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人源抗狂犬病毒单链抗体库的构建及体外亲和筛选 被引量:11
1
作者 赵小玲 荫俊 +2 位作者 王慧 姜明 侯小军 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期243-247,共5页
目的 :构建人源噬菌体展示单链抗体 (scFv)库 ,筛选抗狂犬病毒特异性、高亲和力的scFv。方法 :应用重组噬菌体抗体技术 ,从经狂犬病毒WISTARPM株疫苗免疫者的外周血淋巴细胞中 ,分离并构建scFv基因。将其克隆入噬粒载体pCANTAB 5E中 ,... 目的 :构建人源噬菌体展示单链抗体 (scFv)库 ,筛选抗狂犬病毒特异性、高亲和力的scFv。方法 :应用重组噬菌体抗体技术 ,从经狂犬病毒WISTARPM株疫苗免疫者的外周血淋巴细胞中 ,分离并构建scFv基因。将其克隆入噬粒载体pCANTAB 5E中 ,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K0 7援救构建噬菌体单链抗体库。采用狂犬病毒Vero疫苗亲和富集法 ,淘选阳性重组噬菌体 ,经鉴定后对其进行序列分析。用竞争ELISA ,初步检测重组scFv的特异性抗原结合活性。结果 :成功地构建了库容量约为 7× 10 8抗狂犬病毒噬菌体scFv库 ,筛选到 1株新的抗狂犬病毒的scFv S12。结论 :噬菌体展示scFv库的成功构建及人源抗狂犬病毒特异性scFv的获得 ,为进一步研制抗狂犬病毒的高特异性。 展开更多
关键词 狂犬病毒 噬菌体展示技术 单链抗体
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抗癌抗生素力达霉素与抗IV型胶原酶单链抗体的基因工程组装融合蛋白 被引量:6
2
作者 李顺强 江敏 甄永苏 《药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第7期488-491,共4页
目的 以IV型胶原酶为靶点 ,研制兼具有抗肿瘤侵袭转移和强烈杀伤肿瘤细胞的新型单抗导向药物。方法 力达霉素 (LDM)分子由力达蛋白 (LDP)和力达发色团 (LDC)两部分组成。从基因工程转化菌中提取融合蛋白 (LDP Fv)并与LDC组装重建 ,制... 目的 以IV型胶原酶为靶点 ,研制兼具有抗肿瘤侵袭转移和强烈杀伤肿瘤细胞的新型单抗导向药物。方法 力达霉素 (LDM)分子由力达蛋白 (LDP)和力达发色团 (LDC)两部分组成。从基因工程转化菌中提取融合蛋白 (LDP Fv)并与LDC组装重建 ,制备高效抗癌抗生素力达霉素与单链抗体的组装融合蛋白 (LDM Fv)。通过ELISA、酶谱分析、Boyden小室体外侵袭实验及克隆形成测定 ,观察其生物学活性。结果 LDM Fv能特异性与肿瘤细胞的IV型胶原酶结合并抑制其活性 ,LDP Fv有阻断肿瘤细胞侵袭的能力 ,但无细胞毒性 ,加入LDC制成的组装融合蛋白LDM Fv对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用 ,并明显强于丝裂霉素和阿霉素。结论 LDM Fv可能成为一种新型高效。 展开更多
关键词 Ⅳ型胶原酶 抗肿瘤抗生素 力达霉素 LDM-fv
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全人源性肝癌单链抗体的表达、纯化及功能鉴定 被引量:4
3
作者 赵清涛 马龙洋 +2 位作者 薛国柱 赵爱志 窦科峰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期649-651,656,共4页
目的:在大肠杆菌中表达人源性肝癌单链抗体(scFv),并分析他的结合活性。方法:应用噬菌体表面呈现技术获得人源性肝癌scFv,利用重叠延伸PCR将VL和VH基因以(Gly4ser)3linker连接成单链,插入表达载体pET28a(+),诱导目的蛋白表达,对包涵体... 目的:在大肠杆菌中表达人源性肝癌单链抗体(scFv),并分析他的结合活性。方法:应用噬菌体表面呈现技术获得人源性肝癌scFv,利用重叠延伸PCR将VL和VH基因以(Gly4ser)3linker连接成单链,插入表达载体pET28a(+),诱导目的蛋白表达,对包涵体进行溶解、复性、纯化,得到可溶性目的蛋白,应用非竞争细胞ELISA检测与肝癌细胞结合的特异性及结合能力。结果:在A600为0.8时开始诱导,持续6h,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的26%,包涵体经过复性纯化后,得到纯度达到95%的重组scFv,其亲和常数为:3.6×107mol/L。结论:实现了人源性肝癌scFv的蛋白表达,抗体蛋白与肝癌细胞具有较强的特异性结合能力,为今后进行免疫学检测和开发肿瘤靶向治疗提供了研究手段。 展开更多
