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微管相关蛋白tau转基因细胞和动物模型的建立及tau蛋白病变表征 被引量：3
1
作者 马登磊 张旭 +4 位作者 罗艺 黄蕊 李雅莉 李林 张兰 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2019年第4期582-587,共6页
目的构建并表征tau及突变tau蛋白细胞和动物模型,检测模型tau蛋白及磷酸化tau蛋白表达情况及微管的形态,为tau蛋白及相关疾病的研究提供疾病模型。方法将不同的质粒分别转染到HEK293细胞中,构建过表达野生型tau以及P301L/P301S突变tau... 目的构建并表征tau及突变tau蛋白细胞和动物模型,检测模型tau蛋白及磷酸化tau蛋白表达情况及微管的形态,为tau蛋白及相关疾病的研究提供疾病模型。方法将不同的质粒分别转染到HEK293细胞中,构建过表达野生型tau以及P301L/P301S突变tau的细胞模型。引进并繁育rTg4510小鼠(P301L突变tau转基因小鼠)以及PS19小鼠(P301S突变tau转基因小鼠)。通过Western blotting法检测总tau及磷酸化tau蛋白的表达,应用免疫组织化学的方法检测转基因小鼠脑内磷酸化tau蛋白的表达情况,应用免疫荧光的方法检测HEK293细胞微管形态的变化。结果本研究成功构建过表达tau蛋白的细胞模型,繁育了两种tau转基因小鼠,在这些模型中tau蛋白表达及tau蛋白的磷酸化水平显著高于对照组。在不同突变类型的细胞和动物模型中,tau蛋白不同位点的磷酸化水平变化以及微管形态变化略有差异。结论本研究成功构建了P301L/P301S突变tau蛋白的细胞和动物模型,这些模型均表现了显著的tau蛋白过度磷酸化的病变,并引起了细胞微管形态或tau蛋白病理的变化,进而为包括AD在内的tau蛋白病变提供了实验模型。 展开更多
关键词 微管相关蛋白tau 细胞转染模型 转基因动物模型 微管
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HBV 1.3倍基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株的筛选及鉴定 被引量：3
2
作者 邱华 林栋毅 李锦源 《世界华人消化杂志》 CAS 2021年第16期934-944,共11页
背景乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)体外感染模型是开展HBV生命周期、致病机理、药物筛选等研究的基础.随着临床抗HBV治疗进入“功能性治愈”“完全治愈”新时代的趋势,对能稳定模拟共价闭合环状DNA分子(covalently closed circul... 背景乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)体外感染模型是开展HBV生命周期、致病机理、药物筛选等研究的基础.随着临床抗HBV治疗进入“功能性治愈”“完全治愈”新时代的趋势,对能稳定模拟共价闭合环状DNA分子(covalently closed circular DNA,cccDNA)转录机制,乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)致病机理的细胞模型的需求日益迫切.HBV1.3倍(1.3-fold HBV)全基因组包含了全部HBV生物信息,能依赖自身启动子启动转录过程,支持cccDNA形成和完整病毒复制,最接近于HBV体内感染状态下的生命周期.慢病毒转染是一种以慢病毒为载体,将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术,可形成稳定转染.目的采用慢病毒转染技术构建HBV 1.3倍基因组HepG2稳转细胞模型,筛选并鉴定出能稳定、高效表达HBV生物标志物的优势单克隆株.方法构建含1.3-fold HBV基因组信息的慢病毒质粒并包装慢病毒;以最佳感染复数(MOI)值将1.3-fold HBV慢病毒液侵染靶细胞HepG2,以抗生素杀稻瘟菌素(blasticidin,BSD)最佳筛选剂量筛选出稳定整合1.3-fold HBV基因的HepG2细胞系(1.3-fold HBV-HepG2),继而采用PCR法鉴定该细胞模型中的HBV DNA序列.将1.3-fold HBV-HepG2稳转细胞进行培养并挑选出9株候选阳性单克隆,通过测序各单克隆细胞的侧翼序列,以确定9株候选阳性单克隆相应的基因组在HepG2细胞基因组中的插入位置,再根据各候选单克隆株表达HBsAg、HBeAg的水平,筛选出最优势单克隆株.将该优势单克隆株与HepG2.2.15细胞株分别持续培养20代,比较这两种细胞株表达HBsAg、HBeAg、HBx、cccDNA、HBV DNA等标志物的水平及稳定性.结果(1)将慢病毒pLenti-BSD-1.3-fold HBV以MOI=30的参数侵染HepG2细胞,72 h后加入BSD抗生素(终浓度1μg/mL)进行筛选,连续培养15-20 d后,获得1.3-fold HBV-HepG2稳转细胞系,PCR鉴定出HBV DNA序列;(2)在挑选出的9株候选阳性单克隆中,编号A14的细胞 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 1.3倍基因组 稳转 细胞模型 优势单克隆
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应用转染细胞研究ERCC2/XPD基因多态与短波紫外线所致DNA损伤修复的关联
3
作者 关阳阳 肖明扬 +3 位作者 潘亮 薛萍 张国培 逯晓波 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1066-1071,1076,共7页
