全人源单链抗体库噬菌体展示技术的建立 被引量：4

1

作者 张雨超 丁龙飞 +2 位作者 陈健 张晓燕 徐建青 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第1期80-84,90,共6页

目的建立全人源单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库的噬菌体展示技术。方法采集100名健康老年志愿者的外周血,5 mL/人,混合所有全血并分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),抽提RNA,反转录合... 目的建立全人源单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库的噬菌体展示技术。方法采集100名健康老年志愿者的外周血,5 mL/人,混合所有全血并分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),抽提RNA,反转录合成cDNA,以其为模板,IgG类抗体基因为引物,PCR扩增获得重链可变区片段(V_H)和轻链可变区片段(V_L),然后以V_H和V_L为模板,经重叠PCR获得scFv,经sfiⅠ酶切,插入pComb3xss载体,电转后获得一定容量的抗体库;加入辅助噬菌体VCSM13过夜培养,上清液经PEG-NaCl沉淀,无菌PBS重悬噬菌体沉淀,即完成噬菌体抗体库的构建;采用Phage ELISA法进行噬菌体单克隆抗体的特异性鉴定。结果成功构建了库容为2. 6×10~9的噬菌体抗体库;随机挑选的100个噬菌体单克隆中共筛选到2个疑似H1N1株HA抗原的噬菌体抗体。结论成功构建了噬菌体抗体库的技术平台,可用于各类功能抗体的筛选。 展开更多

关键词 抗体库 单链抗体 噬菌体展示

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噬菌体展示技术构建重组人TNF-α单链抗体库 被引量：2

2

作者 柴蔚然 杨涛 +1 位作者 胡晓年 牛勃 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期155-158,共4页

目的应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)的单链抗体库。方法利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经免疫BALB/c小鼠淋巴细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库。由L in... 目的应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)的单链抗体库。方法利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经免疫BALB/c小鼠淋巴细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库。由L inker-prim erm ix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体。再用RS prim erm ix以单链抗体为模板进行第二次聚合酶链反应,从而获得全套抗rhTNF-α的单链抗体基因。以SfiⅠ/NotⅠ,位点定向插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,转化大肠杆菌TG1后,经M13KO7辅助噬菌体拯救,构建成全套抗rhTNF-α单链抗体表面展示文库。结果成功构建了rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库。经M13KO7超感染后,噬斑计数滴度为2.1×1011pfu。结论rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建,为研究rhTNF-α抗体结合位点,了解其结构与功能的关系以及研究用于临床免疫治疗的新型抗体打下了基础。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子-Α 单链抗体 噬菌体展示技术 重组人TNF-α单链抗体库

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抗猪流行性腹泻病毒噬菌体单链抗体库的构建及筛选 被引量：2

3

作者 孙举 高倩文 +3 位作者 曲雪婷 仝舟 毕玉海 尹燕博 《动物医学进展》 北大核心 2018年第12期5-9,共5页

构建抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)噬菌体单链抗体库,筛选鉴定抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体。用猪流行性腹泻疫苗免疫发病耐过的猪,3次免疫后采血,分离淋巴细胞,提取淋巴细胞的总RNA,分别扩增猪IgG重链和轻链可变区,将其组装成scFv基因,连... 构建抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)噬菌体单链抗体库,筛选鉴定抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体。用猪流行性腹泻疫苗免疫发病耐过的猪,3次免疫后采血,分离淋巴细胞,提取淋巴细胞的总RNA,分别扩增猪IgG重链和轻链可变区,将其组装成scFv基因,连接到噬菌体质粒。进行3轮吸附-洗脱-富集选淘抗猪流行性腹泻病毒的噬菌体单链抗体库。结果构建了库量为9.5×10~9 pfu/mL抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体库,筛选并得到1株亲和活性较好的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体。成功构建了抗猪流行性腹泻病毒的噬菌体单链抗体库,并获得抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体,可为猪流行性腹泻单克隆抗体的制备提供参考。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 单链抗体 噬菌体抗体库

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抗己烯雌酚噬菌体单链抗体库的构建 被引量：2

4

作者 周玄 吴聪明 +2 位作者 沈建忠 张素霞 张艳蓉 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期655-658,共4页