关键词 肝癌 单链抗体 表达 生物活性
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单链抗体与力达霉素基因工程强化融合蛋白Fv-LDP-AE的抗肿瘤作用 被引量:6
4
作者 高瑞娟 李亮 +3 位作者 赵春燕 王玉凤 李电东 甄永苏 《中国药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第11期808-813,共6页
目的研究抗Ⅳ型胶原酶单链抗体(Fv)和力达霉素辅基蛋白(LDP)在大肠杆菌表达的融合蛋白(Fv-LDP)与力达霉素(LDM)的活性发色团AE形成的基因工程强化融合蛋白Fv-LDP-AE的生物学活性及体外抗肿瘤作用。方法采用酶联免疫吸附剂测定、免疫荧... 目的研究抗Ⅳ型胶原酶单链抗体(Fv)和力达霉素辅基蛋白(LDP)在大肠杆菌表达的融合蛋白(Fv-LDP)与力达霉素(LDM)的活性发色团AE形成的基因工程强化融合蛋白Fv-LDP-AE的生物学活性及体外抗肿瘤作用。方法采用酶联免疫吸附剂测定、免疫荧光细胞化学染色和明胶酶谱分析Fv-LDP-AE生物学活性;通过MTT法、Hoechst 33342和碘化丙啶共染、DNA ladder和侵袭实验探讨其抗肿瘤作用。结果 Fv-LDP-AE对人肝癌BEL-7402和人结肠癌HT-29细胞的免疫反应呈阳性,可与BEL-7402细胞特异结合,并呈剂量依赖性抑制人高转移性巨细胞肺癌PG细胞内Ⅳ型胶原酶分泌。Fv-LDP-AE对BEL-7402和PG细胞的增殖抑制作用比力达霉素强,可诱导BEL-7402细胞裂亡、凋亡,抑制BEL-7402细胞侵袭。结论 Fv-LDP-AE是一种以Ⅳ型胶原酶为靶点的、具有高效抗肿瘤活性的抗体药物。 展开更多
关键词 Ⅳ型胶原酶 单链抗体 力达霉素 强化融合蛋白 生物学活性 抗肿瘤作用
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抗甜菜坏死黄脉病毒单链抗体表达载体的构建及其表达 被引量:1
5
作者 曾君祉 周志勇 +5 位作者 吴有强 刘志萍 王文星 黄华梁 蔡祝南 于嘉林 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 2000年第11期1006-1011,共6页
用PCR方法以分泌抗甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)单克隆抗体的杂交瘤细胞的基因组为模板,扩增了编码BNYVV单抗的重链可变区(VH)基因。测序表明,该VH序列属于小鼠Ⅱ(A)亚类,全长为360bp,编码120个氨基酸... 用PCR方法以分泌抗甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)单克隆抗体的杂交瘤细胞的基因组为模板,扩增了编码BNYVV单抗的重链可变区(VH)基因。测序表明,该VH序列属于小鼠Ⅱ(A)亚类,全长为360bp,编码120个氨基酸。将其和先前克隆的轻链基因分别插入到一个含有连接VH和VL基因的连接序列的质粒之中,构建成单链抗体(scFv)基因的表达载体pTCscFv。将质粒在大肠杆菌中表达,ELISA法检测出表达产物有与BNYVV抗原结合的活性。 展开更多
关键词 BNYVV 单链抗体 大肠杆菌表达系统 抗病育种
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单链抗体与力达霉素辅基蛋白在大肠埃希菌表达的发酵工艺 被引量:3
6
作者 高瑞娟 赵春燕 +1 位作者 王玉凤 李电东 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期210-214,237,共6页
目的确定工程菌E.coli BL21(DE3)Star^(TM)/pEFL表达抗Ⅳ型胶原酶单链抗体与力达霉素辅基蛋白构成的融合蛋白Fv-LDP的摇瓶发酵工艺。方法比色法测定菌体浓度,干燥失重法测定细菌干重,SDS-PAGE-Spot Denso法测定融合蛋白Fv-LDP表达量,单... 目的确定工程菌E.coli BL21(DE3)Star^(TM)/pEFL表达抗Ⅳ型胶原酶单链抗体与力达霉素辅基蛋白构成的融合蛋白Fv-LDP的摇瓶发酵工艺。方法比色法测定菌体浓度,干燥失重法测定细菌干重,SDS-PAGE-Spot Denso法测定融合蛋白Fv-LDP表达量,单因素或正交设计优化发酵工艺。结果确定了融合蛋白Fv-LDP表达的最佳培养基配方和培养条件,融合蛋白Fv-LDP表达量为830μg/ml左右,比LB培养基的产量提高5.6倍。结论优化工程菌发酵工艺大大提高了融合蛋白Fv-LDP表达水平,不仅为下一步中试研究和规模化生产奠定了基础,而且为其它生物来源的抗体和抗生素组分在基因工程大肠埃希菌的生产提供了发酵方面的实验证据。 展开更多
