单纯疱疹Ⅱ型病毒UL29基因shRNA表达载体的干扰效应 被引量：7

1

作者 黄畅 潘晓瑜 +1 位作者 袁俊杰 吕延成 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2014年第5期691-694,共4页

目的:应用RNA干扰技术,针对单纯疱疹Ⅱ型病毒(HSV-2)UL29基因构建短发夹RNA重组表达载体,观察其对HSV-2的干扰效应。方法:针对HSV-2 UL29基因筛选出4条拟干扰靶位点序列,分别设计、合成4组靶向UL29基因shRNA的基因真核表达载体。通过脂... 目的:应用RNA干扰技术,针对单纯疱疹Ⅱ型病毒(HSV-2)UL29基因构建短发夹RNA重组表达载体,观察其对HSV-2的干扰效应。方法:针对HSV-2 UL29基因筛选出4条拟干扰靶位点序列,分别设计、合成4组靶向UL29基因shRNA的基因真核表达载体。通过脂质体转染到HEK293细胞。再将HSV-2接种到HEK293细胞中。采用终点滴定法检测病毒滴度,RT-PCR检测shRNA对转录水平的影响,Western-blot检测shRNA对蛋白质表达水平的影响。结果:终点滴定法结果显示UL29shRNA各组均可不同程度降低病毒感染滴度,与空白组(未转染重组表达载体)比较差异显著(P<0.01)。RT-PCR结果显示,与空白组比较,4组抑制率分别为28.80%、59.95%、66.08%、36.27%,差异均具有显著性(P<0.05),shRNANC(不针对任何基因的序列)与空白组相比差异无显著性,其中以UL29shRNA1461组效果为最佳。Western-blot检测表明UL29shRNA各组ICP8蛋白表达水平比阴性对照组明显降低。结论:UL29shRNA能有效干扰HSV-2UL29基因的表达,抑制HSV-2在HEK293细胞中的复制。 展开更多

关键词 疱疹病毒2型 人 rna干扰 shrna UL29基因

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抗草鱼出血病病毒转基因稀有鮈鲫的初步研究 被引量：7

2

作者 廖莎 陈芸 +3 位作者 杜富宽 汪亚平 廖兰杰 朱作言 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期837-842,共6页

研究采用草鱼H1基因启动子,以草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)外衣壳蛋白VP7基因为靶基因,以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)为报告基因,构建了3个小发卡RNA(shRNA)表达载体pH1siGCRV(x)-CMVeGFP。CIK细胞感染实验表明,pH1siGCRV2-C... 研究采用草鱼H1基因启动子,以草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)外衣壳蛋白VP7基因为靶基因,以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)为报告基因,构建了3个小发卡RNA(shRNA)表达载体pH1siGCRV(x)-CMVeGFP。CIK细胞感染实验表明,pH1siGCRV2-CMVeGFP具有较高的病毒抑制作用。通过显微注射将pH1siGCRV2-CMVeGFP导入稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)受精卵,获得转基因稀有鮈鲫P0代群体。转基因稀有鮈鲫攻毒实验显示,转基因稀有鮈鲫死亡率为30%,抗草鱼出血病能力显著提高。进一步的实时荧光定量PCR检测证实,转基因稀有鮈鲫脾脏、后肠和肝脏中GCRV的含量显著低于对照鱼,并随着时间的延续逐渐减少,转基因稀有鮈鲫体内GCRV的复制受到有效抑制。研究为抗草鱼出血病转基因鱼育种奠定重要基础。 展开更多

关键词 rna干扰 小发夹rna 草鱼出血病病毒 转基因鱼

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shRNA表达载体对HSV-2 ICP4基因的干扰效应 被引量：3

3

作者 袁俊杰 吕延成 《遵义医学院学报》 2013年第1期21-24,共4页

目的构建针对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2) ICP4基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达载体,探究该载体表达的shRNA对HSV-2的抑制作用。方法重组表达载体通过脂质体转染法转染HEK293细胞,并接种HSV-2,48h后,实时荧光定量RT-PCR检测mRNA转录情况,We... 目的构建针对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2) ICP4基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达载体,探究该载体表达的shRNA对HSV-2的抑制作用。方法重组表达载体通过脂质体转染法转染HEK293细胞,并接种HSV-2,48h后,实时荧光定量RT-PCR检测mRNA转录情况,Western blot检测ICP4蛋白的表达情况,终点滴定法测定病毒的滴度。结果与对照组相比,干扰组对mRNA抑制率为71%,使蛋白表达减少71.81%,并且病毒滴度也明显降低(P<0.05)。结论构建的pGPU6/Neo-shRNA ICP4重组质粒表达载体能在体外细胞水平上干扰HSV-2 ICP4的基因表达,抑制HSV-2在细胞中复制。 展开更多

