抗体细胞因子融合蛋白治疗肿瘤的研究进展 被引量：1

1

作者 顾军 王雅杰 《肿瘤防治杂志》 2003年第2期212-215,共4页

抗体细胞因子融合蛋白保持了抗体和细胞因子两者的功能 ,能在肿瘤微环境浓集并直接增大抗体的抗肿瘤效应和 或宿主的抗肿瘤免疫。综述了IgG融合IL 2、GM CSF和IL 12融合蛋白的结构。

关键词 抗体 生物因子 肿瘤 免疫学 重组融合蛋白质类 细胞因子 综述

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弓形虫ZS株P22基因片段的克隆、表达与融合蛋白的纯化

2

作者 陈义忠 章涛 +2 位作者 彭碧文 黄清玲 林建银 《福建医科大学学报》 2003年第2期133-136,共4页

目的　克隆弓形虫 ZS株表面抗原 P2 2编码基因 ,构建原核重组表达质粒 p Thio His A,B,C/ P2 2 ,并在大肠杆菌 (Top10 )中进行表达及纯化融合蛋白。　方法　 PCR扩增及限制性内切酶 Pst 和 Bgl 双酶切 4 96 bp的弓形虫表面抗原 P2 2编... 目的　克隆弓形虫 ZS株表面抗原 P2 2编码基因 ,构建原核重组表达质粒 p Thio His A,B,C/ P2 2 ,并在大肠杆菌 (Top10 )中进行表达及纯化融合蛋白。　方法　 PCR扩增及限制性内切酶 Pst 和 Bgl 双酶切 4 96 bp的弓形虫表面抗原 P2 2编码基因目的片段 ,胶回收纯化 ,插入表达质粒载体 p Thio His A,B,C多克隆位点 ,构建重组体p Thio His A,B,C/ P2 2 ,并转化大肠杆菌 (E.coli) Top10 ,筛选阳性克隆 ,以限制性酶切分析及测序鉴定后 ,以异丙基硫代β- D-半乳糖苷 (IPTG)进行诱导 ,在 E.coli Top10中表达 ,用 SDS- PAGE与免疫印迹分析表达产物并纯化。　结果　 PCR扩增出约 4 96 bp的 P2 2编码基因目的片段 ,与预期片段大小相符 ;所构建的 p Thio His A,B,C/ P2 2重组体阳性克隆经双酶切与测序鉴定 ,与预期结果一致 ;SDS- PAGE与免疫印迹显示 ,表达融合蛋白产物约 35 .4 k D。　结论　成功构建弓形虫 ZS株表面抗原 P2 2编码基因 p Thio His A,B,C/ P2 2表达质粒 ,诱导表达弓形虫表面抗原 P2 2蛋白 。 展开更多

关键词 弓形虫 鼠 克隆 分子 基因表达 重组融合蛋白质类 抗原 原虫 质粒

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抗菌肽Alloferon-1串联式重组表达及其表达产物体外抗肿瘤活性的研究 被引量：4

3

作者 孙琦 孙爱华 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第1期60-66,共7页

目的:构建串联式表达Alloferon-1的原核重组表达系统,检测合成及重组表达的Alloferon-1体外抗肿瘤细胞活性。方法:采用连接引物PCR法,构建含6×His-EK-8×Alloferon-1-EK-6×His序列的人工融合基因;采用常规分子生物学方法... 目的:构建串联式表达Alloferon-1的原核重组表达系统,检测合成及重组表达的Alloferon-1体外抗肿瘤细胞活性。方法:采用连接引物PCR法,构建含6×His-EK-8×Alloferon-1-EK-6×His序列的人工融合基因;采用常规分子生物学方法克隆并构建该人工融合基因及其原核表达系统;采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统了解目的重组产物8×rAlloferon-1-EK表达情况和产量;采用Ni-NTA亲和层析及EK酶切和Sephadex G-50层析法提纯8×rAlloferon-1-EK及rAlloferon-1-EK;采用MTT法检测rAlloferon-1-EK体外抑制KB、SGC和HL-60肿瘤细胞增殖的作用,并与直接合成的Alloferon-1(sAlloferon-1)和Alloferon-1-EK(sAlloferon-1-EK)的抗肿瘤作用比较。结果:获得了序列正确的目的人工融合基因克隆及其原核表达系统pET42a-8×rAlloferon-1-EK-E.coliBLDE3。在IPTG诱导下,该原核重组表达系统可表达串联式目的重组蛋白8×rAlloferon-1-EK,其产量约为细菌总蛋白的30%。Ni-NTA和Sephadex G-50层析后,可分别获得8×rAlloferon-1-EK和rAlloferon-1-EK。在25~100μg/ml剂量范围内,sAlloferon-1、sAlloferon-1-EK和rAlloferon-1、rAlloferon-1-EK均有明显抑制KB、SGC和HL-60肿瘤细胞生长及增殖的效果(P<0.01),且四者抑制作用无明显差异(P>0.05)。结论:本研究成功构建了串联表达rAlloferon-1的原核表达系统,其表达产物具有与合成的Alloferon-1和Alloferon-1-EK相似的体外抗肿瘤细胞活性。 展开更多