利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经DES-BSA免疫的BALB/c小鼠脾细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH基因和VL基因连接成VH-Linke... 利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经DES-BSA免疫的BALB/c小鼠脾细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH基因和VL基因连接成VH-Linker-VL,在SfiⅠ+NotⅠ酶切位点定向插入pCANTAB-5E噬菌体载体,转化大肠杆菌TG1后,经M13KO7辅助噬菌体拯救,构建成了全套抗己烯雌酚单链抗体表面展示文库。噬菌体中scFv基因的插入率为87.5%,经M13KO7超感染后,其噬斑计数的效价为2.2×1011PFU/mL。结果表明,抗己烯雌酚的单链抗体库的构建,为进一步富集筛选并表达己烯雌酚单链抗体奠定了基础。 展开更多

关键词 己烯雌酚 单链抗体 噬菌体展示技术

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基于噬菌体展示技术抗黄曲霉毒素B1单链抗体的筛选及其蛋白结构分析 被引量：2

5

作者 庞倩 陈晶 +1 位作者 王小红 王佳 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期41-48,共8页

黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1,AFB1)是一种毒性强、污染广的真菌毒素,建立高效、准确、快速的AFB1检测方法具有重要意义。利用噬菌粒-辅助噬菌体展示系统构建单链抗体(singlechainvariablefragment,scFv)文库,应用“淘选-洗脱”的策略,是... 黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1,AFB1)是一种毒性强、污染广的真菌毒素,建立高效、准确、快速的AFB1检测方法具有重要意义。利用噬菌粒-辅助噬菌体展示系统构建单链抗体(singlechainvariablefragment,scFv)文库,应用“淘选-洗脱”的策略,是筛选高亲和配体的常用方法之一。同时结合同源建模和分子对接等计算机辅助手段,分析得到抗体与抗原的结合位点与关键氨基酸,为在基因水平改造抗体提供基础。从AFB1-BSA免疫小鼠的脾细胞内扩增重链可变区和轻链可变区,将组合成的scFv片段插入噬菌粒pCANTAB5e中,构建了噬菌体展示单链抗体文库,以不同浓度的AFB1-OVA作为抗原,从文库中筛选到一株亲和力较好的抗AFB1单链抗体scFv,其亲和常数为8×105L/mol;根据同源建模和分子对接发现,与抗原AFB1结合时,scFv中Tyr33、Ser52和Tyr102起关键作用,分别以π-π共轭键、氢键和范德华力与AFB1结合。 展开更多

关键词 黄曲霉毒素B1 单链抗体 噬菌粒-辅助噬菌体展示 同源建模 分子对接

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人源性肺癌噬菌体展示单链抗体库的构建 被引量：1

6

作者 张慧珍 杨继要 +2 位作者 许东 范清堂 吴逸明 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2006年第9期823-826,共4页

目的:构建人源性肺癌噬菌体单链抗体库,为筛选肺癌相关抗原的抗体奠定基础。方法:提取肺癌转移淋巴结总RNA,用RT-PCR技术扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,在体外将VH和VL连接成单链抗体(ScFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCAN... 目的:构建人源性肺癌噬菌体单链抗体库,为筛选肺癌相关抗原的抗体奠定基础。方法:提取肺癌转移淋巴结总RNA,用RT-PCR技术扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,在体外将VH和VL连接成单链抗体(ScFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,电转化至感受态的大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,形成噬菌体单链抗体库,采用限制性内切酶鉴定其多样性。结果:从肺癌转移淋巴结中成功提取RNA,逆转录PCR扩增出人可变区基因,连接形成单链抗体,最终构建了库容为1.2×108的抗人肺癌单链抗体库。BstNⅠ酶切法证明构建的抗体库具有良好的多样性。结论:成功地构建了噬菌体展示的抗人肺癌单链抗体库,为进一步筛选肺癌相关蛋白的可溶性抗体奠定了基础。 展开更多

关键词 肺肿瘤 抗体 肿瘤 人体 单链抗体(scFv) 噬菌体展示

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大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建 被引量：1

7

作者 孙春燕 《中国医药导报》 CAS 2008年第13期11-13,共3页

目的:构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法:从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT-PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链... 目的:构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法:从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT-PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体(scFv)基因(VH-Linker-VL片段),继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中,连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1,构建噬菌体scFv抗体库。结果:所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接,经电转化E.coliTG1和噬菌体的超感染,构建了总库容达到了6×108的单链抗体库。结论:成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。 展开更多

