转pK2.10-拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株的筛选 被引量：11

1

作者 王春生 刘欣 +1 位作者 原璐 安铁洙 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期1262-1265,共4页

为了筛选转pK2.10-拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株,本研究参照GenBank上蜘蛛拖丝蛋白基因序列(AY555585和AH015065)设计并人工合成拟蜘蛛基因四聚体(4S),与pcDNA3.1载体(K2.10启动子)相连构建真核表达载体(pcDNA3.1-K2.10-4S),采... 为了筛选转pK2.10-拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株,本研究参照GenBank上蜘蛛拖丝蛋白基因序列(AY555585和AH015065)设计并人工合成拟蜘蛛基因四聚体(4S),与pcDNA3.1载体(K2.10启动子)相连构建真核表达载体(pcDNA3.1-K2.10-4S),采用脂质体介导法转染绵羊成纤维细胞,通过药物筛选、阳性细胞鉴定及体外培养等方法,获得了转蜘蛛拖丝蛋白基因的绵羊成纤维细胞株。结果,用pcDNA3.1-K2.10-4S表达载体转染冷冻复苏的绵羊成纤维细胞后,利用G418筛选法获得neo基因的抗性细胞,即阳性细胞;采用PCR方法对阳性细胞鉴定显示,所构建的载体整合到了细胞基因组中;对阳性细胞的染色体核型分析显示,阳性细胞核型稳定,与正常细胞的核型无差异;阳性细胞经冷冻复苏后仍能保持原有的特性。该细胞株的建立为进一步开展转拟蜘蛛拖丝蛋白基因的克隆羊研究奠定了基础。 展开更多

关键词 拟蜘蛛拖丝蛋白基因 载体构建 转染 绵羊成纤维细胞

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不同转染试剂转染绵羊成纤维细胞效果比较 被引量：7

2

作者 黄洋 靳辉 +1 位作者 吕丽华 张春香 《山西农业科学》 2011年第11期1202-1204,共3页

为了确定GDF-8基因干扰质粒转染绵羊成纤维细胞的最佳转染条件,采用LipofectamineTM2000与FuGene HD这2种转染试剂介导质粒转染绵羊成纤维细胞。结果表明,LipofectamineTM 2000介导转染时,当DNA用量为0.4μg,LipofectamineTM 2000用量为... 为了确定GDF-8基因干扰质粒转染绵羊成纤维细胞的最佳转染条件,采用LipofectamineTM2000与FuGene HD这2种转染试剂介导质粒转染绵羊成纤维细胞。结果表明,LipofectamineTM 2000介导转染时,当DNA用量为0.4μg,LipofectamineTM 2000用量为1.0μL,转染时间为6 h时,能达到最佳转染效果;FuGeneHD介导转染时,当每100μL转染液内含有质粒DNA 2μg,FuGene HD 10μL,每孔加入转染液5μL时,可获得最佳转染效果。FuGene HD的转染效率显著高于LipofectamineTM2000转染效率。 展开更多

关键词 LipofectamineTM2000 FuGene HD GDF-8 转染 绵羊成纤维细胞

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电穿孔转染制备绵羊诱导多潜能干细胞条件的优化 被引量：3

3

作者 王聪慧 赵帅 +6 位作者 张译元 王立民 李炜杰 赵兴旺 丁新平 张银国 周平 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期9-15,共7页

为优化获得绵羊诱导性多潜能干细胞(iPS cell)的诱导条件,通过4-D电转染仪,将含有人Oct4、Sox2及Klf4、c-Myc及lin28基因的3个质粒共转染绵羊成纤维细胞,从EH-100、EN-150、CZ-167、CA-137电转程序筛选出适合绵羊成纤维细胞的电转染程序... 为优化获得绵羊诱导性多潜能干细胞(iPS cell)的诱导条件,通过4-D电转染仪,将含有人Oct4、Sox2及Klf4、c-Myc及lin28基因的3个质粒共转染绵羊成纤维细胞,从EH-100、EN-150、CZ-167、CA-137电转程序筛选出适合绵羊成纤维细胞的电转染程序;探讨不同细胞密度、质粒质量浓度、质粒质量浓度比及维生素C对诱导性多潜能干细胞克隆形成的影响。结果表明,采用EH-100电转程序,在细胞密度为5×106 mL-1、质粒质量浓度比为1∶1∶1、质粒总质量浓度为0.1mg·L-1、培养液中添加维生素C的质量浓度为0.05mg·L-1时,AP染色阳性(AP+)克隆形成的效率可达到14.0%。说明,优化后的电转染方法和培养方案可有效提高绵羊诱导性多潜能干细胞的制备效率。 展开更多