关键词 单链fv抗体 力达霉素辅基蛋白 工程菌BL21(DE3)Star^(TM/pEFL 发酵工艺 优化
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人破伤风免疫噬菌体单链抗体库的构建及体外亲和筛选 被引量:3
7
作者 王晗 于蕊 +7 位作者 张晓鹏 任军 谢娜 樊红艳 张金龙 房婷 于长明 陈薇 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期85-90,96,共7页
目的构建人破伤风免疫噬菌体单链抗体库,筛选抗破伤风毒素重链C端(TeNT-Hc)的特异性单链抗体(scFv)。方法利用RT-PCR从5名破伤风抗体滴度较高的健康献浆员外周血淋巴细胞中获得全套人破伤风抗体VH和VL基因,经过重叠PCR将VH和VL基因连接... 目的构建人破伤风免疫噬菌体单链抗体库,筛选抗破伤风毒素重链C端(TeNT-Hc)的特异性单链抗体(scFv)。方法利用RT-PCR从5名破伤风抗体滴度较高的健康献浆员外周血淋巴细胞中获得全套人破伤风抗体VH和VL基因,经过重叠PCR将VH和VL基因连接获得scFv片段。将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,电转化大肠TG1感受态菌,获得抗体库。以TeNT-Hc为抗原对抗体库进行3轮筛选,获得特异性人源性抗TeNT-Hc单链抗体。scFv由pET32a(+)表达载体表达,产物包涵体采用HisTrap FF预装柱纯化并透析复性。采用非竞争酶免疫实验法测定scFv亲和常数(affinity constant,KD值)。检测scFv抑制TeNT-Hc与神经节苷脂GT1b结合的体外中和活性,计算抑制率。结果构建库容量为1×108的人破伤风免疫噬菌体单链抗体库,经过筛选获得3株特异性较好的人源性抗TeNT-Hc单链抗体。原核表达结果显示,3株scFv均以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的40%~45%。包涵体经洗涤、纯化和复性后,scFv均保持了与TeNT-Hc的特异结合活性,1 L培养物经纯化后可获得4~6 mg scFv蛋白。亲和力测定结果,27G、22D和S-4-7H-scFv的KD值分别为(1.25×10-7),(2.31×10-7)和(1.97×10-7)mol/L。3株抗体对TeNT-Hc与神经节苷脂GT1b结合的抑制率分别为64.5%,58.6%和51.5%。结论人破伤风免疫噬菌体单链抗体库的构建及具有体外中和活性的特异性抗TeNT-Hc单链抗体的获得,为人破伤风基因工程中和抗体的制备奠定了良好基础。 展开更多
关键词 破伤风 破伤风毒素 单链抗体 逆转录聚合酶链反应 细菌噬菌体
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抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26~28kDa单链抗体与EGFP的融合表达及靶向性研究 被引量:3
8
作者 何卓 汪世平 +6 位作者 周帅锋 秦永华 高冬梅 汪希雅 李林 余路新 徐绍锐 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期704-707,共4页
目的体外观察抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26-28kDa单链抗体与日本血吸虫各阶段的靶向部位,探讨单链抗体在抗血吸虫病疫苗研究中的应用价值。方法扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因.克隆至PET32a/SIEA26~28kDa-scFv质粒,构建PET... 目的体外观察抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26-28kDa单链抗体与日本血吸虫各阶段的靶向部位,探讨单链抗体在抗血吸虫病疫苗研究中的应用价值。方法扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因.克隆至PET32a/SIEA26~28kDa-scFv质粒,构建PET32a/EGFP-scFv质粒。转化至感受态E.coli BL21(DE3)中。并诱导表达单链抗体融合蛋白。