食用精炼大豆油DNA提取及单管巢式PCR检测 被引量：10

1

作者 姚芹 宋浩 陈枫 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2013年第21期183-186,共4页

设计了针对转基因Roundup Ready大豆外源基因扩增的内外2对引物,分别位于CaMV35s启动子,CTP基因,CP4EPSPS基因区域,并成功对精炼大豆油中的外源基因进行单管巢式PCR检测。结果表明,用改良试剂盒法和冷冻干燥法提取大豆油中的DNA均可以... 设计了针对转基因Roundup Ready大豆外源基因扩增的内外2对引物,分别位于CaMV35s启动子,CTP基因,CP4EPSPS基因区域,并成功对精炼大豆油中的外源基因进行单管巢式PCR检测。结果表明,用改良试剂盒法和冷冻干燥法提取大豆油中的DNA均可以满足单管巢式PCR检测要求;单管巢式PCR扩增对内外引物的Tm值有特殊要求,外引物的退火温度高于内引物。本实验建立的精炼大豆油转基因成分的单管巢式PCR检测方法特异性强,灵敏度高且快速方便。 展开更多

关键词 精炼大豆油 DNA提取 CP4EPSPS基因 单管巢式pcr

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猪附红细胞体单管巢式PCR诊断方法的建立及应用 被引量：9

2

作者 郑秀红 贾立军 +1 位作者 邢莹 张守发 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期205-208,共4页

根据GenBank上发表的猪附红细胞体16S rRNA基因序列(登录号U88565)设计合成2对引物,建立了猪附红细胞体单管巢式PCR诊断方法,经酶切分析、单管巢式PCR进一步鉴定后进行序列测定,并与血涂片染色镜检、常规PCR进行了比较。结果:扩增的猪... 根据GenBank上发表的猪附红细胞体16S rRNA基因序列(登录号U88565)设计合成2对引物,建立了猪附红细胞体单管巢式PCR诊断方法,经酶切分析、单管巢式PCR进一步鉴定后进行序列测定,并与血涂片染色镜检、常规PCR进行了比较。结果:扩增的猪附红细胞体基因序列与GenBank中发表的猪附红细胞体基因序列(U88565)同源性为96%;特异性试验表明,设计的引物不能扩增弓形虫、链球菌、大肠杆菌、葡萄球菌及羊附红细胞体等病原体;敏感性试验表明,单管巢式PCR诊断方法最低能够检测出0.116 fg的标准模板DNA。通过对75份血液样本的检测表明,建立的单管巢式PCR方法明显优于血涂片染色镜检法及常规PCR方法,具有较高的敏感性和实用性。本试验建立的单管巢式PCR诊断方法具有特异、敏感、实用等优点,为猪附红细胞体的检测提供了一种新型、可靠的诊断技术。 展开更多

关键词 猪附红细胞体 单管巢式pcr 诊断技术

原文传递

咖啡叶锈病菌单管巢式PCR检测体系的建立与应用 被引量：1

3

作者 吴伟怀 刘宝慧 +5 位作者 汪全伟 鹿鹏鹏 贺春萍 梁艳琼 黄兴 易克贤 《特产研究》 2023年第5期1-7,15,共8页

由专性寄生菌咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)引起的咖啡叶锈病是小粒种咖啡生产中的一种毁灭性病害,建立高效、准确的分子检测技术对于该病害的快速鉴定与监测具有重要意义。本研究基于咖啡叶锈病菌ITS序列保守区域设计该病原菌的单... 由专性寄生菌咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)引起的咖啡叶锈病是小粒种咖啡生产中的一种毁灭性病害,建立高效、准确的分子检测技术对于该病害的快速鉴定与监测具有重要意义。本研究基于咖啡叶锈病菌ITS序列保守区域设计该病原菌的单管巢式引物对,通过单因素试验筛选外引物与内引物退火温度后,进一步对单管巢式PCR检测反应体系的内、外引物浓度、dNTPs浓度、以及rTaq酶用量等4个关键因素进行正交优化试验,从而建立高效的单管巢式PCR检测反应体系。结果表明,咖啡叶锈病菌单管巢式PCR外引物HvF1/HvR1、内引物HvF2/HvR2的最佳退火温度分别为63℃与52℃。正交试验显示,在20μL的反应体系中各组分的最佳含量分别为:10×rTaq Buffer 2.5μL,2.5 mmol/L dNTPs 3.2μL,rTaq DNA Polymerase(5 U/μL)1.8μL,7μmol/L的HvF2/HvR2各1μL,1nmol/L的HvF1/HvR1各1μL,模板DNA1μL,ddH207.5μL。所建立的单管巢式PCR检测体系具有高度特异性,能从含有咖啡叶锈病菌DNA模板中检测出特异性条带,而其他供试的非咖啡叶锈病菌DNA模板中扩增不出任何条带。该检测技术体系的最低检测限为5 fg/μL,是普通PCR灵敏度的100倍。采集的22份早期疑似病样经检测鉴定均含有咖啡驼孢锈菌。本试验建立的单管巢式检测技术可用于咖啡叶锈病菌的快速鉴定,可用于病害监测预警。 展开更多