关键词 单链抗体(scFv) 噬菌体抗体库 重叠延伸拼接

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噬菌体展示技术构建人源性抗乙型肝炎表面抗原单链抗体库 被引量：1

8

作者 秦琴 王毅民 +1 位作者 卢先锋 牛勃 《中国中西医结合消化杂志》 CAS 2010年第2期98-101,共4页

[目的]应用噬菌体展示技术构建人源性抗乙型肝炎(乙肝)表面抗原(HBsAg)单链抗体(ScFv)库。[方法]提取经免疫具有乙肝表面抗体的正常人淋巴细胞总RNA,采用反转录、触减PCR扩增人免疫球蛋白G(IgG)重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),... [目的]应用噬菌体展示技术构建人源性抗乙型肝炎(乙肝)表面抗原(HBsAg)单链抗体(ScFv)库。[方法]提取经免疫具有乙肝表面抗体的正常人淋巴细胞总RNA,采用反转录、触减PCR扩增人免疫球蛋白G(IgG)重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),用Linker连接肽经重叠PCR将VH和VL基因连接成VH-Linker-VL形式的ScFv基因。将ScFv与pCANTAB-5E载体通过相同的酶切位点连接后,转化大肠杆菌TG1,经M13K07辅助噬菌体拯救,构建成全套人源性抗HBsAg ScFv库。[结果]成功构建了人源性抗HBsAg噬菌体ScFv库。[结论]人源性HBsAg噬菌体ScFv库的构建,为进一步筛选特异性高,具有治疗作用的乙肝抗体奠定基础。 展开更多

关键词 乙型肝炎表面抗原 单链抗体 噬菌体展示技术

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高亲和力抗藻毒素单链抗体的快速筛选

9

作者 党辉 陈佩 +5 位作者 张秋香 刘小鸣 赵建新 陈永泉 张灏 陈卫 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2017年第10期274-279,共6页

蓝藻水华引发的微囊藻毒素(MC-LR)与肿瘤促进作用有直接关系,检测方法主要是色谱学方法和免疫学方法。以碳化二亚胺法将MC-LR与磁珠直接偶联,采用磁珠液相筛选法从噬菌体单链抗体库中筛选抗MCLR的单链抗体(scFv),结果成功富集、筛选到抗... 蓝藻水华引发的微囊藻毒素(MC-LR)与肿瘤促进作用有直接关系,检测方法主要是色谱学方法和免疫学方法。以碳化二亚胺法将MC-LR与磁珠直接偶联,采用磁珠液相筛选法从噬菌体单链抗体库中筛选抗MCLR的单链抗体(scFv),结果成功富集、筛选到抗MC-LR的阳性克隆,阳性率达到95%。通过基因测序获得3株阳性克隆,其中与MC-LR结合活性最好的阳性克隆的IC_(50)为0.6 ng/m L。结果表明,将半抗原与磁珠直接偶联,可以灵敏、快速地从噬菌体抗体库中分离目标抗体。 展开更多

关键词 磁珠 噬菌体单链抗体库 微囊藻毒素 筛选 单链抗体

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猪传染性胃肠炎病毒猪源单链抗体的筛选与鉴定

10

作者 孙宇 王宁 +8 位作者 高崇 周晗 姜艳平 崔文 乔薪瑗 唐丽杰 徐义刚 王丽 李一经 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期695-704,共10页

为了获得猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的单链抗体,首先利用噬菌体展示技术,构建猪源噬菌体单链抗体库,然后,通过微孔板筛选法对抗体库进行3轮富集淘筛,并用ELISA检测单链抗体与TGEV的亲和力,对亲和性较高的单链抗体进行基因测序与分析。结... 为了获得猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的单链抗体,首先利用噬菌体展示技术,构建猪源噬菌体单链抗体库,然后,通过微孔板筛选法对抗体库进行3轮富集淘筛,并用ELISA检测单链抗体与TGEV的亲和力,对亲和性较高的单链抗体进行基因测序与分析。结果表明,成功构建了猪源噬菌体单链抗体库,其库容为1.89×107 CFU/mL,通过Phage ELISA和Fab ELISA筛选得到4株与TGEV具有高亲和力的单链抗体,并通过桑格测序获得了与TGEV亲和性最佳的2株抗体的基因序列。利用在线生物信息学工具对所获得的抗体基因序列进行分析,结果表明,这2株单链抗体基因序列分别由猪源IgG的重链可变区基因(V_(H))和κ型轻链可变区基因(V_(L))构成,V_(H)和V_(L)均由3个CDR区和4个FR区构成,说明上述基因序列为完整的猪源TGEV抗体可变区。本研究的结果将为TGEV抗体药物的开发提供必要材料,为TGEV感染仔猪的临床治疗提供新的思路。 展开更多