分析单链抗体融合蛋白与SIEA26~28kDa的结合特异性。单链抗体融合蛋白与日本血吸虫成虫、虫卵切片孵育,荧光显微镜下观测GFP信号。确定特异性单链抗体的靶向性。结果重组质粒PET32a/EGFP-scFv构建成功.Trx-EGFP-scFv融合蛋白高效表达.与SIEA26-28kDa特异性结合。GFP信号主要集中在未成熟卵卵胚.雌虫卵巢、卵黄腺及与生殖系统邻近的肠腔组织。结论SIEA26-28kDa单链抗体与血吸虫未成熟卵胚胎及雌虫生殖系统具有较强的靶向性,具有潜在抗卵胚发育、抗雌虫生殖作用,为SIEA26-28kDa单链抗体在抗日本血吸虫病疫苗免疫靶向方面的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 日本血吸虫 未成熟卵可溶性抗原(SIEA) 单链抗体(scfv) 增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 靶向性
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人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库的构建 被引量:3
9
作者 杨华 周新刚 +5 位作者 拾莉 冯永红 秦莲花 郑瑞娟 王洁 胡忠义 《中华结核和呼吸杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期682-685,共4页
目的构建人源抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库,为结核特异性单链抗体的筛选奠定基础。方法从抗结核分枝杆菌抗体阳性患者淋巴细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA,PCR扩增获得抗体的重、轻链可变区基因,然后拼接装配成单链抗体基因... 目的构建人源抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库,为结核特异性单链抗体的筛选奠定基础。方法从抗结核分枝杆菌抗体阳性患者淋巴细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA,PCR扩增获得抗体的重、轻链可变区基因,然后拼接装配成单链抗体基因,重组于噬菌粒载体pCANTAB5S,转化大肠埃希菌E.coli TG1,以辅助噬菌体拯救后,构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库。结果成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库,库容量达10^7。结论以结核患者淋巴细胞免疫球蛋白可变区基因片段和噬菌粒展示载体pCANTAB5S为基础,成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库,并达到建库标准,可进一步从中筛选获得结核特异性单链抗体。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 噬菌体展示 单链抗体 文库
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抗人CD28单链抗体基因的构建及在BmN细胞和家蚕中的表达 被引量:2
10
作者 朱艳 郑峰丰 +2 位作者 陈永井 邱玉华 朱江 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期577-583,共7页
采用TP-PCR法,将抗人CD28单链抗体的重、轻链可变区基因和人工设计的昆虫杆状病毒多角体蛋白基因(ph)偏好的连接肽序列,拼接成抗人CD28单链抗体(抗CD28-ScFv)基因,并将其插入昆虫杆状病毒转移载体pBacPAK8的ph启动子,构建成重组转移载体... 采用TP-PCR法,将抗人CD28单链抗体的重、轻链可变区基因和人工设计的昆虫杆状病毒多角体蛋白基因(ph)偏好的连接肽序列,拼接成抗人CD28单链抗体(抗CD28-ScFv)基因,并将其插入昆虫杆状病毒转移载体pBacPAK8的ph启动子,构建成重组转移载体pBacPAK8/CD28-ScFv。为便于表达产物的纯化,在CD28-ScFv的C端增加了6×Histag序列。通过脂质体介导法将重组转移载体pBacPAK8/CD28-ScFv和线性化病毒Bm-BacPAK6共转染BmN细胞,经空斑分析和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒Bm-BacPAK6 CD28-ScFv。将重组病毒Bm-BacPAK6 CD28-ScFv感染BmN细胞和5龄家蚕,SDS-PAGE和Western Blotting分析表明,在分子量约为28kD处有一表达带。BmN细胞的表达始于24h,表达峰在72h,96h时表达量开始下降,而5龄家蚕的表达始于48h,表达峰在120h。结果证明,抗人CD28单链抗体基因在BmN细胞和家蚕中得到了特异性表达。上述研究成果为抗人CD28基因工程抗体的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 CD28 单链抗体 BmN细胞 家蚕 真核表达