关键词 咖啡叶锈病 驼孢锈菌 单管巢式pcr

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甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR检测体系的建立 被引量：3

4

作者 吴伟怀 刘宝慧 +4 位作者 鹿鹏鹏 梁艳琼 贺春萍 李锐 易克贤 《中国糖料》 2022年第3期1-7,共7页

由黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala Sydow)引起的甘蔗褐锈病是甘蔗生产中较为严重的叶部病害之一。建立该病原菌的高效检测与特异性鉴定技术体系,对于该病害的监测、预警以及及时采取必要的防治措施均具有重要的意义。为此,本文基于... 由黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala Sydow)引起的甘蔗褐锈病是甘蔗生产中较为严重的叶部病害之一。建立该病原菌的高效检测与特异性鉴定技术体系,对于该病害的监测、预警以及及时采取必要的防治措施均具有重要的意义。为此,本文基于甘蔗褐锈病菌ITS序列保守区域位点设计了该病原菌的单管巢式PCR引物对,对外内引物退火温度、外内引物浓度比两个方面进行筛选与优化,并对所建立的单管巢式PCR检测体系的特异性和灵敏度进行了分析。结果表明,所设计的甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR外引物PmF1/R1、内引物PmF2/R2的退火温度分别为63℃与52℃,以及外引物PmF1/R1与内引物PmF2/R2最佳终浓度比例为0.5 pmol/L∶0.5μmol/L时,单管巢氏PCR检测体系较佳。所建立的甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR检测体系仅从含有甘蔗褐锈病菌DNA模板中检测出预期大小的特异性条带,而从含甘蔗黄锈病菌、咖啡驼孢锈菌、鸡蛋花鞘锈菌、葡萄层锈病菌、甘蔗黑穗病菌、橡胶炭疽病菌、咖啡褐斑病菌、稻瘟病菌、剑麻茎腐病菌的DNA中并未扩增出任何条带。通过模板梯度稀释法证实,所建立的单管巢氏PCR检测体系的最低检测限为10 fg/μL,是普通PCR灵敏度的1000倍。田间19份疑似病样单管巢式PCR检测结果,有18份样品DNA中含有甘蔗褐锈病菌。本检测方法可以用于甘蔗褐锈病病原菌的快速诊断及其病害监测,为该病害预测、预报提供技术支持。 展开更多

关键词 甘蔗 褐锈病 黑顶柄锈菌 单管巢式pcr 检测

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羊环形泰勒虫单管套式PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：2

5

作者 李丽 王书全 费东亮 《中国农学通报》 CSCD 2012年第29期62-65,共4页

为了建立羊环形泰勒虫单管套式PCR检测方法并初步应用于临床检测。根据GenBank上发表的环形泰勒虫Tams1基因序列,设计内、外2对特异性引物,进行单管套式PCR检测方法研究,并进行了特异性、敏感性试验及临床应用试验。结果表明:该检测方... 为了建立羊环形泰勒虫单管套式PCR检测方法并初步应用于临床检测。根据GenBank上发表的环形泰勒虫Tams1基因序列,设计内、外2对特异性引物,进行单管套式PCR检测方法研究,并进行了特异性、敏感性试验及临床应用试验。结果表明:该检测方法能够扩增的基因片段大小为476bp,与GenBank收录的相关序列同源性高达93%～98%,而与附红细胞体、新孢子虫、艾美耳球、弓形虫RH株相关病原基因组均无交叉反应,能够检测出DNA的最小量为12fg。并对57份临床样品进行了检测,检测阳性率为40.4%,高于常规PCR和血涂片镜检测,表明该检测方法具有较高的敏感性,可用于羊环形泰勒虫感染的早期诊断,有较好的临床应用价值。 展开更多

