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重组人白细胞介素-2痘苗病毒的构建与鉴定
1
作者 郜恒骏 童菊芳 +3 位作者 朱红音 顾伟齐 任卫平 萧树东 《胃肠病学》 2001年第3期161-165,共5页
目的：构建表达人白细胞介素－２（ｈＩＬ－２）的重组痘苗病毒，为肿瘤免疫基因治疗作必要准备。方法：应用分子克隆基因重组技术构建重组ｈＩＬ－２痘苗病毒真核表达载体ＰＭＪ６０１（ＭＪ６０１ｈｌＬ－２）。在此基础上，应用分子... 目的：构建表达人白细胞介素－２（ｈＩＬ－２）的重组痘苗病毒，为肿瘤免疫基因治疗作必要准备。方法：应用分子克隆基因重组技术构建重组ｈＩＬ－２痘苗病毒真核表达载体ＰＭＪ６０１（ＭＪ６０１ｈｌＬ－２）。在此基础上，应用分子病毒学同源重组技术构建能表达ｈＩＬ－２的重组痘苗病毒（ＶＭＪ６０１ｈＩＬ－２）。制备ｈＩＬ－２探针，用ＤＮＡ杂交技术鉴定ＶＭＪ６０１ｈＩＬ－２，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）检测ＶＭＪ６０１ｈＩＬ－２的基因产物。结果：成功构建了ＭＪ６０１ｈＩＬ－２和ＶＭＪ６０１ｈＩＬ－２，ＶＭＪ６０１ｈＩＬ－２感染的ＳＧＣ７９０１胃癌细胞能分泌具有生物活性的ｈＩＬ－２蛋白。结论：ＶＭＪ６０１ｈＩＬ－２的构建与鉴定为进一步实施体内恶性肿瘤免疫基因治疗打下了坚实的基础。 展开更多
关键词 白细胞介素2 痘苗病毒 遗传重组 免疫疗法 胃癌
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HCVC基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-C的构建、鉴定及表达 被引量：15
2
作者 郝春秋 周永兴 +3 位作者 冯志华 李谨革 贾战生 王平忠 《世界华人消化杂志》 CAS 2001年第6期635-639,共5页
目的构建能表达HVC基因的腺病毒表达载体的重组骨架质粒,为进一步包装能高效表达HCVC基因的腺病毒载体做准备。方法用分别含有BgⅡ及HindⅢ酶切位点的HCVC区基因上、下游引物,以含有HCV H株基因序列的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板,通过PC... 目的构建能表达HVC基因的腺病毒表达载体的重组骨架质粒,为进一步包装能高效表达HCVC基因的腺病毒载体做准备。方法用分别含有BgⅡ及HindⅢ酶切位点的HCVC区基因上、下游引物,以含有HCV H株基因序列的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCVC区基因片段,基因片段回收后,以BglⅡ及HindⅢ双酶切,定向插入到腺病毒骨架质粒pAd,CMV-Link.1中CMV启动子下游BglⅡ与HindⅢ位点之间,获得重组表达质粒pAd.HCV-C通过BglⅡ/HindⅢ双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行了鉴定,以抗HCVC单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测了pAd.HCV-C在人肝癌细胞7721中的瞬时表达。结果酶切、PCR及测序鉴定证实,pAd,HCV-C插入片段为HCVC区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达。结论构建的质粒pAd.HCV-C可以在7721细胞中瞬时表达HCVC区基因,为包装表达HCVC基因的腺病毒载体奠定了基础。 展开更多
关键词 C型肝炎样病毒属 遗传学 病毒基因 腺病毒科 遗传载体
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肝细胞生长因子对多囊肾病囊肿衬里上皮细胞增殖及细胞外基质合成的影响 被引量：2
3
作者 原爱红 梅长林 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第7期642-644,共3页
目的 :研究重组人肝细胞生长因子 (rh HGF)对常染色体显性遗传型多囊肾病 (ADPKD)囊肿衬里上皮细胞增殖及细胞外基质合成的影响。方法 :用 3H- Td R掺入法测定不同浓度 (0 .5、1、2 .5、5 ng/m l) rh HGF作用 48h以及最适浓度的 rh HGF... 目的 :研究重组人肝细胞生长因子 (rh HGF)对常染色体显性遗传型多囊肾病 (ADPKD)囊肿衬里上皮细胞增殖及细胞外基质合成的影响。方法 :用 3H- Td R掺入法测定不同浓度 (0 .5、1、2 .5、5 ng/m l) rh HGF作用 48h以及最适浓度的 rh HGF分别作用 2 4、48、72 h ADPKD囊肿衬里上皮细胞系细胞的增殖情况 ;并分别用 3H -脯氨酸掺入法和放免法测定最适浓度rh HGF作用最佳时间后 ADPKD囊肿衬里上皮细胞系细胞胶原及层粘连蛋白的合成情况。 结果 :rh HGF促进了 ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖及胶原和层粘连蛋白的合成 ,以 1ng/m l持续作用 48h最为显著。结论 :rh HGF对体外培养的 ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖及细胞外基质合成有明显的促进作用。 展开更多