关键词 抗感染药 抗菌药 抗肿瘤药 肽类 重组 遗传 重组融合蛋白质类/药理学 质粒 聚合酶链反应

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人小肠三叶因子在大肠杆菌中的表达 被引量：9

4

作者 王蔚 口如琴 +1 位作者 李令媛 茹炳根 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1999年第5期724-728,共5页

利用PCR技术将人小肠三叶因子(hITF)基因重组入表达载体pGEX-4T-1,构建了融合蛋白GST-hITF的重组表达质粒pGTF,在大肠杆菌中诱导表达。表达的融合蛋白经亲和层析、凝血酶切和凝胶过滤层析得到纯化的hITF蛋白。测定了重组蛋白的氨基酸组... 利用PCR技术将人小肠三叶因子(hITF)基因重组入表达载体pGEX-4T-1,构建了融合蛋白GST-hITF的重组表达质粒pGTF,在大肠杆菌中诱导表达。表达的融合蛋白经亲和层析、凝血酶切和凝胶过滤层析得到纯化的hITF蛋白。测定了重组蛋白的氨基酸组成、分子量及其对酸和蛋白酶的抗性。Western印迹表明重组蛋白具有hITF的抗原性,并对大鼠胃溃疡具有明显的预防和保护作用。 展开更多

关键词 小肠三叶因子 基因重组 表达 融合蛋白

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GST-NLS(ING1)融合蛋白表达载体构建及表达纯化的研究 被引量：4

5

作者 孙兆明 于士柱 +1 位作者 安同 周宏旭 《国际生物医学工程杂志》 CAS 2006年第2期69-72,80,共5页

目的构建P33ING1b核定位信号肽(NLS)与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)重组的融合蛋白(GST-NLS)原核表达载体及建立GST-NLS纯化技术。方法先用RT-PCR从ING1基因中扩增编码NLS的cDNA片段,将其插入克隆质粒pbluescript-SK,再以克隆质粒NLS片段为模... 目的构建P33ING1b核定位信号肽(NLS)与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)重组的融合蛋白(GST-NLS)原核表达载体及建立GST-NLS纯化技术。方法先用RT-PCR从ING1基因中扩增编码NLS的cDNA片段,将其插入克隆质粒pbluescript-SK,再以克隆质粒NLS片段为模板,PCR扩增NLScDNA片段,并加入限制性酶切位点和终止子,进而将其插入原核表达质粒pGEX-5X-3,构建GST-NLS原核表达载体pGEX-5X-3-NLS,最后用IPTG诱导其在大肠杆菌(BL21)中表达,用谷胱甘肽-琼脂糖小珠亲和纯化表达的GST-NLS。结果酶切鉴定和测序分析显示,NLScDNA片段被成功插入pbluescript-SK多克隆位点;NLScDNA片段在pGEX-5X-3-NLS中的插入位点、碱基序列及读码框和终止子的次序完全正确,NLScDNA序列位于表达载体的GST序列下游,插入片段全长183bp。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达和亲和纯化,从负荷pGEX-5X-3-NLS质粒的BL21菌株中获得了31.57ku的GST-NLS。结论成功建立了重组GST-NLS的原核表达载体、表达菌株及诱导表达和纯化的方法学,为进一步研究p33ING1b入核运载机制提供了重要技术手段。 展开更多

