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多重PCR技术研究进展 被引量:43
1
作者 钟泽澄 王进 张师音 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期171-179,共9页
多重PCR(Multiplex polymerase chain reaction,MPCR)是指通过一次PCR反应同时对多个靶标进行扩增,结合一定的检测手段对扩增产物进行检测从而实现对多个靶标进行诊断的技术。MPCR具有高效率、高通量、低成本的特性而被深入研究。目前M... 多重PCR(Multiplex polymerase chain reaction,MPCR)是指通过一次PCR反应同时对多个靶标进行扩增,结合一定的检测手段对扩增产物进行检测从而实现对多个靶标进行诊断的技术。MPCR具有高效率、高通量、低成本的特性而被深入研究。目前MPCR技术已被广泛应用于科学研究和疾病诊断等领域,文中从MPCR扩增与检测两方面概述了MPCR技术发展及其应用,讨论了MPCR技术的优点及存在的问题,并且提出将反应体系分隔成小液滴或结合管式对流PCR(CapillaryconvectivePCR,CCPCR)技术的方式有望提高固相载体表面的扩增效率,从而开发出扩增效率高、一致性好、体系稳定、检测重数高的多重PCR技术。 展开更多
关键词 多重PCR 熔解曲线 微流控 膜层析 Luminex液相芯片
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Melting Characteristics of Iron Ore Fine During Sintering Process 被引量:15
2
作者 LI Hong-ge ZHANG Jian-liang +2 位作者 PEI Yuan-dong ZHAO Zhi-xing MA Ze-jun 《Journal of Iron and Steel Research International》 SCIE EI CAS CSCD 2011年第5期11-15,共5页
The whole melting curve of iron ore during sintering process was obtained,and the melting characteristics of iron ore were defined and explained. The whole melting process of mixture,mixed by iron ore and CaO reagent ... The whole melting curve of iron ore during sintering process was obtained,and the melting characteristics of iron ore were defined and explained. The whole melting process of mixture,mixed by iron ore and CaO reagent at basicity of 2.0 and 4.0,respectively,was observed using a SiC heating furnace with camcorder unit,and the melting curves of mixture that were relative height vs temperature curves were obtained. Besides,the melting characteristics of iron ore during sintering were introduced through defining some points in the melting curves,such as liquid forming temperature,inflexion temperature and flowing temperature,and the meaning of different shapes of the melting curves was clarified. 展开更多
关键词 iron ore SINTERING melting characteristic melting curve
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SYBR Green实时荧光PCR快速鉴定辣椒实蝇 被引量:13
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作者 余道坚 章桂明 +2 位作者 陈志粦 康林 杨伟东 《植物检疫》 2006年第1期10-14,共5页
本文应用SYBRGreen实时荧光PCR技术,建立了SYBRGreen实时荧光PCR快速鉴定辣椒实蝇的方法。利用辣椒实蝇mtDNACOI基因序列,筛选出种特异引物lati1/lati2。引物的特异性分别用辣椒实蝇、橘小实蝇、木瓜实蝇、杨桃实蝇、菲律宾实蝇、芒果... 本文应用SYBRGreen实时荧光PCR技术,建立了SYBRGreen实时荧光PCR快速鉴定辣椒实蝇的方法。利用辣椒实蝇mtDNACOI基因序列,筛选出种特异引物lati1/lati2。引物的特异性分别用辣椒实蝇、橘小实蝇、木瓜实蝇、杨桃实蝇、菲律宾实蝇、芒果实蝇、番石榴实蝇、瓜实蝇和南瓜实蝇等9种果实蝇来验证。0.01ng,0.1ng,1ng,10ng,20ng,40ng和100ng等7个不同浓度系列的辣椒实蝇DNA模板用来检测SYBRGreenPCR实时荧光反应的灵敏度,结果表明,SYBRGreenPCR的检测限度达1pg以下,最适模板DNA浓度为1~20ng。成虫、幼虫和蛹等3种不同虫态的辣椒实蝇有一致的扩增曲线,熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳分别用来确认实时荧光PCR产物的特异性。其平均熔解温度为77.5℃±0.1℃。获得1段长为366bp的特异性目标片段,说明在辣椒实蝇成虫为模板基础上建立的SYBRGreen实时荧光PCR方法适于幼虫、蛹的快速鉴定。 展开更多