关键词 rna干扰 短发夹rna 质粒载体 Ⅱ型单纯疱疹病毒 ICP4基因

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小发夹RNA在稀有鮈鲫胚胎中的表达 被引量：1

4

作者 杨琳 汪亚平 +1 位作者 廖兰杰 朱作言 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期1031-1036,共6页

由小的干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来快速发展的一种转录后基因沉默方法,已被广泛的应用于基因功能的研究,基因网络调控的探讨以及疾病的治疗等方面。多数的siRNA表达载体依赖RNA... 由小的干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来快速发展的一种转录后基因沉默方法,已被广泛的应用于基因功能的研究,基因网络调控的探讨以及疾病的治疗等方面。多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶Ⅲ启动子中的一种,操纵一段短发夹结构RNA(Small hairpin RNA,shRNA)在细胞或体内表达。这一类启动子主要包括人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子等。为了探明鱼类自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子是否能有效驱动shRNA在鱼体内表达,从而更好地利用RNAi进行鱼类基因功能和抗病毒研究,研究利用斑马鱼的H1和U6启动子以及草鱼的H1启动子,以草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)外衣壳蛋白VP7基因为靶基因,以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)为报告基因,分别构建了三个shRNA表达载体:pZH1siGCRV-CMVeGFP、pZU6siGCRV-CMVeGFP和pCH1siGCRV-CMVeGFP。通过显微注射将三种表达载体分别导入稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)受精卵中。由于siRNA片段很短,其表达检测非常困难,研究采用stem-loop RT-PCR方法,对稀有鮈鲫胚胎发育不同时期的shRNA表达进行了检测。研究结果表明,采用的三种鱼类自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子均能有效驱动GCRVsiRNA的表达;在取样的各个胚胎发育时期均能检测到GCRV siRNA的表达;stem-loop RT-PCR方法可以便捷检测siRNA的表达。研究构建的鱼类胚胎siRNA有效持续表达载体,建立的简易快捷siRNA检测方法,为进一步的抗GCRV转基因鱼研制以及siRNA的病毒复制干扰机制研究奠定了重要基础并提供有力的技术支撑。 展开更多

关键词 rna干扰 小干扰rna 小发夹rna Stem-loopRT-PCR 草鱼出血病病毒

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靶向乳头瘤病毒18型E6基因的shRNA表达载体的构建与鉴定 被引量：2

5

作者 王雪莲 王冬冬 +3 位作者 安春丽 张丽 李唯 肖纯凌 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2010年第1期1-5,共5页

目的以乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)18型E6基因为靶标,构建小发夹状RNA(small hairpinRNA,shRNA)表达载体。方法人工方法合成针对靶序列的两条寡核苷酸链,两端加入酶切位点。寡核苷酸链退火后与酶切的线性化表达载体连接。连... 目的以乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)18型E6基因为靶标,构建小发夹状RNA(small hairpinRNA,shRNA)表达载体。方法人工方法合成针对靶序列的两条寡核苷酸链,两端加入酶切位点。寡核苷酸链退火后与酶切的线性化表达载体连接。连接产物转化大肠埃希菌,卡那霉素筛选阳性克隆。结果重组质粒酶切片段约为400 bp,与插入片段大小一致。DNA序列分析证实插入片段序列与预期一致。结论成功构建HPV shRNA表达载体pHPV1、pHPV2。 展开更多

关键词 乳头瘤病毒 小发夹状rna E6

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大鼠野生型Egr-1基因及Egr-1 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定 被引量：2

6

作者 刘炘 刘丽莎 +2 位作者 邱文 夏梅 王迎伟 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期607-611,共5页