关键词 电穿孔转染 绵羊成纤维细胞 诱导性多潜能性干细胞

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带有绿色荧光蛋白外源DNA转染绵羊成纤维细胞的研究 被引量：2

4

作者 安星兰 王子竹 +4 位作者 张志崇 曲丽威 王春生 朴善花 安铁洙 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第12期67-70,共4页

为了优化建立转染绵羊成纤维细胞系的外源基因转染体系,本研究利用带有绿色荧光蛋白（GFP）的外源基因,采用阳离子脂质体法,探讨了DNA用量、脂质体用量和转染时间等因素对转染绵羊成纤维细胞的影响。结果表明,在500μL转染培养基中成纤... 为了优化建立转染绵羊成纤维细胞系的外源基因转染体系,本研究利用带有绿色荧光蛋白（GFP）的外源基因,采用阳离子脂质体法,探讨了DNA用量、脂质体用量和转染时间等因素对转染绵羊成纤维细胞的影响。结果表明,在500μL转染培养基中成纤维细胞达到85%汇合时,添加由50μL DMEM中含有0.2μg DNA和50μL DMEM中含有2.0μL Lipo-fectamineTM2000的两种溶液混合构成的转染液并转染12 h,可获得最高的转染效率。当转染12 h后,用基础培养液培养至第24小时,细胞核周区出现强绿色荧光,而当转染后48～64 h观察时,细胞核周区的荧光强度明显弱,而远离核周区的胞质中的荧光强度增加。 展开更多

关键词 质粒DNA 绵羊成纤维细胞 转染 脂质体法

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GDF-8干扰质粒转染绵羊耳成纤维细胞最佳条件研究 被引量：1

5

作者 靳辉 黄洋 +2 位作者 岳文斌 张晓强 张春香 《山西农业科学》 2011年第6期586-588,共3页

为了确定GDF-8基因干扰质粒转染绵羊耳成纤维细胞的最佳转染条件,试验采用脂质体转染法,探索了DNA用量、脂质体用量和转染时间等因素对转染绵羊耳成纤维细胞的影响。结果表明,DNA用量0.4μg、脂质体用量1.0μL、转染时间为6 h时,转染效... 为了确定GDF-8基因干扰质粒转染绵羊耳成纤维细胞的最佳转染条件,试验采用脂质体转染法,探索了DNA用量、脂质体用量和转染时间等因素对转染绵羊耳成纤维细胞的影响。结果表明,DNA用量0.4μg、脂质体用量1.0μL、转染时间为6 h时,转染效果最好。 展开更多

关键词 质粒 脂质体 转染 绵羊耳成纤维细胞

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人泛素启动子UbB介导Fat-1基因在绵羊成纤维细胞内的表达 被引量：1

6

作者 毛志福 王立民 +1 位作者 张银国 周平 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期528-534,共7页