关键词 辣椒实蝇 SYBR Green 实时荧光PCR 熔解曲线 快速鉴定
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SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1 被引量:13
4
作者 温立斌 何孔旺 +3 位作者 杨汉春 郭容利 周俊明 钟书霖 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2009年第4期31-35,共5页
该研究旨在建立快速、敏感和特异的检测类猪圆环病毒因子P1的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR法,用于P1的早期诊断。以感染P1的猪血清DNA提取物为模板,采用PCR扩增P1 101 bp的基因片段,将其克隆至pMD18-T载体,重组质粒测序并进行同源性分析;... 该研究旨在建立快速、敏感和特异的检测类猪圆环病毒因子P1的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR法,用于P1的早期诊断。以感染P1的猪血清DNA提取物为模板,采用PCR扩增P1 101 bp的基因片段,将其克隆至pMD18-T载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测。经测序证实扩增片段属于P1,所建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测P1的反应在101-108拷贝/μL之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10拷贝/μL,而对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测为阴性,表明该方法敏感、特异。成功建立了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测P1载量的方法,为P1致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台。 展开更多
关键词 类猪圆环病毒因子 P1 荧光定量PCR 熔解曲线 检测
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Real-Time PCR溶解曲线及Myostatin基因在肉类掺假快速鉴别中的应用 被引量:11
5
作者 凌睿 薛建丽 +4 位作者 杨军 张驰 程逸宇 高翔 邱皓璞 《食品科技》 CAS 北大核心 2013年第5期318-322,共5页
肉类掺假不仅损害消费者利益,而且易引发民族矛盾,甚至会让过敏人群产生严重的过敏反应,因此对市场上销售的肉的种类进行快速、有效的鉴别意义重大。利用SYBRGreen实时PCR的方法,采用对家禽和哺乳动物Myostatin基因都有特异性扩增的通... 肉类掺假不仅损害消费者利益,而且易引发民族矛盾,甚至会让过敏人群产生严重的过敏反应,因此对市场上销售的肉的种类进行快速、有效的鉴别意义重大。利用SYBRGreen实时PCR的方法,采用对家禽和哺乳动物Myostatin基因都有特异性扩增的通用引物MY,以确保所提取肉类DNA的质量。利用SYBRGreen实时PCR的溶解曲线对肉类成分进行检测判断。结果表明,在SYBRGreen实时PCR系统中,MY通用引物能够对市场上常见肉的DNA(猪、牛、山羊、绵羊、鸡、鸭)进行扩增。在利用猪肉冒充羊肉的检测中,能够利用两对引物的平均溶解温度的不同[猪Tm=(82.03±0.25)℃;羊Tm=(78.83±0.16)℃]对猪、羊肉进行鉴别,能够从1%猪肉+99%羊肉的混合物中检测出1%猪肉(0.1ng),从0.1%羊肉+99.9%猪肉的混合物中检测出0.1%(0.01ng)羊肉。 展开更多
关键词 猪肉 羊肉 肉类掺假 溶解曲线
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采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法对猪瘟强毒与疫苗弱毒的鉴别研究 被引量:11
6
作者 谢金文 李安 +4 位作者 肖跃强 王金良 李峰 沈志强 崔言顺 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期45-48,共4页