目的:构建大鼠野生型早期生长应答基因-1(early growth responsegene-1,Egr-1)及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察Egr-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默Egr-1基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠Eg... 目的:构建大鼠野生型早期生长应答基因-1(early growth responsegene-1,Egr-1)及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察Egr-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默Egr-1基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠Egr-1基因的CDS区序列和针对其不同位点所设计的3对shRNA序列分别克隆到真核表达质粒pcDNA3.1-myc-his-A和pGCsi.U6.neo.GFP中。经酶切分析及序列测定正确后,用GenEscortTMⅢ转染试剂将上述两种质粒分别转染至大鼠GMC中,随后进行Western blot检测Egr-1蛋白的表达及筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性内切酶酶切及核酸序列分析证明,两种重组质粒均构建正确。Westernblot分析表明,构建的pcDNA3.1/Egr-1质粒在大鼠GMC中能够表达;Egr-1shRNA-2具有最佳沉默效率。结论:成功构建了大鼠野生型Egr-1基因和其特异性的shRNA真核表达质粒,为进一步研究Egr-1基因的生物学功能提供了必要的实验工具。 展开更多

关键词 早期生长应答基因-1 短发夹式小干涉rna 肾小球系膜细胞

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靶向大鼠C5aR基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定 被引量：1

7

作者 张泽英 高小龙 刘东旭 《现代免疫学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期197-202,共6页

构建靶向大鼠C5aR基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,验证C5aR蛋白的功能,为后续进一步研究C5aR在免疫治疗中的作用奠定基础。具体方法是根据基因库提供的大鼠C5aR mRNA核苷酸序列(序列号:NM_053619),设计并合成短发夹结构的互补DNA序列,... 构建靶向大鼠C5aR基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,验证C5aR蛋白的功能,为后续进一步研究C5aR在免疫治疗中的作用奠定基础。具体方法是根据基因库提供的大鼠C5aR mRNA核苷酸序列(序列号:NM_053619),设计并合成短发夹结构的互补DNA序列,克隆到经BamHI和EcoR I双酶切的线性化质粒pLVX-shRNA,构建重组质粒,并予以DNA测序鉴定。重组干扰质粒构建成功后,通过脂质体2000转染大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E,LPS处理后收集细胞,采用荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)和Western blotting法检测干扰质粒对C5aR基因的表达抑制效应。通过尾静脉高压注射技术将重组干扰质粒导入Wistar大鼠肾脏,采用腹腔注射LPS方法复制脓毒血症急性肾损伤模型,大鼠随机分为正常对照组、LPS处理组、LPS+C5aR shRNA转染组,采用ELISA方法检测血清中Cr、BUN以及TNF-α、IL-6等炎性因子的含量。结果显示构建的shRNA序列经DNA测序证实与设计序列完全一致,重组质粒构建成功。转染C5aR shRNA后,NRK-52E细胞中C5aR mRNA和C5aR蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。该重组干扰质粒能有效抑制C5aR基因的表达,能显著抑制由LPS诱导的TNF-α、IL-6等炎性因子的释放,改善大鼠肾脏功能,对LPS诱导的肾脓毒血症损伤具有明显保护作用。 展开更多

关键词 C5A受体 rna干扰 短发夹rna

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人耐药白血病细胞多药耐药基因-1小干扰RNA的构建及功能研究

8

作者 格根通拉嘎 马玉珍 +3 位作者 石玉涛 张继英 刘洋 扈廷茂 《现代生物医学进展》 CAS 2009年第19期3647-3650,共4页

目的:构建人耐药白血病细胞多药耐药基因-1小干扰RNA并研究其功能。方法:人工合成编码mdr1小发夹状双链RNA的DNA片段,与pSilencer4.1-CMV质粒连接构建RNAi真核表达载体,采用脂质体介导法转染人耐药白血病细胞K562/A,经潮霉素B筛选转基... 目的:构建人耐药白血病细胞多药耐药基因-1小干扰RNA并研究其功能。方法:人工合成编码mdr1小发夹状双链RNA的DNA片段,与pSilencer4.1-CMV质粒连接构建RNAi真核表达载体,采用脂质体介导法转染人耐药白血病细胞K562/A,经潮霉素B筛选转基因阳性克隆细胞,RT-PCR和Western Blotting检测转基因细胞中mdr1基因的表达量,MTT法检测转基因细胞对阿霉素的敏感性。结果:RT-PCR结果显示,与未转基因组和阴性对照组比较,RNA干扰组mdr1基因在mRNA水平上表达量降低43.55%;Western Blotting检测显示,RNA干扰组mdr1基因在蛋白水平上表达量降低69.46%;MTT法检测显示mdr1干扰细胞对化疗药物柔红霉素的敏感性提高23倍。结论:mdr1小发夹状RNA可显著抑制K562/A细胞中的mdr1基因的表达,提高白血病细胞对化疗药物的敏感性,对白血病多药耐药性的逆转和白血病的治疗具有重要理论和实际意义。 展开更多

