ,自肾癌酵母双杂交文库中钓出与hTCF4相互作用的蛋白。结果　共钓出与hTCF4相互作用的阳性克隆 6 7个 ,其中包括 β 连环蛋白 ,TCF4,转录激活因子 5 ,锌指蛋白和人类基因组文库克隆 1980等。结论　肾癌中存在Wnt/Frizzled信号通路 ,其重要信号分子hTCF4与 β 连环蛋白相互作用 ,尚可以自身相互作用形成同源二聚体或同源共聚体 ,从而发挥其转录因子的作用。 展开更多

关键词 酵母双杂交技术 肾癌 Wnt/Frizzled 信号传导 T细胞因子4 肿瘤治疗学

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C2株蓝氏贾第鞭毛虫cDNA文库的构建 被引量：2

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作者 刘绍伟 王洋 田喜凤 《河北医科大学学报》 CAS 2018年第1期7-10,共4页

目的构建C2株蓝氏贾第鞭毛虫cDNA文库。方法 Trizol对C2株贾第虫滋养体RNA进行提取,逆转录获得cDNA单链,LD-PCR扩增获得ds cDNA,经纯化后,与pGADT7-Rec共转化酵母株Y187中。通过营养缺陷型平板SD/-Leu培养获得转化子即包含蓝氏贾第鞭毛... 目的构建C2株蓝氏贾第鞭毛虫cDNA文库。方法 Trizol对C2株贾第虫滋养体RNA进行提取,逆转录获得cDNA单链,LD-PCR扩增获得ds cDNA,经纯化后,与pGADT7-Rec共转化酵母株Y187中。通过营养缺陷型平板SD/-Leu培养获得转化子即包含蓝氏贾第鞭毛虫cDNA文库,并对文库的库容及DNA重组率进行鉴定。结果以RNA为模板,经逆转录、LD-PCR、纯化等,得到了较为理想的双链cDNA。将ds cDNA和pGADT7-Rec转化到酵母菌株,经分离培养,最终得到转化成功的酵母转化子,建立了贾第虫的cDNA文库,文库容量为2.715×107/mL,重组率76.7%,插入片段的大小主要集中在300~1 000。结论成功的构建了较为理想的C2株贾第虫cDNA文库。 展开更多

关键词 贾第虫属 基因文库 双杂交系统技术

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增生性瘢痕成纤维细胞中羟基丙酮酸异构酶同系物结合结构域分析 被引量：2

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作者 汪静 刘洋 +2 位作者 张克 马兵 赵云 《中华烧伤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期60-64,共5页

目的 了解增生性瘢痕Fb中羟基丙酮酸异构酶同系物（HYI）与P311蛋白相互作用的结合区域. 方法（1）以克隆有P311的pMD18-T质粒为模板,对P311进行PCR扩增；Trizol法提取人增生性瘢痕Fb的总RNA,对HYI进行RT-PCR扩增,采用双酶切法分别构建p... 目的 了解增生性瘢痕Fb中羟基丙酮酸异构酶同系物（HYI）与P311蛋白相互作用的结合区域. 方法（1）以克隆有P311的pMD18-T质粒为模板,对P311进行PCR扩增；Trizol法提取人增生性瘢痕Fb的总RNA,对HYI进行RT-PCR扩增,采用双酶切法分别构建pGA DT7-P311和pGBKT7-HYI重组载体,PCR及测序验证.采用Prot Seale软件和HNN软件对HYI蛋白进行二级结构分析,据此结果扩增HYI-1（1 ～447 bp）、HYI-2（247 ～447 bp）、HYI-3（1 ～279 bp）、HYI-4（247 ～654 bp）片段,双酶切法构建pGBKT7-HYI-1、2、3、4重组载体,经PCR及测序验证.（2）采用醋酸锂法将酵母细胞AH109制备成感受态细胞,粗略等量分为HYI全长与HYI-1、2、3、4杂交组,以及阳性对照组和阴性对照组.采用聚乙二醇-醋酸锂法,前5组分别同时转化pGBKT7-HyI全长、各片段的重组载体与pGADT7-P311重组载体,后2组分别同时转化pGBKT7-53与pGADT7-RecT重组载体、pGBKT7-Lam与pGADT7-RecT重组载体.转化后即刻,取各组部分细胞分别涂布在缺乏亮氨酸、色氨酸、腺嘌呤及组氨酸的培养基（简称四缺培养基）上,另取各组部分细胞分别涂布在缺乏亮氨酸和色氨酸的培养基（简称二缺培养基）上,培养3～6d,观察菌株生长情况,5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷显色反应检测菌落β半乳糖苷酶表达. 结果（1）克隆出的P311片段与Genbank中P311（序号hsu36189）序列一致.与Genbank中HYI（序号AY775560）序列对比,HYI基因扩增片段在496 bp处的A替换为了G.经验证各重组载体插入片段无误.（2）计算机模拟结果显示,组成HYI蛋白的216个氨基酸中,可能形成α螺旋的氨基酸有101个,可能形成无规则卷曲的氨基酸有90个,可能形成延伸链的氨基酸有25个.（3）HYI-1、2、3、4克隆片段大小与预期相符,经验证各重组载体插入片段无误.（4）除阴性对照组菌株未见在四缺培养基上生长外,其他组菌株均在2种培养基上生长,� 展开更多