为建立一种能够区分猪瘟病毒(CSFV)强毒与弱毒疫苗C株的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR结合熔解曲线分析方法,本研究对GenBank中登录的25株CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗C株全基因组序列进行比较分析,设计一对共用下游引物以及分别针对CSFV强... 为建立一种能够区分猪瘟病毒(CSFV)强毒与弱毒疫苗C株的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR结合熔解曲线分析方法,本研究对GenBank中登录的25株CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗C株全基因组序列进行比较分析,设计一对共用下游引物以及分别针对CSFV强毒株与弱毒疫苗的特异性上游引物,其Tm值分别为84.5±0.5℃和88.5±0.5℃,熔解曲线分析显示为单特异峰。检测结果显示本实验建立的鉴别CSFV强毒感染与弱毒疫苗的荧光定量RT-PCR结合熔解曲线分析方法特异性强,对其他相关病毒无特异性扩增;敏感性高,最低检出量为5×RID50的细胞疫苗基因组拷贝;重复性好;并且扩增效率高、线性范围广、检测时间短,可对免疫猪群中CSFV强毒感染做出快速准确的鉴别检测,为有效防制猪瘟提供依据。 展开更多
关键词 猪瘟 定量检测 熔解曲线 鉴别诊断
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“荧光定量PCR溶解曲线法”监测人TCRβ链CDR3谱系漂移技术的建立 被引量:9
7
作者 马锐 罗荣 +1 位作者 孙万邦 姚新生 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期446-451,共6页
目的建立"荧光定量PCR溶解曲线分析技术"监测人外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法提取4例正常人、9例大肠癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell-PBMC)中的总RNA,逆转录成cDNA,以2... 目的建立"荧光定量PCR溶解曲线分析技术"监测人外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法提取4例正常人、9例大肠癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell-PBMC)中的总RNA,逆转录成cDNA,以26个人TRBV基因家族设计上游引物,共同的TRBC基因设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增26个TRBV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果正常人外周血T细胞TCRβ链26个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"(melting curve spectratyping)呈现溶点不同的CDR3多态性,为多克隆增生的高斯分布;9例大肠癌患者的外周血TCRβ链CDR3谱系的26个家族CDR3表达频率不一致,有的患者部分家族呈缺失状态,患者各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论"荧光定量PCR溶解曲线分析TCR CDR3谱系漂移技术",方法稳定简便,能较好的监测正常人和临床样本外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。 展开更多
关键词 T淋巴细胞受体 互补决定区3 荧光定量PCR 溶解曲线
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肿瘤坏死因子α基因多态性与脑梗塞的相关性 被引量:7
8
作者 柏学工 程正江 《医学新知》 CAS 2004年第2期111-113,共3页
目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)启动子多态性与脑梗塞 (CI)的相关性。方法 用序列特异性引物和荧光染料SYBRGreenⅠ聚合酶链式反应 (PCR)结合熔链曲线分析 ,对 4 2例脑梗塞患者 (CI组 )和 31例健康者 (对照组 )的肿瘤坏死因子α多态... 目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)启动子多态性与脑梗塞 (CI)的相关性。方法 用序列特异性引物和荧光染料SYBRGreenⅠ聚合酶链式反应 (PCR)结合熔链曲线分析 ,对 4 2例脑梗塞患者 (CI组 )和 31例健康者 (对照组 )的肿瘤坏死因子α多态性进行分型。结果 TNFα等位基因分布频率在CI组和对照组之间的差异无显著性。结论 肿瘤坏死因子α基因多态性与CI的发病可能无关联。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子Α 基因多态性 脑梗塞 CI TNFΑ 单核苷酸多态性
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紫贻贝EST-SNP的筛选及多态性检测 被引量:8
9
作者 李宏俊 梁瑜 +4 位作者 邢坤 苏浩 高祥刚 隋立军 赫崇波 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期348-355,共8页