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抗SARS人源单链抗体H12的表达及复性 被引量:2
11
作者 段金柱 齐财 +3 位作者 韩伟 王战会 靳刚 阎锡蕴 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期692-697,共6页
从SARS免疫抗体库获得的一株抗SARSCoV人源单链抗体H12,亟待鉴定。为了快速制备大量具有生物活性的单链抗体H12,构建了pET28aH12原核高表达载体,表达量占菌体总蛋白质30%以上。采用稀释复性和分子筛柱复性两种方法对包涵体蛋白进行复性... 从SARS免疫抗体库获得的一株抗SARSCoV人源单链抗体H12,亟待鉴定。为了快速制备大量具有生物活性的单链抗体H12,构建了pET28aH12原核高表达载体,表达量占菌体总蛋白质30%以上。采用稀释复性和分子筛柱复性两种方法对包涵体蛋白进行复性与纯化,结果显示两种方法都能使得单链抗体复性。与稀释复性法相比,柱复性效果更好,其抗原结合活性是稀释复性法的1.51倍。柱复性后的单链抗体亲和力测定的解离常数Kd为73.5nmolmL。为进一步研究单链抗体H12的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 单链抗体 原核表达 包涵体 复性 SARS-COV
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Screening for a human single chain Fv antibody against epitope on amyloid-beta 1-40 from a human phage display library 被引量:1
12
作者 ZHAO Zhen-fu GAO Guo-quan LIU Shu ZOU Jun-tao XIE Yao YUAN Qun-fang WANG Hua-qiao YAO Zhi-bin 《Chinese Medical Journal》 SCIE CAS CSCD 2007年第21期1931-1934,共4页
Amyloid-beta peptides (Aβ) are believed to be .responsible for the mental decline in patients with Alzheimer's reported that pathology in vaccination disease (AD). In 1999, Schenk et all immunization with Aβ at... Amyloid-beta peptides (Aβ) are believed to be .responsible for the mental decline in patients with Alzheimer's reported that pathology in vaccination disease (AD). In 1999, Schenk et all immunization with Aβ attenuated AD-like the PDAPP mouse, and developed a new approach to AD. Such vaccines were successfully tested in mouse models of AD for the reduction of Aβ plaque burden and the improvement of cognitive performance. However, 6% of AD patients developed symptoms of brain inflammation after vaccination that resembled enceohalitis or meningitis. 展开更多
关键词 Alzheimer's disease phage-display library single-chain fv antibody amyloid-beta peptide
