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流式细胞术在检测细胞氧化还原状态荧光蛋白探针中的应用
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作者 田烨 刘奥 +3 位作者 董瑞 祁星 易静 杨洁 《上海交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期10-17,共8页
目的·探索流式细胞术检测基因编码的荧光蛋白探针ro GFP2的方法,比较其与经典的激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)检测方法的异同,探讨其在检测不同氧化还原状态细胞亚群中的应用价值。方法·用r... 目的·探索流式细胞术检测基因编码的荧光蛋白探针ro GFP2的方法,比较其与经典的激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)检测方法的异同,探讨其在检测不同氧化还原状态细胞亚群中的应用价值。方法·用ro GFP2转染He La细胞,经H_2O_2处理后,采用LSCM技术和流式细胞术分别检测ro GFP2,以405 nm/488 nm荧光信号强度比值反映细胞氧化还原状态。转染胰腺癌细胞株Panc-1细胞,应用流式细胞术检测CD44和CD24不同标记细胞亚群的ro GFP2,比较干细胞与其他细胞氧化还原状态的异同。结果·与LSCM技术相比,流式细胞术也可检测H_2O_2引起的ro GFP2变化,且可区分群体中不同的亚群。Panc-1细胞中CD24^+/CD44^+肿瘤干细胞群与非干细胞群相比,ro GFP2比值更低,细胞处于更还原的状态。结论·流式细胞术可用于检测基因编码的氧化还原探针和特异地分析亚群的变化,可能将应用于肿瘤生物学、干细胞生物学等研究中。 展开更多
关键词 流式细胞术 细胞氧化还原状态 基因编码荧光蛋白探针 rogfp2 肿瘤干细胞
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Exploring the precision redox map during fasting-refeeding and satiation in C.elegans 被引量:1
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作者 Xinhua Qiao Lu Kang +7 位作者 Chang Shi Aojun Ye Dongli Wu Yuyunfei Huang Minghao Deng Jiarui Wang Yuzheng Zhao Chang Chen 《Stress Biology》 2023年第1期187-200,共14页
Fasting is a popular dietary strategy because it grants numerous advantages,and redox regulation is one mecha-nism involved.However,the precise redox changes with respect to the redox species,organelles and tissues re... Fasting is a popular dietary strategy because it grants numerous advantages,and redox regulation is one mecha-nism involved.However,the precise redox changes with respect to the redox species,organelles and tissues remain unclear,which hinders the understanding of the metabolic mechanism,and exploring the precision redox map under various dietary statuses is of great significance.Twelve redox-sensitive C.elegans strains stably expressing genetically encoded redox fluorescent probes(Hyperion sensing H_(2)O_(2) and Grx1-roGFP2 sensing GSH/GSSG)in three organelles(cytoplasm,mitochondria and endoplasmic reticulum(ER))were constructed in two tissues(body wall muscle and neurons)and were confirmed to respond to redox challenge.The H_(2)O_(2) and GSSG/GSH redox changes in two tissues and three organelles were obtained by confocal microscopy during fasting,refeeding,and satiation.We found that under fasting condition,H_(2)O_(2) decreased in most compartments,except for an increase in mitochondria,while GSSG/GSH increased in the cytoplasm of body muscle and the ER of neurons.After refeeding,the redox changes in H_(2)O_(2) and GSSG/GSH caused by fasting were reversed in most organelles of the body wall muscle and neurons.In the sati-ated state,H_(2)O_(2) increased markedly in the cytoplasm,mitochondria and ER of muscle and the ER of neurons,while GSSG/GSH exhibited no change in most organelles of the two tissues except for an increase in the ER of muscle.Our study systematically and precisely presents the redox characteristics under different dietary states in living animals and provides a basis for further investigating the redox mechanism in metabolism and optimizing dietary guidance. 展开更多