利用EST数据库开发SNP是筛选SNP标记的重要途径。本研究利用EST数据库开发紫贻贝的SNP标记,利用QualitySNP软件对紫贻贝已有的19 709条EST序列中含有4条以上同源序列的重叠群进行分析,在含有4条以上同源序列的963个重叠群中,筛选得到候... 利用EST数据库开发SNP是筛选SNP标记的重要途径。本研究利用EST数据库开发紫贻贝的SNP标记,利用QualitySNP软件对紫贻贝已有的19 709条EST序列中含有4条以上同源序列的重叠群进行分析,在含有4条以上同源序列的963个重叠群中,筛选得到候选SNP位点4 833个,SNP的平均频率为129.1 bp,其中C/T和A/G突变较多,分别占总数的28.8%和27.4%。根据候选SNP位点设计30组引物,通过等位基因特异性PCR结合溶解曲线分析,在30个野生个体中进行基因分型验证,6组引物(20%)没有扩增产物,10组引物(33%)没有多态性,14组(47%)引物具有二等位基因多态性,稀有等位基因的频率为0.083~0.446,观测杂合度和期望杂合度的范围分别为0.166 7~0.615 4和0.155 4~0.503 2。序列比对结果显示,14组引物中的12个SNP位点位于基因编码区,并且全部为同义突变。研究结果表明,EST数据库中存在大量的SNP位点,差异熔解曲线法是一种高效便捷的SNP分型方法,所筛选的SNP标记可用于紫贻贝遗传学分析。 展开更多
关键词 紫贻贝 单核苷酸多态性 表达序列标签 等位基因特异性PCR 熔解曲线
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SYBR Green实时荧光PCR快速鉴定枣实蝇技术 被引量:8
10
作者 程晓甜 阿地力·沙塔尔 +2 位作者 张伟 李新泉 玛依拉 《林业科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第4期60-65,共6页
应用SYBR Green实时荧光PCR技术,建立SYBR Green实时荧光PCR快速鉴定枣实蝇的方法。利用枣实蝇(mtDNA)中COⅠ基因序列,设计筛选出1对种的特异引物CarF/CarR。引物的特异性分别用桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇和桃果实蝇5种... 应用SYBR Green实时荧光PCR技术,建立SYBR Green实时荧光PCR快速鉴定枣实蝇的方法。利用枣实蝇(mtDNA)中COⅠ基因序列,设计筛选出1对种的特异引物CarF/CarR。引物的特异性分别用桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇和桃果实蝇5种实蝇来验证。SYBR Green PCR实时荧光反应的灵敏度用40,20,10,1,0.1,0.01,0.001 ng·μL^-1 7个浓度枣实蝇DNA模板来检测。结果表明:SYBR Green PCR的检测限度达0.01 ng·μL^-1以下,最适模板DNA浓度为1~20 ng·μL^-1。SYBR Green实时荧光PCR的可靠性可用枣实蝇不同虫态(幼虫、蛹、成虫)的扩增曲线、熔解曲线及PCR产物的琼脂糖凝胶电泳来检验。成虫、幼虫和蛹3种不同虫态的枣实蝇有一致的扩增曲线,熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳条带分别用来确认实时荧光PCR产物的特异性;其平均熔解温度为(75.3±0.1)℃,并获得一段长为205 bp的特异性目标片段,说明在枣实蝇成虫为模板的基础上建立的SYBR Green实时荧光PCR方法同时适用于幼虫、蛹的快速鉴定,可将不同虫态的枣实蝇与近似种类区分开来。 展开更多
关键词 枣实蝇 SYBR Green 实时荧光PCR 溶解曲线 鉴定
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一起聚集性腺病毒暴发疫情的调查及病原学分析 被引量:7
11
作者 王慎骄 龚利强 +7 位作者 陈立凌 许可 付建光 秦圆方 邓斐 余慧燕 霍翔 鲍昌俊 《江苏预防医学》 CAS 2017年第4期407-410,共4页
目的对一起流感样暴发疫情进行流行病学调查和病原学检测,对毒株进行分子流行病学分析,为呼吸道传染病暴发疫情的处置提供依据。方法对暴发疫情进行流行病学调查,收集病例咽拭子样本,采用RespiFinder 2SMART多病原检测试剂盒进行熔解曲... 目的对一起流感样暴发疫情进行流行病学调查和病原学检测,对毒株进行分子流行病学分析,为呼吸道传染病暴发疫情的处置提供依据。方法对暴发疫情进行流行病学调查,收集病例咽拭子样本,采用RespiFinder 2SMART多病原检测试剂盒进行熔解曲线分析,筛查致病原,并以qPCR法确认。用Hep-2细胞分离病毒,提取毒株核酸进行PCR扩增并进行序列分析,NCBI核酸数据库进行序列比对,确定型别。结果疫情累计发病17例,仅涉及一个班级,班级罹患率43.6%,男女比1.8∶1,疫情持续11d。主要症状为发热(17例,100.0%)、咳嗽(16例,94.1%)等。采集10例病例咽拭子,5份以多病原检测试剂盒进行熔解曲线分析,检出2例为腺病毒(ADV)核酸阳性,其余5份经qPCR检测,3份为ADV核酸阳性。以Hep-2细胞分离5份ADV核酸阳性标本,成功分离4株毒株,对其进行DNA测序,NCBI核酸数据库进行Blast序列比对,结果显示其六邻体保守区核酸与ADV3型核酸同源性为97%。结论该暴发是一起由ADV3型引起的暴发疫情。 展开更多
关键词 腺病毒3型 熔解曲线 流行病学调查 病原学分析 序列比对 暴发疫情
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运用SYBR Green Ⅰ熔解曲线法检测饲料中牛、羊源性成分的研究 被引量:7
12
作者 班付国 刘宏伟 +1 位作者 高延玲 马俊 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第2期128-131,共4页
试验旨在建立SYBR GreenⅠ熔解曲线法对饲料中牛、羊源成分进行检测,以SYBR GreenⅠ为荧光染料,通过优化PCR反应体系,提高了检测灵敏度。在随机抽检的145批样品中,与国标法(GB/T20190-2006)相比,SYBR GreenⅠ熔解曲线法的准确性达到了10... 试验旨在建立SYBR GreenⅠ熔解曲线法对饲料中牛、羊源成分进行检测,以SYBR GreenⅠ为荧光染料,通过优化PCR反应体系,提高了检测灵敏度。在随机抽检的145批样品中,与国标法(GB/T20190-2006)相比,SYBR GreenⅠ熔解曲线法的准确性达到了100%,此方法可作为饲料中牛羊源成分检测的一种方法。 展开更多