目的探讨ERCC2/XPD基因多态与短波紫外线(UVC)所致细胞DNA损伤与修复的关联。方法构建稳定表达ERCC2/XPD rs13181 AA(Lys751)和ERCC2/XPD rs13181 CC(Gln751)2种基因型的质粒,转染中国仓鼠卵巢细胞缺陷型UV5,获得稳定表达ERCC2转染细胞... 目的探讨ERCC2/XPD基因多态与短波紫外线(UVC)所致细胞DNA损伤与修复的关联。方法构建稳定表达ERCC2/XPD rs13181 AA(Lys751)和ERCC2/XPD rs13181 CC(Gln751)2种基因型的质粒,转染中国仓鼠卵巢细胞缺陷型UV5,获得稳定表达ERCC2转染细胞系。应用MTT法比较2种不同基因型转染细胞经不同照射强度UVC处理后细胞抑制率的差别;应用改良彗星试验检测各转染细胞经UVC处理后1、3、6、24 h DNA损伤修复能力的差异。结果与UV5ERCC2(AA)相比,突变型细胞UV5^(ERCC2(CC))对UVC所致DNA损伤更加敏感,细胞存活率降低(P<0.05)。改良彗星试验结果显示,UV5^(ERCC2(CC))细胞DNA损伤程度较UV5ERCC2(AA)严重,且修复UVC所致DNA损伤的能力降低,在20 J/m2UVC处理3、6 h时点的差异有统计学意义(P<0.05)。结论 ERCC2/XPD rs13181多态C等位基因与UVC所致DNA损伤修复能力下降相关,提示ERCC2/XPD rs13181基因多态性可能在UVC所致DNA损伤修复中具有一定意义。 展开更多
关键词 ERCC2/XPD 单核苷酸多态性 转染细胞模型 短波紫外线 核苷酸切除修复
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耐干扰素的乙型肝炎病毒细胞模型的建立 被引量：4
4
作者 韦佳佳 汤波 +1 位作者 徐丙发 秦侃 《中国药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期832-837,共6页
目的建立耐干扰素的乙型肝炎病毒(HBV)细胞模型,为进一步探索HBV对干扰素产生耐药机制提供实验基础。方法应用HBV体外转染细胞株HepG2.2.15,采用干扰素α-2b(IFNα-2b)低浓度(10~70 u·mL^(-1))长期诱导,历时48周建立HepG2.2.15/IFN... 目的建立耐干扰素的乙型肝炎病毒(HBV)细胞模型,为进一步探索HBV对干扰素产生耐药机制提供实验基础。方法应用HBV体外转染细胞株HepG2.2.15,采用干扰素α-2b(IFNα-2b)低浓度(10~70 u·mL^(-1))长期诱导,历时48周建立HepG2.2.15/IFNα-2b细胞系模型。然后给予最佳药效浓度IFNα-2b培养4 d,比较低剂量诱导前后细胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBV DNA的变化。结果经低浓度IFNα-2b刺激12周后,50 u·mL^(-1)组对最佳药效浓度IFNα-2b的敏感性显著降低,与刺激前细胞比较,HBsAg、HBeAg、HBV DNA的抑制率分别降低了25.48%、8.40%和15.43%,认为50 u·mL^(-1)为最佳刺激浓度。经50 u·mL^(-1)IFNα-2b分别刺激12~48周,发现36周后HBsAg、HBeAg、HBV DNA抑制率下降最明显,与刺激前细胞比较,抑制率分别降低了38.64%、15.71%和30.17%,认为36周为最佳刺激时间。结论经IFNα-2b持续诱导可使HepG2.2.15对IFNα-2b产生部分耐药,其中50 u·mL^(-1)IFNα-2b持续诱导36周最易使之产生耐药。 展开更多
关键词 干扰素 乙型肝炎病毒 耐药 转染 细胞模型
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FKBP12/BAX双聚体诱导细胞凋亡模型的建立
5
作者 肖鹤 张纪岩 +3 位作者 于鸣 沈倍奋 李松 黎燕 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第12期955-960,共6页
目的　建立FKBP12 /BAX双聚体可诱导细胞凋亡生物效应的细胞模型 ,并利用阳性药物对其进行鉴定。方法　RT PCR扩增鼠源性BAX全长基因 ,插入pUC18载体进行测序鉴定。将鉴定正确的mBAX插入载体pC4FV1E中 ,构建pC4FV1E/BAX表达质粒。将表... 目的　建立FKBP12 /BAX双聚体可诱导细胞凋亡生物效应的细胞模型 ,并利用阳性药物对其进行鉴定。方法　RT PCR扩增鼠源性BAX全长基因 ,插入pUC18载体进行测序鉴定。将鉴定正确的mBAX插入载体pC4FV1E中 ,构建pC4FV1E/BAX表达质粒。将表达质粒与pcDNA3.1共转染HEK2 93细胞 ,建立pC4FV1E/BAX neo和neo基因稳定表达的细胞模型。利用形态学方法、流式细胞术等对化学药物诱导FKBP12 /BAX双聚体介导的细胞凋亡进行定性及定量的分析。结果　RT PCR、Westernblot法分别从mRNA及蛋白水平检测到FKBP12 mBAX融合基因的整合及表达 ;阳性化合物AP2 0 187作用 4～ 6h后 ,Giemsa染色可见明显的凋亡小体 ;钙依赖核酸内切酶亦被激活 ,出现典型的“DNAladder” ;天然产物FK5 0 6可竞争性地抑制这种阳性药物诱导的细胞凋亡。结论　FKBP12 /BAX双聚体可诱导细胞凋亡生物效应的细胞模型的建立 ,为FK5 0 6类小分子化合药物的高通量筛选提供可应用的技术平台。 展开更多
关键词 FKBP12/BAX双聚体 诱导 细胞凋亡 细胞模型 竞争抑制 共转染 免疫抑制剂
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