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抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白表达条件的初步研究 被引量:1
13
作者 刘细霞 王弘 +4 位作者 杨金易 张宏斌 雷红涛 沈玉栋 孙远明 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期161-165,共5页
初步研究抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CBLscFv-AP)的表达条件,提高CBLscFv-AP融合蛋白的表达量。采用液体发酵法培养抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CBLscFv-AP)基因工程菌,研究不同宿主菌、初始pH、诱导时期、诱导... 初步研究抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CBLscFv-AP)的表达条件,提高CBLscFv-AP融合蛋白的表达量。采用液体发酵法培养抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CBLscFv-AP)基因工程菌,研究不同宿主菌、初始pH、诱导时期、诱导时间和培养基对CBLscFv-AP融合蛋白表达量的影响以及重组质粒的稳定性。选用E·coliBL21(DE3)pLysS为宿主菌,在初始pH为7·4的LB培养基中培养至A600nm为0·8~0·9时,诱导表达8h,为CBLscFv-AP融合蛋白最佳表达条件。而且重组质粒pBV220-scFv-phoA具有较好的结构稳定性。在该表达条件下,提高了CBLscFv-AP融合蛋白的表达量,为进行大规模发酵生产CBLscFv-AP融合蛋白奠定基础。 展开更多
关键词 克伦特罗 单链抗体 碱性磷酸酶 融合蛋白 表达条件
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两种重组菌中融合蛋白Fv-LDP含量测定方法的比较研究 被引量:2
14
作者 高瑞娟 赵春燕 +2 位作者 王玉凤 炼润梅 李电东 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期280-283,331,共5页
目的:测定抗Ⅳ型胶原酶单链抗体Fv和力达霉素辅基蛋白LDP在大肠杆菌中表达产生的融合蛋白Fv-LDP含量。方法:3瓶培养融合蛋白Fv-LDP表达菌,固定化金属亲和层析纯化融合蛋白Fv-LDP,分步透析使之复性,HPLC测其纯度。比色法测定菌体浓度,S... 目的:测定抗Ⅳ型胶原酶单链抗体Fv和力达霉素辅基蛋白LDP在大肠杆菌中表达产生的融合蛋白Fv-LDP含量。方法:3瓶培养融合蛋白Fv-LDP表达菌,固定化金属亲和层析纯化融合蛋白Fv-LDP,分步透析使之复性,HPLC测其纯度。比色法测定菌体浓度,SDS-PAGE分离蛋白带,积分密度扫描法测定融合蛋白Fv-LDP表达百分比和含量。结果:在88.7-1 064 mg·L^-1范围内,融合蛋白Fv-LDP浓度和积分密度值呈线性关系(r=0.998 8),精密度RSD为2.09%(n=8),平均回收率为95.18%。结论:SDS-PAGE-SpotDenso法操作简单,重复性好,灵敏度高,适用于发酵过程中对融合蛋白Fv-LDP表达产量的控制分析。 展开更多
关键词 单链抗体 力达霉素辅基蛋白 积分密度扫描法 含量 发酵
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人源性抗HBc单链噬菌体抗体库的构建 被引量:1
15
作者 汤正好 姚集鲁 +2 位作者 马会慧 李刚 黄呈辉 《中山大学研究生学刊(自然科学与医学版)》 2002年第3期1-8,共8页
利用 RT-PCR 和噬菌体表面展示技术,直接从乙肝病毒核心抗体(抗 HBc)阳性患者淋巴细胞中提取总 RNA,反转录成 cDNA;合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基因,并将重、轻链可变区基因进行拼接装配成单链抗体(ScFv)基因,重组于噬菌粒... 利用 RT-PCR 和噬菌体表面展示技术,直接从乙肝病毒核心抗体(抗 HBc)阳性患者淋巴细胞中提取总 RNA,反转录成 cDNA;合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基因,并将重、轻链可变区基因进行拼接装配成单链抗体(ScFv)基因,重组于噬菌粒载体 pHEN1,转化抑制型大肠杆菌 E.coliTG1,以辅助噬菌体援救后,构建成人源性单链噬菌体库。库容量达106。 展开更多