关键词 羊环形泰勒虫 Tams1基因 单管套式pcr

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牛附红细胞体单管套式PCR检测方法的建立 被引量：2

6

作者 邢莹 郑秀红 +2 位作者 贾立军 薛书江 张守发 《畜牧与兽医》 北大核心 2011年第4期15-18,共4页

为快速、准确地检测出牛附红细胞体,根据GenBank上发表的牛温氏附红细胞体(Mycoplasma wenyonii)l6S rRNA基因序列(登录号AF016546)设计合成内外2对引物,建立了牛附红细胞体单管套式PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性及应用试验。结果... 为快速、准确地检测出牛附红细胞体,根据GenBank上发表的牛温氏附红细胞体(Mycoplasma wenyonii)l6S rRNA基因序列(登录号AF016546)设计合成内外2对引物,建立了牛附红细胞体单管套式PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性及应用试验。结果:建立的牛附红细胞体单管套式PCR检测方法扩增的片段大小为361 bp,与GenBank中相应序列同源性为98%,该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、新孢子虫、布氏杆菌及牛无乳链球菌等基因片段,检测出标准模板DNA的最小量为1.22 fgμ/L。通过对吉林省延边地区66份血液样本的临床检测显示,单管套式PCR检出率28.8%,高于常规PCR的21.2%和鲜血压片镜检的12.1%,具有准确、特异、敏感等优点,是检测牛附红细胞体的一种新型、可靠的诊断技术。 展开更多

关键词 牛附红细胞体 16S RRNA 单管套式pcr

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正交试验在优化大豆油转基因成分检测反应体系中的应用 被引量：1

7

作者 姚芹 金小花 +1 位作者 宋浩 陈枫 《食品工业》 北大核心 2015年第2期199-201,共3页

采用正交设计的方法对大豆油转基因成分单管巢式PCR检测反应体系的5因素(内引物浓度、外引物浓度、DNA模板用量、Taq酶用量和Mg2+浓度)在4水平上进行优化试验,优化结果采用电泳图进行直观分析,在反应体系得到优化的基础上分别对内外引物... 采用正交设计的方法对大豆油转基因成分单管巢式PCR检测反应体系的5因素(内引物浓度、外引物浓度、DNA模板用量、Taq酶用量和Mg2+浓度)在4水平上进行优化试验,优化结果采用电泳图进行直观分析,在反应体系得到优化的基础上分别对内外引物的Tm值进行梯度PCR,筛选最佳退火温度。结果表明,单管巢式PCR中内外引物的浓度差对反应结果影响最大,内引物与外引物的比例为60倍时反应条带最清晰且无非特异性条带,单管巢式PCR扩增对内外引物的Tm值有特殊要求,外引物的退火温度高于内引物。试验采用正交试验优化的单管巢式PCR反应体系特异性强,灵敏度高且快速方便。 展开更多

关键词 大豆油转基因成分 正交试验 单管巢式pcr 温度筛选 优化

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应用单管半巢式PCR技术筛查转基因食品 被引量：8

8

作者 闫伟 徐桢惠 +2 位作者 龙丽坤 李葱葱 李飞武 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第2期194-197,共4页

建立转基因作物中常见的两种外源调控元件的单管半巢式聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法,为转基因食品的筛选检测提供一种快速、精确的方法。针对6种转基因作物中Ca MV35S启动子和NOS终止子的一致性核苷酸序列,... 建立转基因作物中常见的两种外源调控元件的单管半巢式聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法,为转基因食品的筛选检测提供一种快速、精确的方法。针对6种转基因作物中Ca MV35S启动子和NOS终止子的一致性核苷酸序列,分别设计巢式PCR的内、外引物,在测试不同引物组合的扩增效率基础上,建立Ca MV35S启动子和NOS终止子的单管半巢式PCR方法。结果表明,上述方法对两种转基因成分具有良好的特异性,检测灵敏度分别为0.01%和0.05%,显著优于常规PCR方法。该方法具有便捷、准确、灵敏等特点,适合筛查食品中的转基因成分。 展开更多

关键词 转基因食品 单管半巢式pcr 筛选检测

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一种弓形虫单管套式PCR检测方法的建立及其在奶山羊应用 被引量：2