旨在构建不饱和脂肪酸脱氢酶基因Fat-1表达载体,实现人泛素启动子UbB调控外源基因Fat-1在绵羊细胞内表达。PCR扩增得到UbB序列,秀丽隐杆线虫Fat-1基因密码子根据绵羊对同义密码子使用偏好性优化后,由公司合成获得oFat-1基因序列,以及pcD... 旨在构建不饱和脂肪酸脱氢酶基因Fat-1表达载体,实现人泛素启动子UbB调控外源基因Fat-1在绵羊细胞内表达。PCR扩增得到UbB序列,秀丽隐杆线虫Fat-1基因密码子根据绵羊对同义密码子使用偏好性优化后,由公司合成获得oFat-1基因序列,以及pcDNA3.1中的GBHpolyA序列共同插入pCMV-DsRed2-1载体的多克隆位点(MCS),得到重组真核表达载体pUbB-oFat-polyA-CMV-DsRed,载体序列经酶切测序鉴定。线性化的表达载体采用脂质体包裹后转染绵羊成纤维细胞,经G418抗性和红色荧光标记筛选得到阳性细胞,并对阳性细胞进行PCR和反转录PCR鉴定,HPLC检测细胞中不饱和脂肪酸的变化。构建的真核表达载体序列正确,Fat-1基因能够在绵羊成纤维细胞基因组中正常表达,促进细胞ω-6PUFAs向ω-3PUFAs转化,ω-3PUFAs占总量的百分比从11.48%增加到24.41%,ω-6PUFAs的百分比从88.52%下降到75.59%,ω-6PUFAs/ω-3PUFAs比值从7.82±0.18下降到3.10±0.03,差异极显著(P<0.01)。成功构建了UbB启动子介导的Fat-1真核表达载体,筛选得到表达不饱和脂肪酸脱氢酶的绵羊细胞,为进一步制备转基因克隆绵羊奠定了基础。 展开更多

关键词 人泛素启动子UbB Fat-1 表达载体 绵羊成纤维细胞 PUFAS

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绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建及在其原代成纤维细胞中的瞬时表达 被引量：1

7

作者 陆健 宋正海 +7 位作者 吕延飞 赵福平 张莉 魏彩虹 范广习 丁家桐 李碧春 杜立新 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第5期14-19,共6页

Myostatin(MSTN)基因是胚胎期肌肉形成和出生后骨骼肌生长的主要调控因子之一,通过抑制肌细胞的扩增和分化而调控肌肉的生长和发育。为了进一步揭示MSTN在绵羊成纤维细胞中的生物学功能,采用RT-PCR从绵羊肌肉组织中扩增MSTN基因,将其cDN... Myostatin(MSTN)基因是胚胎期肌肉形成和出生后骨骼肌生长的主要调控因子之一,通过抑制肌细胞的扩增和分化而调控肌肉的生长和发育。为了进一步揭示MSTN在绵羊成纤维细胞中的生物学功能,采用RT-PCR从绵羊肌肉组织中扩增MSTN基因,将其cDNA终止密码子TGA删除,采用定向克隆技术连接到带有水母绿色荧光蛋白(AcGFP)报告基因的真核表达载体pAcGFP-N1中,构建融合蛋白重组质粒,经XhoⅠ/SacⅡ双酶切、测序鉴定后,用脂质体介导质粒转染绵羊原代成纤维细胞,观测荧光表达及用RT-PCR和Western blotting方法检测基因转录、蛋白质表达情况。结果表明,成功克隆绵羊MSTN基因,通过PCR方法在MSTN阅读框两端引入了XhoⅠ和SacⅡ克隆位点,成功构建pAcGFP-MSTN融合蛋白真核表达载体,重组质粒转染绵羊成纤维细胞24h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,通过RT-PCR扩增出1138bp的转录产物,并用Western blotting检测到78ku目的蛋白的表达。本试验为研究MSTN基因在成纤维细胞和脂肪分化调控中的具体机制奠定基础。 展开更多

关键词 MYOSTATIN 绵羊成纤维细胞 真核表达载体

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绵羊胎儿成纤维细胞体外培养及转基因研究 被引量：6

8

作者 马玉珍 扈廷茂 +2 位作者 王建国 扈会平 刘明秋 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2003年第4期195-198,共4页