关键词 生长抑制因子-1 基因重组 pGEX-5X-3表达载体 融合蛋白

原文传递

P450酶系中高效电子传递链的构建及应用 被引量：4

6

作者 柯霞 孙骏 郑裕国 《生命的化学》 CAS CSCD 2015年第6期733-740,共8页

细胞色素P450作为单加氧酶的主要成员,能够在多种化合物中引入氧分子,催化包括羟化在内的多种反应。在级联的氧化还原反应中,需特定的电子传递链将氧原子中的电子传递至P450单加氧酶的亚铁红素结构中,并最终催化底物氧化,而电子传递体... 细胞色素P450作为单加氧酶的主要成员,能够在多种化合物中引入氧分子,催化包括羟化在内的多种反应。在级联的氧化还原反应中,需特定的电子传递链将氧原子中的电子传递至P450单加氧酶的亚铁红素结构中,并最终催化底物氧化,而电子传递体系的低效性往往成为整个反应的限速步骤。本文在介绍P450单加氧酶电子传递链基本结构的基础上,着重阐述对于细胞色素P450酶系中电子传递链未知或者内源性电子传递效率较低的情况下,利用DNA重组技术构建高效的电子传递链从而提高P450单加氧酶的催化效率相关研究进展,主要从细菌及真核细胞线粒体电子传递链(ClassⅠ)及真核生物细胞色素C还原酶CPR(ClassⅡ),天然融合电子传递链及人工融合蛋白电子传递链的构建及其应用展开。 展开更多

关键词 P450单加氧酶 电子传递链 DNA重组 融合蛋白

原文传递

微囊化和基因修饰的肝细胞移植——人肝再生增强因子(hALR)的原核表达、纯化及生物活性研究 被引量：3

7

作者 张阳德 赵劲风 +2 位作者 杨林 刘晓冬 陈伟 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 2003年第5期1-5,9,共6页

目的 :构建人肝再生增强因子原核融合表达载体 ,并对表达产物进行生物活性研究 ,从而为hALR基因修饰的肝细胞移植的细胞来源研究提供实验依据 ,并为人肝再生增强因子的临床应用奠定基础。方法 :以pGEM -T -hALR为模板 ,应用PCR技术扩增... 目的 :构建人肝再生增强因子原核融合表达载体 ,并对表达产物进行生物活性研究 ,从而为hALR基因修饰的肝细胞移植的细胞来源研究提供实验依据 ,并为人肝再生增强因子的临床应用奠定基础。方法 :以pGEM -T -hALR为模板 ,应用PCR技术扩增出hALRcDNA ,克隆入原核融合表达载体pGEX - 4T - 2 ,限制性内切酶酶切及测序证实序列正确 ;转化大肠杆菌JM10 9:挑取阳性克隆以IPTG诱导表达融合蛋白GST -hALR ,融合蛋白通过谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析纯化后进行凝血酶酶切获得hALR单体 ;采用3 H -thymidine渗入法检测hALR单体的生物学活性。结果 :以 pGEM -T -hALR为模板 ,行PCR扩增后 ,产物于1.5 %琼脂糖凝胶电泳分析 ,可见 380bp特异性条带 ,符合hALRcDNA阅读框架的大小。构建融合蛋白GST-hALR的重组表达质粒pGEX - 4T - 2 -hALR ,经限制性内切酶酶切分析 ,与理论值相符 ,测序证明序列正确 ,片段为正向插入。重组表达质粒转化人肠杆菌JM 10 9。SDS -PAGE电泳分析显示重组菌在约 4 1KD处出现一蛋白条带。纯化、酶切后融合蛋白前体谷胱甘肽S -转移酶约 2 6KD ,hALR约 15KD。薄层扫描蛋白电泳结果表明 ,表达的融合蛋白占细菌可溶性蛋白总量的 31%。纯化hALR加入原代鼠肝细胞、HepG2 细胞培基 。 展开更多

关键词 人肝再生增强因子 基因重组 融合蛋白 转化 纯化 生物活性 诱导表达

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Survivin蛋白的原核表达及在肿瘤诊断中的初步应用研究 被引量：2