关键词 猪源噬菌体抗体库 传染性胃肠炎病毒 单链抗体 噬菌体展示系统

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噬菌体展示EpCAM单链抗体及免疫原性初步研究

11

作者 刘晓丽 张岸梅 +4 位作者 林盛 王欣欣 廖荣霞 孙建国 陈正堂 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期977-979,共3页

目的利用噬菌体展示技术进行鼠抗人EpCAM单链抗体表达并鉴定其免疫活性,构建特异靶向上皮来源肿瘤细胞及癌干细胞的单链抗体。方法采用全基因合成的方法合成VL+Linker+VH的EpCAM的单链抗体(ScFv)基因,克隆到pMD19-T简易载体中,将ScFv基... 目的利用噬菌体展示技术进行鼠抗人EpCAM单链抗体表达并鉴定其免疫活性,构建特异靶向上皮来源肿瘤细胞及癌干细胞的单链抗体。方法采用全基因合成的方法合成VL+Linker+VH的EpCAM的单链抗体(ScFv)基因,克隆到pMD19-T简易载体中,将ScFv基因酶切并纯化后克隆到噬菌体载体pCANTAB-5E,热休克法转化至感受态的大肠杆菌TG1,随机挑取5个克隆,经辅助噬菌体超感染,形成鼠抗人EpCAM噬菌体单链抗体,用ELISA(以P/N>2判定为阳性)和免疫细胞化学法测定其抗原结合活性。结果成功获得pCANTAB-5E/EpCAM ScFv重组克隆,经ELISA和免疫细胞化学测定,噬菌体展示阳性率为20%,展示的单链抗体能与EpCAM抗原和A549细胞特异性结合。结论噬菌体展示技术制备EpCAM单链抗体方法简便、省时、高效。 展开更多

关键词 单链抗体 噬菌体展示 EPCAM 免疫 肿瘤干细胞

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人源化甲状腺球蛋白单链抗体FR区突变对其抗原结合力的影响

12

作者 吴蓉 胡玉娜 +2 位作者 孙健 赵晓艳 康向东 《现代免疫学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期99-104,共6页

筛选具有活性人源化甲状腺球蛋白单链抗体,并探索FR区基因突变对人源化甲状腺球蛋白单链抗体抗原结合力的影响。利用噬菌体展示技术克隆Tg人源化抗体基因,获得FR区基因突变的克隆,鉴定并分析其对单链抗体抗原结合力的影响。通过基因序... 筛选具有活性人源化甲状腺球蛋白单链抗体,并探索FR区基因突变对人源化甲状腺球蛋白单链抗体抗原结合力的影响。利用噬菌体展示技术克隆Tg人源化抗体基因,获得FR区基因突变的克隆,鉴定并分析其对单链抗体抗原结合力的影响。通过基因序列分析,突变类型共有3种:FR-3区Met91→Ile91、FR-4区Gln117→His117及两种突变同时存在。抗原结合力实验显示,突变单链抗体与抗原的结合活性显著降低。软件分析显示:突变造成了抗体的CDR区及FR区空间结构的细微变化,抗体疏水性、亲水性及电势也明显发生改变。获得了具有活性的人源化甲状腺球蛋白单链抗体,FR区的突变对人源化甲状腺球蛋白单链抗体的抗原结合力影响显著。 展开更多

关键词 甲状腺球蛋白 人源化抗体 抗原结合力 噬菌体展示技术 框架区

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抗犬瘟热病毒噬菌体抗体库的构建

13

作者 马云青 任文陟 +4 位作者 高娟 陈健 岳媛 高红博 高巍 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2013年第6期813-816,共4页