关键词 人源性 抗HBC 噬菌体抗体库 单链抗体 聚合酶链反应 噬菌体表面展示技术 乙肝病毒核心抗体
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单链抗体与lidamycin辅基蛋白融合蛋白工程菌的高密度发酵及其免疫活性 被引量:1
16
作者 高瑞娟 赵春燕 +3 位作者 王玉凤 张秀敏 赵宝明 李电东 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期536-540,共5页
目的实现抗Ⅳ型胶原酶单链抗体(Fv)与lidamycin辅基蛋白(LDP)结合构成的融合蛋白Fv-LDP产生菌的高密度发酵,并测定融合蛋白Fv-LDP免疫活性。方法先在5L发酵罐中进行工程菌分批发酵和补料分批发酵,再用固定化金属亲和层析从菌体中纯化融... 目的实现抗Ⅳ型胶原酶单链抗体(Fv)与lidamycin辅基蛋白(LDP)结合构成的融合蛋白Fv-LDP产生菌的高密度发酵,并测定融合蛋白Fv-LDP免疫活性。方法先在5L发酵罐中进行工程菌分批发酵和补料分批发酵,再用固定化金属亲和层析从菌体中纯化融合蛋白Fv-LDP,分步透析使之复性,酶联免疫吸附试验和免疫荧光细胞化学染色检测其免疫活性。结果确定分阶段恒速补料分批发酵为工程菌最佳高密度发酵模式,融合蛋白Fv-LDP最高表达量为4g/L,A600为55左右,培养时间约14h。融合蛋白Fv-LDP对Ⅳ型胶原酶呈阳性免疫反应,能与PG细胞特异结合。结论确定了工程菌高密度发酵工艺,融合蛋白Fv-LDP免疫活性良好,为融合蛋白Fv-LDP与lidamycin烯二炔发色团(AE)构成的小型高效化抗体药物Fv-LDP-AE的研究奠定良好基础。 展开更多
关键词 单链抗体 lidamycin辅基蛋白 分批发酵 补料分批发酵 免疫活性
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捕获噬菌体酶联免疫吸附法筛选抗去唾液酸糖蛋白受体单链抗体的价值
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作者 王炜煜 易继林 +1 位作者 邓云华 曹利民 《中华检验医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期335-338,共4页
目的评价捕获噬菌体酶免疫吸附试验法(ELISA)在筛选抗去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)单链抗体(scFv)中的价值。方法以含ASGPR基因的质粒(CRDH1/pET3b)为模板,通过聚合酶链反应扩增获得ASGPRH1亚单位糖识别区基因(CRDH1),定向克隆至原核表达... 目的评价捕获噬菌体酶免疫吸附试验法(ELISA)在筛选抗去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)单链抗体(scFv)中的价值。方法以含ASGPR基因的质粒(CRDH1/pET3b)为模板,通过聚合酶链反应扩增获得ASGPRH1亚单位糖识别区基因(CRDH1),定向克隆至原核表达载体pET-32c,并经IPTG诱导表达,其表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化;然后,采用捕获噬菌体ELISA对人源噬菌体抗体库进行筛选和鉴定,同时对筛选的抗CRDH1单链抗体进行DNA测序、表达、纯化和免疫印记鉴定。然后,与间接噬菌体ELISA比较。结果CRDH1/pET-32c在原核系统中经诱导表达出分子量约35000的融合蛋白,且以包涵体形式存在;通过Ni2+亲和柱纯化获得CRDH1融合蛋白后,采用捕获噬菌体ELISA进行四轮筛选,在60个噬菌体克隆中有45株与CRDH1特异性结合,其中仅1株与重组蛋白标签有交叉结合反应。DNA序列分析表明,有9株DNA序列各异,9株可分泌性表达与CRDH1特异性结合的scFv,纯化的scFv也可特异性识别rCRDH1。计算该筛选方法的假阳性率为2%,低于间接噬菌体ELISA筛选的假阳性率(58%)。结论捕获噬菌体ELISA筛选CRDH1特异性scFv可有效降低硫氧还蛋白标签(Trx·Tag)引起的假阳性,提高筛选阳性率,并成功筛选出9株具有rCRDH1特异性的scFv。 展开更多
关键词 单链抗体 酶联免疫吸附测定 去唾液酸糖蛋白受体 融合蛋白
原文传递
特异性抗肝癌单链抗体的表达及意义