8

作者 郭建巍 王小平 +3 位作者 马骢 王珍光 蒋学兵 刘敏 《中国实验诊断学》 2007年第12期1576-1581,共6页

目的实现Survivin蛋白在大肠杆菌BL21中的可溶性表达,建立基于Survivin蛋白的Survivin抗体检测方法,为survivin的深入研究及肿瘤的早期诊断奠定基础。方法从食管癌细胞Eca109中提取RNA,经RT-PCR扩增,克隆出Survivin基因;用PCR将Survivi... 目的实现Survivin蛋白在大肠杆菌BL21中的可溶性表达,建立基于Survivin蛋白的Survivin抗体检测方法,为survivin的深入研究及肿瘤的早期诊断奠定基础。方法从食管癌细胞Eca109中提取RNA,经RT-PCR扩增,克隆出Survivin基因;用PCR将Survivin克隆至载体pET32a(+);用双酶切和DNA测序技术对构建的载体进行鉴定;IPTG诱导Survivin蛋白表达,用镍离子亲和层析纯化,ELISA及Western blot鉴定;建立基于重组融合蛋白的Survivin抗体检测方法,并对肿瘤和癌前病变患者血清进行检测。结果构建了Survivin蛋白原核表达载体pET32a(+)/Survivin/BL21,实现了Survivin蛋白在大肠杆菌BL21中的可溶性表达;建立了检测Survivin特异性抗体的间接ELISA,对44份健康血清1、42份肿瘤患者血清1、86份癌前病变患者血清进行了检测,结果显示:anti-Survivin在肿瘤患者中的检出率为32%,特异性为88%;anti-Survivin阳性率与年龄和性别无关(P>1.0,P>0.912);在69例消化系统肿瘤中,血清anti-Survivin阳性率32%;186例癌前病变患者anti-survivin阳性率31.7%,AFP和CEA阳性率分别为10.8%和16.7%(χ2=28.0705,P<0.005);在消化性溃疡患者,anti-survivin和CEA阳性率均为33.3%;在直肠息肉中anti-survivin阳性率33.3%,CEA阳性率仅为5.6%(χ2=34.309,P<0.005);在慢性结肠炎患者,anti-survivin阳性率40%,CEA阳性率20%(χ2=13.41,P<0.005)。结论本研究获得的Survivin蛋白和建立的Survivin抗体检测方法,为survivin作为肿瘤标志物的深入研究奠定了重要基础。 展开更多

关键词 SURVIVIN 融合蛋白 肿瘤 间接ETJSA

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自然释放法制备融合蛋白的研究 被引量：3

9

作者 刘克义 邓景惕 Kidson.C 《山东医科大学学报》 1990年第1期1-3,共3页

研究了IPTG诱导重组噬茵体λgtll/恶性疟原虫溶源化大肠杆菌Y1090,肉眼判断终点、自然释放融合蛋白的方法。并用SDS-PAGE和免疫印染证明了该法的可靠性。研究发现,重组噬菌体的用量与培养时间有关,IPTG的浓度对融合蛋白的制备起重大调... 研究了IPTG诱导重组噬茵体λgtll/恶性疟原虫溶源化大肠杆菌Y1090,肉眼判断终点、自然释放融合蛋白的方法。并用SDS-PAGE和免疫印染证明了该法的可靠性。研究发现,重组噬菌体的用量与培养时间有关,IPTG的浓度对融合蛋白的制备起重大调节作用,大肠杆菌Y1090可用作重组噬菌体溶源化菌。 展开更多

关键词 Λ噬菌体 恶性疟原虫 大肠杆菌 基因重组 融合蛋白 自然释放法 制备

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人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定 被引量：3

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作者 陈静 孙红颖 +2 位作者 杨颖 王学芬 陈枢青 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第2期126-133,共8页