关键词 瘢痕 成纤维细胞 双杂交系统技术 羟基丙酮酸异构酶同系物 结合结构 域 P311

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人甲状腺激素受体相互作用蛋白15与甲状腺激素受体的相互作用 被引量：2

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作者 彭永德 张新 +4 位作者 宋怀东 曲建 胡仁明 韩泽广 陈家伦 《中华内分泌代谢杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期95-98,共4页

目的　确立人甲状腺激素受体相互作用蛋白 15 (hTRIP15 )与甲状腺激素受体 (TR)的相互作用及其作用方式。方法　应用酵母双杂交技术及半乳糖苷酶定性或定量测定。结果　将构建质粒 (BD TRIP15与AD TR)共转化AH10 9酵母细胞后 ,在高严格... 目的　确立人甲状腺激素受体相互作用蛋白 15 (hTRIP15 )与甲状腺激素受体 (TR)的相互作用及其作用方式。方法　应用酵母双杂交技术及半乳糖苷酶定性或定量测定。结果　将构建质粒 (BD TRIP15与AD TR)共转化AH10 9酵母细胞后 ,在高严格度选择的培养基 (SD Leu Trp Ade His) 10天克隆长出 ,相比阳性对照质粒 (BD P5 3 +AD Tag)共转后 3天克隆生长。将构建载体及对照载体转化Y187酵母菌株 ,检测LacZ报告基因的表达 (β gal单位 ) ,阳性对照质粒 (BD P5 3 +AD Tag)为 14 9.5 7± 0 .5 1,BD TRIP15 +AD TR为 3 .2 3± 10 .15 ,加入T3 后为 2 .0 2± 0 .0 8,而阴性对照质粒 (BD P5 3 +AD LamC)仅为 0 .0 2± 0 .0 1β gal单位 ,且T3 呈剂量依赖方式抑制两者的相互作用。结论　hTPIR15能与TR共相互作用 ,T3 呈剂量依赖方式抑制两者间的作用 ,仅在超大剂量时才可完全阻断hTRIP15与TRα间的作用。 展开更多

关键词 甲状腺激素受体相互作用蛋白15 甲状腺激素受体 测定 酵母双杂交技术 靶基因 甲状腺激素抵抗综合征

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利用双杂交系统筛选并鉴定与GPR30相互作用的蛋白 被引量：1

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作者 张蕾 常宏 徐东 《河北医科大学学报》 CAS 2013年第4期378-380,F0002,共4页

目的筛选并鉴定与GPR30相互作用的蛋白,为GPR30蛋白亚细胞定位和功能研究提供线索。方法应用酵母双杂交技术,构建诱饵表达载体Pgbk/GPR30,与人卵巢互补DNA(complementary DNA,cDNA)文库共转化酵母菌AH109,筛选阳性克隆并测序。利用哺乳... 目的筛选并鉴定与GPR30相互作用的蛋白,为GPR30蛋白亚细胞定位和功能研究提供线索。方法应用酵母双杂交技术,构建诱饵表达载体Pgbk/GPR30,与人卵巢互补DNA(complementary DNA,cDNA)文库共转化酵母菌AH109,筛选阳性克隆并测序。利用哺乳动物双杂交系统验证GPR30与候选蛋白的相互作用。结果从人卵巢cDNA文库中筛选出4个与GPR30结合的蛋白基因,分别是小G蛋白Rab8a、Rab40a、NM23-H2和TACC3。其中,小G蛋白Rab8a、Rab40a与GPR30的相互作用在哺乳动物双杂交系统中得到验证。结论小G蛋白Rab8a和Rab40a可能参与了GPR30细胞内转运或与GPR30参与的信号转导有关。 展开更多