关键词 牛羊源成分 SYBR Green 荧光染料 熔解曲线
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甲型流感病毒快速基因分型POCT方法的建立 被引量:7
13
作者 王大刚 王雅杰 +6 位作者 潘美晨 焦炳欣 郭杰 王爽 郭晶晶 徐飞 吴吟妮 《传染病信息》 2019年第4期307-311,共5页
目的建立一种无需核酸提取,直接检测鼻咽拭子中甲型流感病毒H1HA pdm09、H3HA亚型和季节性流感病毒H1HA non-pdm09的POCT快速分型方法。方法针对3种流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因序列保守区设计高度特异性的引物和HyBeacon探... 目的建立一种无需核酸提取,直接检测鼻咽拭子中甲型流感病毒H1HA pdm09、H3HA亚型和季节性流感病毒H1HA non-pdm09的POCT快速分型方法。方法针对3种流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因序列保守区设计高度特异性的引物和HyBeacon探针,同时以人类RNaseP基因作为内参。优化多重PCR反应条件,建立用熔解曲线分析甲型流感病毒基因分型的方法,并将其应用到ParaDNA核酸POCT检测仪,对50例甲型流感病毒抗原初筛阳性且经过实时荧光定量PCR检测的临床鼻咽拭子标本进行检测。结果该方法可在1.5 h内完成对3种甲型流感病毒亚型HA基因的特异性扩增和分型,与其他7种呼吸道病原微生物无交叉反应,其核酸检测下限为50 copies/μl。对临床50例甲型流感病毒抗原阳性的鼻咽拭子标本进行直接检测,检出H1HA pdm09阳性标本48例,H3HA阳性标本2例,未检出季节性流感H1HA nonpdm09阳性标本。结论基于HyBeacon探针和ParaDNA核酸POCT检测仪所建立的甲型流感病毒快速分型方法能同时检测H1HA pdm09、H3HA和季节性流感病毒H1HA non-pdm09。该方法无需核酸提取,操作简便,检测时间短,适于对甲型流感病毒抗原初筛阳性的鼻咽拭子开展现场基因分型检测,可为流感的诊治和防控提供及时快速的实验室依据。 展开更多
关键词 甲型流感 HyBeacon探针 熔解曲线 ParaDNA 基因分型
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山羊痘病毒SYBR Green I荧光PCR检测方法的建立 被引量:7
14
作者 罗阿东 唐源 +3 位作者 文明 岳筠 程振涛 徐春志 《山地农业生物学报》 2008年第6期503-507,共5页
为建立山羊痘病毒(goat pox virus,GPV)的SYBR Green I荧光PCR方法,根据GPV的反向末端重复序列(Inverted Terminal Repeat,ITR)的核苷酸序列设计引物。以此引物和山羊痘皮肤痘疹提取的DNA为模板,建立并优化SYBR Green I模式荧光PCR检测... 为建立山羊痘病毒(goat pox virus,GPV)的SYBR Green I荧光PCR方法,根据GPV的反向末端重复序列(Inverted Terminal Repeat,ITR)的核苷酸序列设计引物。以此引物和山羊痘皮肤痘疹提取的DNA为模板,建立并优化SYBR Green I模式荧光PCR检测GPV的ITR基因的方法,并与普通PCR方法进行敏感性比较。结果表明,此次建立的检测GPV的SYBR Green I荧光PCR方法能检测出7×102拷贝数的DNA模板,此法比文献报道的普通PCR法更敏感、准确、快速。 展开更多
关键词 山羊痘病毒 实时定量PCR 熔解曲线
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一种新型鸭呼肠孤病毒SYBR GreenⅡ荧光定量PCR方法的建立 被引量:7
15
作者 丁明洋 戚伟强 +6 位作者 陈宗艳 朱杰 吴巧梅 缪秋红 李传峰 吴润 刘光清 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2016年第1期7-14,共8页
该研究旨在建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)的荧光定量PCR诊断方法。本实验以感染新型鸭呼肠孤病毒的鸭组织RNA提取物为模板,根据Gen Bank数据库中呼肠孤病毒S1基因全序列,设计合成了一对... 该研究旨在建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)的荧光定量PCR诊断方法。本实验以感染新型鸭呼肠孤病毒的鸭组织RNA提取物为模板,根据Gen Bank数据库中呼肠孤病毒S1基因全序列,设计合成了一对特异性引物,PCR扩增基因片段,将其克隆至p ET-30a载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立SYBR Green II荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测。经测序证实扩增片段与预期目的片段相符,所建立的SYBR Green II荧光定量PCR检测S1的反应在101~108 copies/u L之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10 copies/μL,而H5型禽流感病毒、H9型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、C型鸭肝炎病毒、新城疫病毒、鹅细小病毒、鸭瘟病毒等病毒的检测为阴性,表明该方法敏感、特异。本研究成功建立了SYBR Green II荧光定量PCR检测新型鸭呼肠孤病毒的方法,为新型鸭呼肠孤病毒致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台。 展开更多