关键词 肝细胞生长因子 重组遗传 肾 常染色体显性 囊肿衬里上皮细胞 细胞外基质 ADPKD
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基因转移FasL治疗人黑素瘤的实验研究
4
作者 马文雄 陈桂林 +4 位作者 韦永新 惠国桢 张世明 周岱 杜子威 《实用肿瘤杂志》 CAS 2006年第2期111-114,共4页
目的探讨体内外基因转移F as配体(F as-ligand,F asL)对恶性人黑素瘤细胞凋亡的影响。方法用携带人F asL cDNA的缺陷型重组腺病毒(A d-F asL),在体外转导两株黑素瘤细胞,并使其表达;通过流式细胞仪、RT-PCR法进行F as/F asL表达检测,TU... 目的探讨体内外基因转移F as配体(F as-ligand,F asL)对恶性人黑素瘤细胞凋亡的影响。方法用携带人F asL cDNA的缺陷型重组腺病毒(A d-F asL),在体外转导两株黑素瘤细胞,并使其表达;通过流式细胞仪、RT-PCR法进行F as/F asL表达检测,TUNEL法及荧光显微镜相关凋亡检测、分析。建立人黑素瘤裸鼠模型,并对其进行体内疗效观察及病理学检查。结果流式细胞仪和RT-PCR检测两株黑素瘤细胞表面均表达F as,不表达F asL,而A d-F asL转导的两株黑素瘤细胞均能表达F asL;A d-F asL能显著诱导两株黑素瘤细胞在体外凋亡或抑制其生长。体内疗效观察黑素瘤荷瘤鼠模型治疗组瘤重(0.48±0.16)g与对照组瘤重(1.02±0.19)g相比,差异有显著性(P<0.05)。肿瘤组织形态学检查,治疗组可见肿瘤细胞凋亡坏死区及炎性细胞浸润。结论F asL基因重组腺病毒在体内外均具有显著诱导人黑素瘤细胞凋亡的效果。 展开更多
关键词 黑色素瘤/病理学 小鼠 裸 基因转移 脱噬作用 重组 遗传 肿瘤细胞 培养的 腺病毒科 膜糖蛋白类
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Red同源重组技术研究进展 被引量：22
5
作者 韩聪 张惟材 游松 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 2003年第12期17-21,共5页
伴随着分子生物学的发展 ,一种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究。Red重组系统由三种蛋白组成 :Exo蛋白是一种核酸外切酶 ,结合在双链DNA的末端 ,从 5′端向 3′端降解DNA ,产生 3′突出端 ;Beta蛋白... 伴随着分子生物学的发展 ,一种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究。Red重组系统由三种蛋白组成 :Exo蛋白是一种核酸外切酶 ,结合在双链DNA的末端 ,从 5′端向 3′端降解DNA ,产生 3′突出端 ;Beta蛋白结合在单链DNA上 ,介导互补单链DNA退火 ;Gam蛋白可与RecBCD酶结合 ,抑制其降解外源DNA的活性。Red同源重组技术具有同源序列短 ( 4 0～ 60bp)、重组效率高的特点。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作 ,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外 ,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上 ,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行 。 展开更多
关键词 RED同源重组 基因打靶 基因工程 Red重组酶
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静脉注射吸毒感染者体内HIV-1CRF07_BC的准种变异特征 被引量：4
6
作者 辛若雷 马泽芹 +7 位作者 程春林 邢辉 洪坤学 阮玉华 李佳 卢红艳 邵一鸣 何翔 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期316-322,共7页