关键词 受体 雌激素 双杂交系统技术 卵巢

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HPV16 E6蛋白与hDaxx的相互作用及其对HeLa细胞凋亡的影响

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作者 王鑫 朱翠明 +4 位作者 刘安元 尹卫国 李金丽 蔡恒玲 万艳平 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期293-296,共4页

目的:研究HPV16 E6(human papillomavirus type16 E6)蛋白与hDaxx(human death domain associated protein)的相互作用及其对HeLa细胞凋亡的影响,为探索HPV16 E6蛋白的致癌机制提供实验依据。方法:构建pGADT7-E6和pGBKT7-hDaxx重组载体... 目的:研究HPV16 E6(human papillomavirus type16 E6)蛋白与hDaxx(human death domain associated protein)的相互作用及其对HeLa细胞凋亡的影响,为探索HPV16 E6蛋白的致癌机制提供实验依据。方法:构建pGADT7-E6和pGBKT7-hDaxx重组载体,利用酵母双杂交系统检测HPV16 E6蛋白与hDaxx的相互作用,并用Western印迹法检测二者在酵母菌中的表达。将E6与hDaxx的真核表达载体共转染HeLa细胞,用5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导凋亡,FCM法检测凋亡率。结果:E6蛋白与hDaxx在细胞内存在相互作用。共转染pcDNA3.1(-)/E6和pcDNA3.1(-)/hDaxx的HeLa细胞,随pcDNA3.1(-)/hDaxx转染量的增加凋亡率上升,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:HPV16 E6蛋白与hDaxx在细胞内相互作用,hDaxx过表达可提高表达E6蛋白的HeLa细胞对5-FU的敏感性,且这种关系存在剂量依赖性。E6蛋白可能通过和hDaxx的相互作用抑制细胞凋亡。 展开更多

关键词 乳头瘤病毒E6蛋白质类 HELA细胞 双杂交系统技术 细胞凋亡 蛋白hDaxx

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胞红蛋白(CGB)与金属硫蛋白(MT2)相互作用的研究 被引量：1

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作者 文圣梅 李谋 +2 位作者 高艳 吴祖泽 张成岗 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2007年第5期401-404,共4页

目的:胞红蛋白(CGB)是新近发现的在脊椎动物多种组织中广泛表达的携氧珠蛋白,在肝纤维化过程及缺氧/缺血条件下表达增高,可提高细胞抗氧化损伤能力,但其在细胞保护中的作用机制仍不清楚。由于蛋白质功能的发挥在很大程度上是通过蛋白质... 目的:胞红蛋白(CGB)是新近发现的在脊椎动物多种组织中广泛表达的携氧珠蛋白,在肝纤维化过程及缺氧/缺血条件下表达增高,可提高细胞抗氧化损伤能力,但其在细胞保护中的作用机制仍不清楚。由于蛋白质功能的发挥在很大程度上是通过蛋白质-蛋白质相互作用实现的,本研究拟通过研究与功能已知蛋白之间的相互作用,阐明CGB发挥保护作用的分子机制。方法:采用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库,获得与CGB相互作用的阳性克隆并测序、BLAST比对鉴定获得的cDNA序列;随后采用酵母回转实验、免疫荧光共定位及免疫共沉淀实验对蛋白之间的相互作用进行验证。结果:筛选获得的阳性克隆cDNA序列与人金属硫蛋白Ⅱ(MT2)存在100%序列相似性,并且MT2与CGB在酵母和COS7细胞中均存在相互作用。结论:由于MT2为生物体内广泛存在的抗氧化和清除自由基的应激相关蛋白,CGB可能与MT2一起协同调节细胞氧化还原反应能力,进而从抗氧化损伤的角度发挥细胞保护作用。 展开更多

关键词 胞红蛋白 金属硫蛋白Ⅱ 酵母菌 双杂交系统技术 氧化损伤

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