目的　用增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因转染体外培养绵羊胎儿成纤维细胞 ,探讨绿色荧光蛋白对绵羊胎儿成纤维细胞生物学特性的影响。方法　体外分离培养绵羊胎儿成纤维细胞 ,经脂质体介导EGFP基因转染第一代成纤维细胞 ,G4 18筛选 10～... 目的　用增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因转染体外培养绵羊胎儿成纤维细胞 ,探讨绿色荧光蛋白对绵羊胎儿成纤维细胞生物学特性的影响。方法　体外分离培养绵羊胎儿成纤维细胞 ,经脂质体介导EGFP基因转染第一代成纤维细胞 ,G4 18筛选 10～ 12d ,挑选转基因单克隆细胞 ,传代培养 ,进行细胞形态观察、生长曲线以及染色体核型分析 ,并进行了培养细胞性别鉴定。结果　整合有EGFP基因的绵羊胎儿成纤维细胞生物学行为与未转染外源基因的细胞无明显差别 ,根据荧光强度可直接反应外源基因的表达量。结论　EGFP基因作为体内报告基因可用于转基因细胞的研究 ,并将整合有EGFP基因的转基因细胞为克隆动物提供核供体奠定了基础。 展开更多

关键词 绵羊 胎儿 成纤维细胞 体外培养 转基因 克隆细胞 增强型绿色荧光蛋白

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表达红色荧光及转胸腺素β4基因绵羊胎儿成纤维细胞系的制备 被引量：1

9

作者 王彦凤 梁燕 +7 位作者 王玮 史偈君 金永 王晓晶 郭旭东 王潇 王志钢 刘东军 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期158-162,共5页

旨在构建胸腺素β4(thymosin beta4,Tβ4)基因真核表达载体并转染绵羊胎儿成纤维细胞,获得稳定表达胸腺素β4及红色荧光蛋白的转基因细胞克隆。将克隆载体pMD19TT中的胸腺素β4基因亚克隆到表达载体pIRES2-DsRed2的多克隆位点,构建表达... 旨在构建胸腺素β4(thymosin beta4,Tβ4)基因真核表达载体并转染绵羊胎儿成纤维细胞,获得稳定表达胸腺素β4及红色荧光蛋白的转基因细胞克隆。将克隆载体pMD19TT中的胸腺素β4基因亚克隆到表达载体pIRES2-DsRed2的多克隆位点,构建表达载体pIRES2-DsRed2-Tβ4,脂质体介导转染绵羊胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。RT-PCR检测Tβ4基因在宿主细胞中的转录。测序结果显示,构建的表达载体pIRES2-DsRed2-Tβ4序列中,Tβ4基因正确连接在CMV启动子下游,顺序连接IRES2序列和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。脂质体介导的稳定转染效率约为15%,经G418筛选得到转基因细胞克隆并高效表达红色荧光蛋白。RT-PCR检测显示外源Tβ4基因在绵羊胎儿成纤维细胞中得到转录。成功构建具有红色荧光蛋白和新霉素抗性双选择标记的胸腺素β4基因真核表达载体并稳定转染绵羊胎儿成纤维细胞,筛选得到的超表达胸腺素β4绵羊胎儿成纤维细胞系为下一步通过核移植和克隆技术获得转基因绵羊提供了条件。 展开更多

关键词 胸腺素Β4 绵羊胎儿成纤维细胞 转基因细胞系

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siRNA干扰绵羊胚胎成纤维细胞Lig4基因增加同源重组载体重连修复效率

10

作者 王伟 王玉霜 +4 位作者 黄兰兰 简子健 王新华 刘守仁 皮文辉 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期831-839,共9页

在动物细胞中，抑制非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）修复途径，可以提高同源重组（Homologous recombination, HR）修复基因组双链断裂（Double-strand brakes, DSBs）的发生概率。为了提高绵羊胚胎成纤维细胞的 HR... 在动物细胞中，抑制非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）修复途径，可以提高同源重组（Homologous recombination, HR）修复基因组双链断裂（Double-strand brakes, DSBs）的发生概率。为了提高绵羊胚胎成纤维细胞的 HR 效率，针对 NHEJ 修复途径中的关键因子 Lig4（DNA ligase 4）基因，本文设计合成4个具有靶向性的 siRNA（Small interfering RNA）。绵羊胚胎成纤维细胞经电转染导入 siRNA，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和 Western blotting 检测，筛选出有效抑制 Lig4基因表达的2个 siRNA。应用质粒重连法检测HR 修复效率，将 I-SceⅠ酶线性化的 HR 质粒和 siRNA 共转染绵羊胚胎成纤维细胞，经72 h 培养及流式细胞仪检测，与对照组细胞比较，结果表明 HR 质粒重连效率提高了3~4倍。瞬间干扰 Lig4基因的表达可提高 HR质粒重连效率，为改善绵羊胚胎成纤维细胞基因打靶效率提供理论基础。 展开更多