关键词 新型鸭呼肠孤病毒 S1 荧光定量PCR 熔解曲线 检测
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SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测西尼罗病毒 被引量:5
16
作者 罗招凡 丁鹤林 刘建伟 《中华医院感染学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期1031-1034,共4页
目的建立快速、敏感和特异的检测西尼罗病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法,用于西尼罗病毒(WNV)疾病的早期诊断。方法采用RT-PCR扩增WNV基因片段,将其克隆至T载体,重组质粒测序并进行同源性分析;阳性质粒用于替代WNV,以阳性质粒为模板,建... 目的建立快速、敏感和特异的检测西尼罗病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法,用于西尼罗病毒(WNV)疾病的早期诊断。方法采用RT-PCR扩增WNV基因片段,将其克隆至T载体,重组质粒测序并进行同源性分析;阳性质粒用于替代WNV,以阳性质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测。结果经测序证实扩增片段属于WNV,所建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法可检测到10拷贝的西尼罗病毒RNA,而对其他黄病毒科成员日本脑炎病毒及登革热病毒的检测则为阴性,表明该方法特异。结论SYBR GreenⅠ荧光定量PCR简便快速,具有较高的敏感性和特异性,可以成为一种早期检测西尼罗病毒的新方法。 展开更多
关键词 西尼罗病毒 荧光定量PCR 熔解曲线 检测
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二重环介导等温扩增法快速检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌 被引量:7
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作者 徐文文 梁玉林 +6 位作者 王云霞 刘秀 尹建军 周广军 宋全厚 丁梦璇 周鹏飞 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期241-246,共6页
为建立能够同时检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。针对沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因保守区域设计LAMP引物,优化引物浓度,并通过熔解曲线分析判... 为建立能够同时检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。针对沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因保守区域设计LAMP引物,优化引物浓度,并通过熔解曲线分析判断扩增靶标来源,建立同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重LAMP检测方法。结果表明,当沙门氏菌与金黄色葡萄球菌引物浓度比为3∶1时,建立的二重检测体系扩增效率最佳;该方法特异性强、灵敏度高,对6株目标菌株和9株非目标菌株进行检测,未产生任何假阳性和假阴性结果,对2种食源性致病菌的检测灵敏度均达到102 fg/μL;根据熔解曲线中的退火温度可准确判断目标菌株,实现不同菌株的有效区分。建立的二重LAMP方法可用于乳制品企业大规模乳粉样品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的现场快速筛查。 展开更多
关键词 等温扩增 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 熔解曲线 快速检测
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杂交探针技术结合熔解曲线鉴别川贝母与伊贝母的研究 被引量:7
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作者 潘杰 陈虹 +2 位作者 冯睿 胡青 季申 《中药新药与临床药理》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期344-348,共5页