关键词 Redox FASTING REFEEDING SATIATION HYPERION Grx1-rogfp2 Caenorhabditis elegans
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线粒体ROS改变参与石蒜碱诱导的HepG2细胞凋亡 被引量:2
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作者 抗晶晶 刘晓宁 《南京师大学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期91-96,共6页
探究石蒜碱诱导HepG2细胞凋亡的分子机理. CCK-8实验检测细胞增殖情况;流式细胞术检测加或不加SS31情况下,石蒜碱对HepG2细胞凋亡比例的影响;用核酸染料Hoechst 33342评估凋亡细胞细胞核的形态变化;用Western blot分析技术检测PARP片段... 探究石蒜碱诱导HepG2细胞凋亡的分子机理. CCK-8实验检测细胞增殖情况;流式细胞术检测加或不加SS31情况下,石蒜碱对HepG2细胞凋亡比例的影响;用核酸染料Hoechst 33342评估凋亡细胞细胞核的形态变化;用Western blot分析技术检测PARP片段的表达情况.成功构建靶向线粒体的Mito-Grx1-roGFP2转基因稳定株肝癌细胞系HepG2. SS31作为线粒体ROS的定向清除剂,能够改善石蒜碱引起的HepG2细胞形态学损伤及细胞核内PARP切割,抑制石蒜碱诱导的细胞凋亡,降低反映线粒体ROS含量的405 nm/488 nm荧光比值.研究结果提示,线粒体内ROS水平的改变是石蒜碱诱导HepG2细胞凋亡的机制之一.石蒜碱有望成为治疗肝癌的潜力药物,值得更深入的研究. 展开更多
关键词 石蒜碱 人类肝癌HepG2细胞 细胞凋亡 mito-Grx1-rogfp2 线粒体ROS SS31
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靶向线粒体的mt-roGFP2荧光探针检测人肝癌HepG2细胞线粒体ROS水平动态变化 被引量:3
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作者 刘晓宁 薄惠 刘翠娥 《山东医药》 CAS 2018年第8期14-17,共4页
目的通过靶向线粒体的氧化还原敏感绿色荧光蛋白探针(mt-roGFP2荧光探针)检测人肝癌HepG2细胞(以下称HepG2细胞)线粒体活性氧(ROS)水平动态变化,旨在为以线粒体ROS为靶标的肝癌化疗奠定基础。方法采用无缝克隆技术构建pLenti-CMV-mt-roG... 目的通过靶向线粒体的氧化还原敏感绿色荧光蛋白探针(mt-roGFP2荧光探针)检测人肝癌HepG2细胞(以下称HepG2细胞)线粒体活性氧(ROS)水平动态变化,旨在为以线粒体ROS为靶标的肝癌化疗奠定基础。方法采用无缝克隆技术构建pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro慢病毒载体并测序鉴定。将慢病毒载体pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro与包装质粒pVSVg、pRev和pGag-Pol共转染人肾上皮293T细胞,获得mt-roGFP2慢病毒颗粒,并检测病毒滴度。将制备好的mt-roGFP2慢病毒颗粒感染HepG2细胞,通过荧光显微镜和Western blotting法鉴定观察HepG2细胞roGFP表达情况。将对数生长期稳定表达mt-roGFP2的HepG2细胞(HepG2-mtroGFP2细胞)与Mito Tracker线粒体荧光探针共温育,采用激光共聚焦显微镜观察mt-roGFP2荧光探针的亚细胞定位。取对数生长期HepG2-mt-roGFP2细胞先后经0.5 mmol/L过氧化氢(H_2O_2)和1 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)处理,采用尼康A1R激光扫描共聚焦显微镜拍摄同一细胞,Image J软件分析荧光图片。结果成功构建p LentiCMV-mt-roGFP2-PGK-puro慢病毒载体。制备的mt-roGFP2慢病毒平均滴度为4.04×10~8 IU/mL。mt-roGFP2荧光探针稳定表达在HepG2细胞中,并正确靶向HepG2细胞线粒体,成功构建HepG2-mt-roGFP2细胞。外源性氧化剂H_2O_2的加入可导致HepG2-mt-roGFP2细胞线粒体ROS水平明显升高,其荧光比值(405 nm/488 nm)从1.19上升到3.98,加入还原剂DTT可使其荧光比值下降至1.25。结论靶向线粒体的mt-roGFP2荧光探针能够实时动态、可逆地检测HepG2细胞线粒体ROS水平变化并实时成像。 展开更多
关键词 肝癌 HEPG2细胞 活性氧 线粒体 靶向线粒体的氧化还原敏感绿色荧光蛋白探针
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hpRNA的制备新方法及其在RNAi载体中的应用
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作者 刘晓宁 《安徽农业科学》 CAS 2016年第4期175-177,244,共4页
[目的]验证制备新方法所获得的稳定hpRNA是否可用于RNAi载体的构建并达到基因表达干扰的效果。[方法]利用制备新方法(2μL DNA与8μL H_2O混匀,95℃5 min,37℃15 min)制备hpRNA,后采用REGS方法构建Zm MDAR RNAi载体,通过Grx1-ro GFP2和... [目的]验证制备新方法所获得的稳定hpRNA是否可用于RNAi载体的构建并达到基因表达干扰的效果。[方法]利用制备新方法(2μL DNA与8μL H_2O混匀,95℃5 min,37℃15 min)制备hpRNA,后采用REGS方法构建Zm MDAR RNAi载体,通过Grx1-ro GFP2和荧光实时定量PCR检测基因表达干扰的效果。[结果]利用制备新方法制备50 nt hpRNA。Zm MDAR基因的表达量变化和Grxl-ro GFP2探针的荧光比值变化表明hpRNA介导的干扰载体引起了原生质体氧化还原状态的变化。[结论]通过制备新方法所制备的hpRNA为RNAi载体所介导的干扰作用奠定基础。 展开更多
关键词 发夹RNA REGS ZmMDAR RNAI Grx1-rogfp2
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