关键词 SIRNA Lig4 基因 同源重组 绵羊胚胎成纤维细胞

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Lipofectamine^TM和Fugene-6介导GFP基因转染绵羊胎儿成纤维细胞的比较研究 被引量：4

11

作者 马玉珍 王瑞 +3 位作者 闫真 王利民 刘东军 夏国良 《中国农业科技导报》 CAS CSCD 2008年第1期108-112,共5页

分别用LipofectamineTM和Fegene-6介导质粒pEGFP-C1转染体外培养的绵羊胎儿成纤维细胞(sheepfetal fibroblast cells,sFFCs),比较了DNA浓度、转染试剂用量以及细胞暴露于DNA、转染试剂中作用时间对转染效率的影响,通过含G418的DMEM/F12... 分别用LipofectamineTM和Fegene-6介导质粒pEGFP-C1转染体外培养的绵羊胎儿成纤维细胞(sheepfetal fibroblast cells,sFFCs),比较了DNA浓度、转染试剂用量以及细胞暴露于DNA、转染试剂中作用时间对转染效率的影响,通过含G418的DMEM/F12培养液筛选得到转基因单克隆细胞。结果表明脂质体转染试剂LipofectamineTM转染效率优于Fegene-6。另外,对转基因细胞进行了染色体核型分析。结果表明,转基因细胞中二倍体核型占74.5%,与对照组比较没有显著性差异。以上研究为其他基因转染sFFCs以及利用体细胞克隆法生产转基因绵羊提供了参考依据。 展开更多

关键词 绵羊胎儿成纤维细胞 脂质体 转基因 染色体

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绵羊胚胎成纤维细胞饲养层用于培养人诱导性多能干细胞的效果研究 被引量：1

12

作者 张世强 李孟心 +6 位作者 韩高链 郭丽荣 赵迪鹏 李俊玲 郭田燕 杜荣 秦健 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第3期729-735,共7页

试验在体外分离培养1月龄绵羊胚胎成纤维细胞(sheep embryonic fibroblast,SEF),经丝裂霉素C处理后探讨其作为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)体外培养饲养层的可行性。试验以SNL饲养层细胞为对照,人iPSC(hiPSC... 试验在体外分离培养1月龄绵羊胚胎成纤维细胞(sheep embryonic fibroblast,SEF),经丝裂霉素C处理后探讨其作为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)体外培养饲养层的可行性。试验以SNL饲养层细胞为对照,人iPSC(hiPSC)为培养对象,通过形态学观察、碱性磷酸酶(AP)染色、以及实时荧光定量PCR和免疫细胞化学对hiPSC标志基因mRNA和蛋白表达的检测,比较了SEF细胞和SNL细胞作为干细胞饲养层的效果。结果表明,在试验期内,与SNL饲养层体外培养的hiPSC相似,SEF饲养层体外培养的hiPSC在形态上呈集落样生长,增殖速度快;AP染色呈蓝紫色,能够维持未分化状态;能正常表达多能性标志基因。两种饲养层细胞培养的hiPSC多能性标志基因c-Myc、Klf4、OCT 4和SOX 2 mRNA的表达以及OCT4、SOX2、SSEA4和TRA-1-60蛋白的表达并无显著差异(P>0.05)。本研究结果初步表明SEF可作为体外培养iPSC的饲养层细胞,为进一步建立可表达促生长因子的基因修饰SEF细胞系奠定了基础。 展开更多

关键词 绵羊胚胎成纤维细胞(SEF) 饲养层 诱导性多能干细胞(iPSC) 多能性

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