目的建立一种快速、准确鉴别川贝母和伊贝母的方法。方法针对川贝母与伊贝母的ITS1基因特异性位点设计杂交探针,采用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增特异性片段,将其与探针杂交后,引发荧光共振能量转移,通过实时PCR仪... 目的建立一种快速、准确鉴别川贝母和伊贝母的方法。方法针对川贝母与伊贝母的ITS1基因特异性位点设计杂交探针,采用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增特异性片段,将其与探针杂交后,引发荧光共振能量转移,通过实时PCR仪绘制目标DNA片段扩增过程中的熔解曲线,根据熔解温度(Melting Temperature,T_m)对川贝母正伪品进行分析。结果两种贝母的熔解曲线、T_m具有特异性,通过该方法可以有效鉴别出川贝母和伊贝母,模版DNA最低检出限达到了0.2 pg,具有较高的灵敏度。结论该技术可用于川贝母质量控制,可作为《中国药典》方法的有效补充,对其他疑难品种的鉴别具有借鉴作用。 展开更多
关键词 川贝母 伊贝母 杂交探针 熔解曲线 鉴别
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基于探针熔解曲线分析技术的非缺失型地中海贫血基因检测方法的建立 被引量:6
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作者 胡晓艳 吴宇亮 +3 位作者 李科铮 钟宇萍 徐颂周 王存艳 《广东医学》 CAS 2019年第17期2444-2449,共6页
目的结合多重不对称PCR技术和荧光探针熔解曲线法,建立一种快速、准确、简便的非缺失型地中海贫血基因检测方法。方法设计针对9个常见非缺失型地中海贫血基因位点(αWSα、αQSα、αCSα、βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD... 目的结合多重不对称PCR技术和荧光探针熔解曲线法,建立一种快速、准确、简便的非缺失型地中海贫血基因检测方法。方法设计针对9个常见非缺失型地中海贫血基因位点(αWSα、αQSα、αCSα、βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD-71-72、βCD-26)的引物对、荧光探针以及对应等位基因的靶序列;使用熔解曲线法验证荧光探针与对应等位基因的靶序列的工作效果,确认不同基因型的熔解温度;使用30份已知基因型别的临床样本,提取全血样本的DNA并PCR扩增其9个等位基因目标片段,利用对应荧光探针的熔解温度变化区分不同位点的基因型;收集疑似地中海贫血病例的血液样本200例,按照双盲对照实验原则,分别用反向斑点杂交法试剂盒和多重不对称PCR探针熔解曲线法对这200例样本进行基因分型检测,比较两种方法的结果是否一致,并对两种方法的优缺点进行比较。结果多重不对称PCR探针熔解曲线法可以同时对9个非缺失型地中海贫血的基因位点进行检测,并通过对应荧光探针的熔解温度的变化区分不同位点的基因型,检测结果与反向斑点杂交法相比较有相同的准确度,且有操作简便、耗时短、成本低、污染风险低等优势。结论本研究建立了一种基于多重不对称PCR探针熔解曲线的基因分型方法,并成功用于9个非缺失型地中海贫血基因位点的诊断,该方法是一种简便、快速、低成本的检测方法,在地中海贫血筛查中有较好的应用前景。 展开更多
关键词 地中海贫血 多重不对称PCR 荧光探针 熔解曲线
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采用荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCR alpha链CDR3谱系漂移技术的初步探讨 被引量:6
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作者 汤贤英 孙永苹 +4 位作者 马锐 朱红倩 田祖国 孙万邦 姚新生 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期727-730,共4页
目的:初步探讨荧光定量PCR溶解曲线分析技术监测人外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法:提取4例正常人、2例淋巴瘤型白血病患者PBMC中的总RNA,逆转录成cDNA,以32个人TCRalpha链胚系可变区基因家族(TRAV)设计上... 目的:初步探讨荧光定量PCR溶解曲线分析技术监测人外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法:提取4例正常人、2例淋巴瘤型白血病患者PBMC中的总RNA,逆转录成cDNA,以32个人TCRalpha链胚系可变区基因家族(TRAV)设计上游引物,共同的TCRalpha胚系链恒定区基因家族(TRAC)设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果:正常人外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的溶解曲线谱型图(melting curve spectratyping)呈现熔点不同的CDR3多态性,为多克隆增生的高斯分布,2例淋巴瘤型白血病患者外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,部分家族呈缺失状态,患者各家族PCR产物的溶解曲线谱型图上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论:荧光定量PCR溶解曲线分析TCRalpha链CDR3谱系漂移技术方法稳定简便,能较好地监测正常人和临床样本外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。 展开更多
关键词 T淋巴细胞受体 互补决定区3 荧光定量PCR 溶解曲线
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