关键词 rna干扰 shrna mdr1 K562/A

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人卵泡抑素基因短发夹RNA表达质粒的构建及其干扰效果的初步鉴定

9

作者 莫毅 梁方方 +3 位作者 陈月凤 江如兰 叶健 谢丹尼 《中国计划生育学杂志》 2013年第4期231-233,共3页

目的:构建人卵泡抑素(FS)基因短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,并瞬时转染方式初步鉴定其干扰效果。方法:依据GenBank数据库提供的人FS基因mRNA核苷酸序列,利用Ambion网站上siRNA软件设计shRNA干扰靶序列,将该序列克隆到线性化的pLKO.1质... 目的:构建人卵泡抑素(FS)基因短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,并瞬时转染方式初步鉴定其干扰效果。方法:依据GenBank数据库提供的人FS基因mRNA核苷酸序列,利用Ambion网站上siRNA软件设计shRNA干扰靶序列,将该序列克隆到线性化的pLKO.1质粒载体上,构建pLKO.1-FS-shRNA重组质粒,并进行酶切和测序鉴定。确认质粒构建成功后,用脂质体(Lipofectamine TM 2000)将重组质粒瞬时转染3AO人卵巢癌细胞系,并用实时定量反转录PCR法检测重组质粒对FS基因的表达抑制效果。结果:构建的shRNA序列经DNA测序证实与设计序列完全一致;实时定量反转录PCR结果显示pLKO.1-FS-shRNA重组质粒瞬时转染的3AO人卵巢癌细胞后,细胞中的FS基因转录受到抑制,抑制率达59%。结论:成功构建了靶向人FS基因的shRNA干扰靶序列重组质粒(PLKO.1-FS-shRNA),转染后对人卵巢癌细胞系FS基因的表达具抑制效果,该实验为进一步研究FS基因的生物学功能奠定基础。 展开更多

关键词 卵泡抑素基因 rna干扰 小发夹rna

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前列腺癌基因治疗XIAP-shRNA表达载体的构建及鉴定

10

作者 娄禄 徐觉剑 +2 位作者 孙方浩 魏晋 李文智 《泌尿外科杂志（电子版）》 2020年第3期46-51,共6页

目的为了研究X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)对前列腺癌的作用,构建靶向XIAP基因的小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体.方法设计3对针对XIAP基因不同位点的shRNA片段,构建携带此shRNA片段... 目的为了研究X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)对前列腺癌的作用,构建靶向XIAP基因的小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体.方法设计3对针对XIAP基因不同位点的shRNA片段,构建携带此shRNA片段的真核表达载体pGPU6/GFP/Neo-XIAP,分别命名为XIAP-shRNA1、XIAP-shRNA2和XIAP-shRNA3,进行酶切及测序鉴定.通过脂质体转染人前列腺癌细胞株DU145,并优化转染率.结果测序证明干扰序列完全正确,当质粒与脂质体比例1μg:2μl时转染率最高.结论成功构建重组质粒pGPU6/GFP/Neo-XIAP,为进一步研究XIAP基因在前列腺癌基因治疗奠定了基础. 展开更多