目的构建抗犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)T7噬菌体单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库。方法用灭活CDV经皮下注射免疫犬,共3次,每次间隔2周,第3次免疫后2周采集犬外周血,分离淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,RT-PC... 目的构建抗犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)T7噬菌体单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库。方法用灭活CDV经皮下注射免疫犬,共3次,每次间隔2周,第3次免疫后2周采集犬外周血,分离淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,RT-PCR分别扩增犬IgG重链(heavy chain,VH)和轻链(light chain,VL)基因片段,通过SOE-PCR法将VH和VL用一段linker连接组装成scFv基因,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后,连接到表达载体T7 Select 10-3b上,用包装蛋白包装后,以大肠埃希菌BLT5403为宿主菌进行增殖,随机挑取50个噬菌斑,进行PCR鉴定,并测定文库滴度。结果扩增的VH和VL基因大小均与预期相符,测序结果经blast比对,扩增的片段与犬IgG的VH和VL序列匹配率达90%以上;所构建的原始文库滴度为3.2×107pfu/ml,扩增后的文库滴度为5.0×108pfu/ml。对随机挑取的50个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为94%。结论成功构建了抗CDV的T7噬菌体抗体库,为犬科动物犬瘟热的防治提供了参考。 展开更多

关键词 犬瘟热病毒 单链抗体 噬菌体展示文库

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日本血吸虫未成熟卵单链抗体库的构建、筛选及初步应用 被引量：13

14

作者 何卓 汪世平 +4 位作者 肖小芹 曾少华 刘明社 李林 周帅锋 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第8期921-928,共8页

运用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)单链抗体(scFv)表达文库,以天然分子候选疫苗SIEA26～28ku为靶抗原筛选SIEA单链抗体库,获得特异性单链抗体.并将该scFv基因亚克隆至原核高效表达载体PET32a,诱导SIEA26～28k... 运用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)单链抗体(scFv)表达文库,以天然分子候选疫苗SIEA26～28ku为靶抗原筛选SIEA单链抗体库,获得特异性单链抗体.并将该scFv基因亚克隆至原核高效表达载体PET32a,诱导SIEA26～28ku特异性scFv大量表达.随后以此为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,以期获得SIEA26～28ku天然分子候选疫苗相关的编码基因.结果显示,所获得的SIEA26～28ku特异性scFv,表达量高,采用该探针初步筛选出相关基因核糖体蛋白S4.SIEA26～28ku特异性scFv的获得,为进一步筛选、分析鉴定抗日本血吸虫病天然分子候选疫苗SIEA26～28ku的编码基因奠定了基础. 展开更多

关键词 日本血吸虫 未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA) 单链抗体(scFv) 噬菌体展示抗体库 CDNA文库

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抗诺氟沙星噬菌体单链抗体库的构建与筛选 被引量：11

15

作者 郑志明 金社胜 +1 位作者 肖希龙 候晓林 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第S1期36-41,共6页

应用噬菌体展示和重组抗体技术制备抗诺氟沙星(NFLX)单链抗体库,筛选获得抗NFLX高特异性、高亲和力的单链抗体scFv。将NFLX与BSA化学偶联获得的免疫源,免疫Balb/C小鼠,提取脾细胞RNA,反转录获得cDNA。以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可... 应用噬菌体展示和重组抗体技术制备抗诺氟沙星(NFLX)单链抗体库,筛选获得抗NFLX高特异性、高亲和力的单链抗体scFv。将NFLX与BSA化学偶联获得的免疫源,免疫Balb/C小鼠,提取脾细胞RNA,反转录获得cDNA。以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的特异性引物,扩增获得VH基因和VL基因。通过SOE-PCR法将VH基因和VL基因通过柔性多肽Linker((Gly4Ser)3)拼接成VH-Linker-VL片段,酶切(sfiⅠ+NotⅠ)处理后,插入噬粒载体pCANTAB5E,并转化宿主菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建抗NFLX噬菌体单链抗体库。以包被抗原NFLX-OVA包被96孔板,亲和富集法,经三轮淘筛,间接Elisa初步检测重组scFv的特异性抗原结合活性。成功构建噬菌体单链抗体库,获得鼠源抗NFLX特异性的scFv,噬菌体中scFv插入率为90%,获得库容约为1.3×106的抗NFLX噬菌体单链抗体库,筛选得到5株抗NFLX的scFv。为运用噬菌体展示抗体技术制备特异性抗药物单抗及进一步建立药残检测新技术奠定了基础。 展开更多