为了研究静脉注射吸毒者(IDU)体内HIV-1CRF07_BC病毒准种变异和遗传多样性特征,本文采用单基因组扩增(SGA)技术分别从6份CRF07_BC感染者血浆获得HIV-1病毒准种env基因gp120片段序列11～28条,采用构建系统进化树的方法进行聚类分析,描述... 为了研究静脉注射吸毒者(IDU)体内HIV-1CRF07_BC病毒准种变异和遗传多样性特征,本文采用单基因组扩增(SGA)技术分别从6份CRF07_BC感染者血浆获得HIV-1病毒准种env基因gp120片段序列11～28条,采用构建系统进化树的方法进行聚类分析,描述感染者血浆中CRF07_BC病毒准种的变异特征;运用Simplot软件、分段系统进化树和对平均两两比对基因距离进行遗传多样性作图(Diversity plot)的方法分析病毒准种间的重组。系统进化树分析结果显示仅1个病例具有较高的遗传同质性,而其他5个病例的遗传异质性较高,主要表现为系统进化树上形成2～4个次级进化簇。此外,有3个病例存在病毒准种间的重组。本研究表明SGA技术能有效地分析感染者体内病毒准种复杂的变异特征。 展开更多
关键词 人类免疫缺陷病毒 单基因组扩增 病毒准种 重组 遗传多样性
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利用Cre/loxP系统构建无标记的htrA基因缺失的变链菌突变株 被引量：4
7
作者 张文娟 于丹妮 +1 位作者 韩育植 任志明 《天津医药》 CAS 北大核心 2011年第2期108-111,共4页
目的:利用Cre/loxP位点特异性重组系统构建口腔变异链球菌htrA基因缺陷株,并删除选择标记。方法:PCR扩增变链菌的htrA基因片段并克隆到pGEM-T-EasyTA载体。随后插入卡那霉素(Km)抗性基因盒(loxP-Km-loxP)并替换htrA基因的部分序列,使htr... 目的:利用Cre/loxP位点特异性重组系统构建口腔变异链球菌htrA基因缺陷株,并删除选择标记。方法:PCR扩增变链菌的htrA基因片段并克隆到pGEM-T-EasyTA载体。随后插入卡那霉素(Km)抗性基因盒(loxP-Km-loxP)并替换htrA基因的部分序列,使htrA基因失活,构建出htrA基因缺失的同源重组载体pIB△htrA-Km。将该质粒电转化变链菌标准株,抗生素筛选出发生同源重组的菌株,再用含cre基因的热敏质粒pCrePA电转化,删除Km抗性基因。在限制性温度下培养,消除质粒pCrePA,获得无标记的变链菌htrA基因缺陷株,经PCR及DNA测序鉴定。结果:PCR及DNA测序分析证明htrA基因的部分序列及Km抗性基因均被删除,该部位只留下一个loxP位点。结论:成功构建出了变链菌htrA基因缺失突变株,并删除了抗性标记,为进一步研究htrA基因缺失对变链菌致龋毒力的影响奠定了基础。 展开更多
关键词 链球菌 变异 丝氨酸内肽酶类 整合酶类 重组 遗传 基因缺失 聚合酶链反应 质粒
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重组hIFN-α-2b-BCG的冻干制备及生物特性的研究
8
作者 孙二琳 赵杰 +1 位作者 范晓东 韩瑞发 《天津医药》 CAS 北大核心 2010年第11期929-932,共4页
目的:研究重组hIFN-α-2b-BCG真空冷冻干燥的制备工艺,研究冻干后生物特性的变化。方法:采用真空冷冻干燥法制备重组BCG(rBCG),筛选最佳工艺参数。平板计数法比较冷冻干前后的活菌数,计算存活率。比较冻干前后rBCG的抗酸染色特征与形态... 目的:研究重组hIFN-α-2b-BCG真空冷冻干燥的制备工艺,研究冻干后生物特性的变化。方法:采用真空冷冻干燥法制备重组BCG(rBCG),筛选最佳工艺参数。平板计数法比较冷冻干前后的活菌数,计算存活率。比较冻干前后rBCG的抗酸染色特征与形态,连续测定OD值,绘制生长曲线,酶联免疫吸附测定(ELISA)IFN-α-2b表达水平。PCR和抗性培养分析冻干后的质粒稳定性。结果:冻干后重组BCG为(6.51±0.33)×106CFU/mL,冻干前为(1.02±0.11)×107CFU/mL,存活率约65%,达到BCG生物免疫治疗所需的活菌标准。冻干前后的菌落形态、生长曲线及抗酸染色特征无明显差异。质粒插入基因稳定率91.7%,丢失率为8.3%。冻干前后分泌IFN-α-2b水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功制备了重组hIFN-α-2bBCG冻干制剂,活菌数达到生物免疫治疗标准,其生物学特性和质粒稳定性均可耐受冷冻、低温与真空干燥过程中的不利影响。 展开更多
关键词 干扰素α-2b卡介苗重组 遗传质粒冷冻干燥法酶联免疫吸附测定
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