关键词 X连锁凋亡抑制蛋白 rna干扰 小发夹rna 前列腺癌

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驱动蛋白Kif5b对人脐静脉内皮细胞血管形成的作用

11

作者 罗语思 肖美兰 +1 位作者 陈妍 张科 《贵州医科大学学报》 CAS 2021年第1期32-37,共6页

目的 探讨驱动蛋白Kif5b对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管形成的作用。方法 以人Kif5b基因序列为模板设计小发夹RNA(sh RNA)序列,同时设阴性对照sh RNA,均以p LL3.7慢病毒包装系统包装sh RNA,随后感染HUVECs敲减Kif5b蛋白,最后将Kif5b敲... 目的 探讨驱动蛋白Kif5b对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管形成的作用。方法 以人Kif5b基因序列为模板设计小发夹RNA(sh RNA)序列,同时设阴性对照sh RNA,均以p LL3.7慢病毒包装系统包装sh RNA,随后感染HUVECs敲减Kif5b蛋白,最后将Kif5b敲减的HUVECs作为Kif5b实验组,阴性对照组作为Kif5b对照组;采用Western blot实验检测2组HUVECs中Kif5b的表达,采用细胞成管实验和细胞划痕实验分别检测2组HUVECs的细胞成管率和细胞迁移速度。结果 Kif5b实验组HUVECs的Kif5b表达较Kif5b对照组下降,差异有统计学意义(P<0.05);Kif5b实验组HUVECs细胞成管率明显低于Kif5b对照组,差异有高度统计学意义(P<0.000 1);Kif5b实验组HUVECs细胞迁移速度明显低于Kif5b对照组,差异有高度统计学意义(P<0.000 1)。结论 在体外实验中,驱动蛋白Kif5b能够正向调控HUVECs血管形成。 展开更多

关键词 驱动蛋白 Kif5b蛋白 人脐静脉内皮细胞 小发夹rna 细胞成管率 细胞迁移速度 血管形成

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UL29shRNA表达质粒与ACV对HSV-2抑制效果的比较

12

作者 仵立佳 吕延成 +2 位作者 兰小凇 潘晓瑜 丁娟 《现代生物医学进展》 CAS 2016年第11期2057-2060,2086,共5页

目的:通过将筛选的UL29shRNA表达质粒与抗病毒药物阿昔洛韦(ACV)的抗病毒效果及细胞毒性进行比较,探讨RNA干扰在细胞水平上对HSV-2病毒的抑制效果。方法:将筛选的干扰效果最好的表达质粒UL29-shRNA1641作为RNA干扰组与抗病毒药ACV进行对... 目的:通过将筛选的UL29shRNA表达质粒与抗病毒药物阿昔洛韦(ACV)的抗病毒效果及细胞毒性进行比较,探讨RNA干扰在细胞水平上对HSV-2病毒的抑制效果。方法:将筛选的干扰效果最好的表达质粒UL29-shRNA1641作为RNA干扰组与抗病毒药ACV进行对HSV-2的抑制效果的比较研究,分为RNAi组、ACV组和RNAi+ACV组。采用实时荧光定量PCR检测UL29mRNA的相对表达量,Karber法检测细胞上清液中病毒滴度的变化、蛋白印迹法(Western blot)检测ICP8的相对表达量,对RNAi与ACV抑制效果进行比较,通过WST-1(Water-Soluble Tetrazolium-1)法对质粒转染复合物(质粒+转染试剂)和ACV的细胞毒性进行比较。结果:RT-PCR检测三组mRNA的相对表达水平,其中RNAi组UL29基因相对表达量高于ACV组(P<0.05);RNAi+ACV组UL29基因相对表达量明显低于RNAi组和ACV组(P<0.05)。Karber法检测三组细胞上清液病毒滴度表明,RNAi组病毒滴度高于ACV组(P<0.05),RNAi+ACV组的病变病毒滴度明显低于RNAi组和ACV组(P<0.05)。Western blot检测ICP8相对表达量,ACV组的ICP8(UL29编码的单链DNA结合蛋白,主要作用是在HSV-2 DNA复制过程中与复制叉产生了单链DNA结合,防止其重新配对形成ds DNA或被核酸酶降解)相对表达量比RNAi组低(P<0.05)。RNAi+ACV组ICP8相对表达量降低最为明显,与ACV组和RNAi组相比有显著差异(P<0.05)。WST-1法对转染复合物与ACV的细胞毒性进行比较,其中RNAi中质粒和转染试剂对细胞的毒性明显小于ACV。结论:在RNAi与ACV对HSV-2抑制效果的比较中,ACV要好于RNAi,两者联合使用的抑制效果好于单独使用RNAi或ACV。在抑制效果都较好的情况下比较,RNAi中使用的质粒与转染试剂对细胞的影响比ACV小。 展开更多

关键词 rna干扰 Ⅱ型单纯疱疹病毒 UL29基因shrna 阿昔洛韦

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