关键词 诺氟沙星 噬菌体展示技术 单链抗体

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抗松材线虫纤维素酶单链抗体库的构建及筛选 被引量：3

16

作者 田旺 张奇 +1 位作者 杨文博 白钢 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期900-905,共6页

构建鼠源性松材线虫纤维素酶(Bursaphelenchusxylophiluscellulase,BXC)的噬菌体单链抗体库,从中筛选特异性BXC的单链抗体。以BXC为抗原免疫BALBC小鼠,从脾脏提取总RNA,用RTPCR技术扩增小鼠抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因。经重叠PCR... 构建鼠源性松材线虫纤维素酶(Bursaphelenchusxylophiluscellulase,BXC)的噬菌体单链抗体库,从中筛选特异性BXC的单链抗体。以BXC为抗原免疫BALBC小鼠,从脾脏提取总RNA,用RTPCR技术扩增小鼠抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因。经重叠PCR(SOEPCR)在体外将VH和VL连接成单链抗体(scFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,成功构建了库容为5×104的AntiBXC单链抗体库,并从该抗体库中初步筛选到了特异性识别BXC的噬菌体单链抗体scFv。将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌HB2151进行可溶性表达,SDSPAGE及Westernblot分析结果显示,可溶性scFv获得表达,且与BXC具有结合活性,为松材线虫的检验检疫以及病理学研究奠定了基础。 展开更多

关键词 松材线虫 纤维素酶 单链抗体 噬菌体抗体库 筛选

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抗肿瘤侵袭与转移单链抗体scFv-M97基因克隆及分泌性表达 被引量：8

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作者 周春水 江敏 +1 位作者 徐琳娜 甄永苏 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 1998年第2期81-88,共8页

目的研制抗肿瘤侵袭和转移的单链抗体。方法应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤C2H5细胞中提取mRNA,构建单链抗体基因并克隆到噬粒pCANTAB5E中,转化大肠杆菌TG1,经M13KO7援救后,得到滴度为5×10~9pfu/ml单链抗体库。... 目的研制抗肿瘤侵袭和转移的单链抗体。方法应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤C2H5细胞中提取mRNA,构建单链抗体基因并克隆到噬粒pCANTAB5E中,转化大肠杆菌TG1,经M13KO7援救后,得到滴度为5×10~9pfu/ml单链抗体库。对抗体库进行一轮抗原固相化亲和富集与ELISA筛选鉴定,得到30株阳性噬菌体。结果 DNA序列分析表明,抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv-M97基因全长732bp。其中V_H351bp,编码117个氨基酸;V_L336bp,编码112个氨基酸,两者以连接肽(Gl_(y_4)Ser)_3相连。阳性噬菌体转染HB2151细胞,经1 mmol/L IPTG诱导培养20h,培养液上清中有2μg/ml可溶性单链抗体。免疫印迹证实所表达产物保留了原亲本抗体的特异性和亲合力。结论单链抗体scFv-M97可分泌性表达,为以Ⅳ型胶原酶为靶点的抗肿瘤侵袭与转移的治疗及新型导向药物的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 单链Fv抗体 基因克隆 表达 肿瘤侵袭 肿瘤转移

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噬菌体呈现技术筛选抗黑色素瘤单链抗体 被引量：2

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作者 孙静 吕安国 +3 位作者 吴文芳 白向阳 任秀宝 张斌 《天津医科大学学报》 2003年第2期219-222,共4页