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作者 丁世华 杨冬华 +2 位作者 卢筱华 汤绍辉 叶刚 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期1525-1528,共4页
目的优化表达条件,获取有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体。方法以ITPG诱导大肠杆菌HB2151表达可溶性抗肝癌单链抗体;利用HiTrap Anti-ETag亲和层析柱对阳性克隆表达的单链抗体进行纯化;纯化后的单链抗体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,以B... 目的优化表达条件,获取有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体。方法以ITPG诱导大肠杆菌HB2151表达可溶性抗肝癌单链抗体;利用HiTrap Anti-ETag亲和层析柱对阳性克隆表达的单链抗体进行纯化;纯化后的单链抗体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,以Bradford检测法测定其浓度,ELISA法及免疫组化法鉴定其生物学活性;结果在培养基中加入0.4M蔗糖,以IPTG 1mmol/L于30℃诱导12h,抗肝癌scFv可溶性表达量较多,纯化后可溶性抗肝癌scFv含量为325μg/L。纯化的抗肝癌scFv与肝癌组织、肝癌细胞抗原特异性结合,与肝硬化、正常肝组织无阳性结合。结论成功获得具有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体,为肝癌靶向诊断及治疗的开发与应用奠定了基础。 展开更多
关键词 肝细胞癌 单链抗体 优化表达 纯化 鉴定
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抗恶性疟HRP-11单链抗体的筛选和鉴定(英文)
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作者 徐伟文 董文其 +3 位作者 李明 毕惠祥 陈白虹 王萍 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 2000年第3期185-188,共4页
目的 研究开发简便、快速和有效的疟疾诊断技术。方法 利用噬菌体抗体库技术 ,在构建抗恶性疟原虫红内期噬菌体抗体库的基础上 ,经 3轮“吸附 -洗脱 -扩增”的富集反应后 ,筛选抗HRPII阳性克隆株并进行可溶性诱导表达 ,最后用ELISA和W... 目的 研究开发简便、快速和有效的疟疾诊断技术。方法 利用噬菌体抗体库技术 ,在构建抗恶性疟原虫红内期噬菌体抗体库的基础上 ,经 3轮“吸附 -洗脱 -扩增”的富集反应后 ,筛选抗HRPII阳性克隆株并进行可溶性诱导表达 ,最后用ELISA和Westernblot等进行鉴定。结果 筛选出 6株抗HRPII阳性克隆株 ,表达的单链抗体Mr 为 310 0 0左右 ,能与HRPII抗原起特异性结合反应。 展开更多
关键词 噬菌体抗体库 单链抗体 富组胺酸蛋白 恶性疟
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人源性单纯疱疹病毒II型抗gD蛋白噬菌体单链抗体库的构建
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作者 王颖 杨慧兰 樊建勇 《中国麻风皮肤病杂志》 2006年第5期383-385,共3页
目的:利用HSV-2病毒IgG、IgM抗体阳性的生殖器疱疹患者外周血淋巴细胞,构建人源单链抗体库。方法:取患者外周血淋巴细胞提取总RNA,逆转录成cDNA,以其为模板,分别扩增抗体重链及轻链可变区基因,将重链、轻链可变区基因拼接成单链抗体(sc... 目的:利用HSV-2病毒IgG、IgM抗体阳性的生殖器疱疹患者外周血淋巴细胞,构建人源单链抗体库。方法:取患者外周血淋巴细胞提取总RNA,逆转录成cDNA,以其为模板,分别扩增抗体重链及轻链可变区基因,将重链、轻链可变区基因拼接成单链抗体(scFv)基因,酶切后连接到噬菌粒载体pFAB5c中,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL-1Blue,构建噬菌体抗体库并测定其库容量。结果:成功构建人源性单纯疱疹病毒抗gD蛋白噬菌体抗体库,库容达1.86×106。结论:利用RT-PCR和噬菌体表面展示技术成功构建了HSV-2抗gD蛋白人源性单链抗体库,为其进一步的研究打下了基础。 展开更多
关键词 gD蛋白 噬菌体抗体库 单链抗体
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