9

作者 阚松鹤 刘侠 林青 《动物医学进展》 北大核心 2015年第5期33-35,共3页

根据GenBank上发表的弓形虫RH虫株529bp重复序列,设计内、外2对特异性引物,建立一种弓形虫单管套式PCR检测方法,并进行特异性试验、敏感性试验及奶山羊临床样品的检测试验。结果表明,该方法能够扩增出基因片段大小为216bp,与GenBank收... 根据GenBank上发表的弓形虫RH虫株529bp重复序列,设计内、外2对特异性引物,建立一种弓形虫单管套式PCR检测方法,并进行特异性试验、敏感性试验及奶山羊临床样品的检测试验。结果表明,该方法能够扩增出基因片段大小为216bp,与GenBank收录的相关序列同源,而与山羊泰勒虫、微小隐孢子虫、蓝氏贾第虫基因组无交叉反应,该方法能够检测出DNA的最小量为1fg。使用该方法对137份奶山羊血液样品进行了检测,发现有38份为阳性。本研究所建立的方法具有特异性强、敏感性高的特点,可用于奶山羊弓形虫病的诊断,有较高的临床应用价值。 展开更多

关键词 529bp重复序列 弓形虫 单管套式pcr 弓形虫病 奶山羊

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羊附红细胞体单管套式PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：1

10

作者 李丽 王书全 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第5期87-90,共4页

为了建立绒山羊附红细胞体单管套式PCR检测方法,根据GenBank上发表的羊附红细胞体16S rRNA基因序列,设计内、外2对特异性引物,建立单管套式PCR方法,同时进行了特异性、敏感性试验及临床检测。结果表明,本检测方法能够扩增基因片段大小为... 为了建立绒山羊附红细胞体单管套式PCR检测方法,根据GenBank上发表的羊附红细胞体16S rRNA基因序列,设计内、外2对特异性引物,建立单管套式PCR方法,同时进行了特异性、敏感性试验及临床检测。结果表明,本检测方法能够扩增基因片段大小为681bp,与GenBank收录的相关序列同源性为97.6%～99.2%,而与牛温氏附红细胞体、猪附红细胞体、绵羊肺炎支原体、猪肺炎支原体、大肠埃希菌相关病原基因组均无交叉反应,能够检测出DNA的最小量为14.8fg。对74份临床样品进行了检测,阳性率为43.2%,高于常规PCR和血涂片镜检测结果,表明本检测方法具有较高的敏感性,可用于羊附红细胞体感染的早期诊断,有较高的临床应用价值。 展开更多

关键词 羊附红细胞体 单管套式pcr 诊断技术

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猪圆环病毒2型单管巢式PCR检测方法建立 被引量：3

11

作者 夏嘉鑫 岳丰雄 林艳 《养猪》 2022年第1期95-100,共6页

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原体。为建立一种灵敏度更高且特异性更强的分子检测技术,研究建立一种猪圆环病毒2型单管巢式PCR检测技术。首先利用梯度PCR方法验证内外引物的最佳退... 猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原体。为建立一种灵敏度更高且特异性更强的分子检测技术,研究建立一种猪圆环病毒2型单管巢式PCR检测技术。首先利用梯度PCR方法验证内外引物的最佳退火温度;再利用正交试验设计的方法对单管巢式PCR反应体系的内外引物浓度、Ex Taq酶用量等相关因素进行优化。结果表明,当外引物PCV2-P1/P3退火温度为64.4℃,内引物PCV2-1/2退火温度为54.4℃,通过正交试验最终筛选出的最佳反应体系(25μL)为:2×Taq PCR Mastermix 10μL,100μmol/L的内引物PCV2-1/2各1μL,10μmol/L的外引物PCV2-P1/P3各0.2μL,模板DNA 2.5μL,ddH_(2)O 10.1μL。上述反应体系仅对猪圆环病毒2型扩增出特异性目的条带,具有高度特异性,最低检测下限针对猪圆环病毒2型DBN-SX07株目的基因的最低DNA模板量为0.6×10^(-6) ng、ZJ/c株目的基因的最低DNA模板量为0.6×10^(-3) ng。研究建立的猪圆环病毒2型单管巢式PCR检测方法可以有效针对猪圆环病毒2型特异性检测。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 单管巢式pcr DBN-SX07株 ZJ/c株

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