目的 :制备黑色素瘤单抗的单链可变区片段 ,用于肿瘤的诊断或靶向治疗。方法 :从杂交瘤细胞提取总RNA,分别扩增出轻重链可变区基因(variableregionofheavychain,VH和variableregionoflightchain,VLDNA) ,连接形成单链抗体 (singlechainf... 目的 :制备黑色素瘤单抗的单链可变区片段 ,用于肿瘤的诊断或靶向治疗。方法 :从杂交瘤细胞提取总RNA,分别扩增出轻重链可变区基因(variableregionofheavychain,VH和variableregionoflightchain,VLDNA) ,连接形成单链抗体 (singlechainfragmentvariableregion,ScFv)DNA,将ScFv与载体pCANTAB5E的连接产物转化大肠杆菌TG1 ,经M13K07超感染后 ,获得噬菌体抗体ScFvcDNA文库 ,用黑色素瘤细胞LiBr对重组的噬菌体抗体进行3轮吸附 -洗脱 -扩增亲和筛选后 ,随机挑选克隆经ELISA筛选鉴定。结果:VH、VL和ScFv分别约为360、330、750bp,从随机筛检的30个克隆中获得10个高亲和性噬菌体呈现型ScFv单克隆。结论:用噬菌体呈现技术制备的黑色素瘤ScFv 。 展开更多

关键词 黑色素瘤 单克隆抗体 单链抗体 噬菌体呈现

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半巢式PCR法构建天然噬菌体单域重链抗体文库 被引量：3

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作者 涂追 许杨 +1 位作者 何庆华 陶勇 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2010年第19期299-303,共5页

目的:构建天然噬菌体单域重链抗体文库,淘选可应用于食品安全检测的单域重链抗体。方法:以未经免疫的健康羊驼(Lama pacos)外周血为起始材料,提取RNA反转录为cDNA,根据重链抗体保守序列设计引物,通过半巢式PCR法扩增获得全套重链抗体可... 目的:构建天然噬菌体单域重链抗体文库,淘选可应用于食品安全检测的单域重链抗体。方法:以未经免疫的健康羊驼(Lama pacos)外周血为起始材料,提取RNA反转录为cDNA,根据重链抗体保守序列设计引物,通过半巢式PCR法扩增获得全套重链抗体可变区编码基因,将其克隆至噬菌粒pHEN1,电转化大肠杆菌TG1得到初级抗体库,辅助噬菌体KM13感染后得到噬菌体展示库。采用固相淘选法分别对3种人工抗原进行淘选。结果:单域重链抗体编码基因得到有效扩增,经10次电转化获得初级文库,命名为SNAL,实际库容量达到1.6×107个独立克隆,菌落PCR鉴定结果表明,克隆效率约为87%,辅助噬菌体救援后得到的展示文库命名为SNA-PDL,滴度达1013CFU/mL。对3种不同人工抗原DON-MBSA、NOR-BSA和AFB1-OVA的淘选均有富集现象。结论:构建了天然噬菌体单域重链抗体文库,文库的多样性较好,可以用于后续淘选。 展开更多

关键词 单域重链抗体 VHH抗体 噬菌体文库 羊驼 半抗原

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氧氟沙星单链抗体库的构建、筛选及蛋白结构模拟 被引量：1

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作者 何扩 张秀媛 +2 位作者 杜欣军 王俊平 杨青 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2014年第3期108-113,共6页

利用噬菌体展示技术构建兽药氧氟沙星单链抗体(scFv)库,从中筛选氧氟沙星特异性噬菌体scFv以及模拟其三维结构。将从氧氟沙星杂交瘤细胞提取的总RNA,用RT-PCR反转录合成第一链cDNA,设计以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的... 利用噬菌体展示技术构建兽药氧氟沙星单链抗体(scFv)库,从中筛选氧氟沙星特异性噬菌体scFv以及模拟其三维结构。将从氧氟沙星杂交瘤细胞提取的总RNA,用RT-PCR反转录合成第一链cDNA,设计以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的兼并引物,通过PCR扩增获得VH和VL可变区基因,采用重叠延伸PCR技术将VH和VL拼接为全长scFv基因片段,将经内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后的scFv基因片段插入到T7噬菌体中,经包装蛋白体外包装后转化宿主菌BLT5403,成功构建库容量为3×105pfu/mL氧氟沙星单链抗体库,经过4轮吸附-洗脱-扩增的富集后,采用直接竞争ELISA筛选得到4个特异性噬菌体scFv,经测序最后运用Expasy软件模拟特异性scFv的三维结构和物理化学性质。为进一步大量表达氧氟沙星单链抗体奠定了坚实的基础。 展开更多

关键词 氧氟沙星 单链抗体 噬菌体展示 ELISA

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