目的:在毕赤酵母中高效分泌表达人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白。方法:利用PCR技术获得HSA和PTH(1-34)基因,以柔性连接肽相连插入到表达载体pPIC9,重组质粒线性化后,用化学法转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷型培养板和PCR鉴定筛选得... 目的:在毕赤酵母中高效分泌表达人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白。方法:利用PCR技术获得HSA和PTH(1-34)基因,以柔性连接肽相连插入到表达载体pPIC9,重组质粒线性化后,用化学法转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷型培养板和PCR鉴定筛选得到转化子。在启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白HSA-PTH(1-34)。PCR法和电泳鉴定表达验证阳性转化子,并观测不同时间点的表达量。Western blot验证其免疫活性,在兔肾皮质细胞膜中测定腺苷酸环化酶的激活产生cAMP的量来检测融合蛋白的生物学活性。结果:PCR鉴定重组转化子验证了融合基因的成功整合,用甲醇诱导表达,蛋白电泳分析表明融合基因得到高效表达,HSA-PTH(1-34)同时具有HSA和PTH(1-34)的抗原性,且能激活兔肾皮质细胞中的腺苷酸环化酶产生cAMP,但活性低于PTH(1-34)。结论:在毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白。 展开更多

关键词 毕赤酵母 甲状旁腺激素肽(1—34) 血清白蛋白 质粒 重组 遗传 人甲状旁腺激素(1—34) 融合蛋白 分泌表达

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布氏杆菌L7/L12和OMP31基因克隆及融合表达 被引量：2

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作者 李海涛 苗利光 +4 位作者 张广雷 刘艳环 孙金霞 王松 王文昊 《特产研究》 2010年第4期4-8,共5页

本研究根据已经发表的布氏杆菌基因序列,选择种间序列极为保守的保护性抗原L7/L12、OMP31基因,依此进行PCR扩增,利用引物上设计好的限制性内切酶酶切位点进行基因重组,构建了PME290-SDLOmp高效表达载体,并转化绿脓杆菌(PAK/2pfs),通过... 本研究根据已经发表的布氏杆菌基因序列,选择种间序列极为保守的保护性抗原L7/L12、OMP31基因,依此进行PCR扩增,利用引物上设计好的限制性内切酶酶切位点进行基因重组,构建了PME290-SDLOmp高效表达载体,并转化绿脓杆菌(PAK/2pfs),通过培养得到了表达产物,对表达产物进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定,结果符合预期。本项研究为进一步开展布氏杆菌亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 布氏杆菌 基因重组 表达载体构建 融合蛋白

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小鼠β防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌作用的初步研究 被引量：2

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作者 江滟 王保宁 +4 位作者 杨晓芳 李婉宜 刘冯欢 蒋忠华 李明远 《西部医学》 2009年第7期1091-1094,共4页

目的构建小鼠β防御素3(mouseβdefensin3,mBD3)基因的原核表达载体pET-32a(+)/mBD3,诱导mBD3融合蛋白在大肠杆菌中的表达,并融合蛋白的抗菌活性。方法运用PCR技术从质粒pcDNA3.1(+)/mBD3中扩增mBD3基因片段,将该片段插入pET-32a(+)原... 目的构建小鼠β防御素3(mouseβdefensin3,mBD3)基因的原核表达载体pET-32a(+)/mBD3,诱导mBD3融合蛋白在大肠杆菌中的表达,并融合蛋白的抗菌活性。方法运用PCR技术从质粒pcDNA3.1(+)/mBD3中扩增mBD3基因片段,将该片段插入pET-32a(+)原核表达载体,并对构建的重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami(2),用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE和Western Blot鉴定融合蛋白。通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,用微量液体稀释法测定融合蛋白鼠β防御素3(f mBD3)的抗菌活性。结果mBD3的原核表达载体pET-32a(+)/mBD3构建成功,在大肠杆菌中表达出fmBD3并提取获得纯化的融合蛋白。fmBD3对单细胞真菌具有较好的抑制和杀灭作用,可抑制革兰阳性菌的生长,而对革兰阴性菌无作用。结论构建的原核表达载体在大肠杆菌中成功表达fmBD3,该融合蛋白显示出较强的杀真菌作用和一定的抗细菌作用,为进一步研究鼠防御素的抗微生物活性奠定了实验基础。 展开更多

关键词 鼠β防御素3 原核表达 融合蛋白 抗菌作用

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survivin蛋白的原核高效、可溶性表达及其抗体在恶性肿瘤早期诊断中的应用

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作者 吴素香 马骢 +3 位作者 郭建巍 黎卫平 孔路科 魏杰 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第17期1641-1643,共3页

目的实现重组survivin在大肠杆菌中的高效、可溶性表达,检测健康人和肿瘤患者血清中anti-survivin并探讨其在肿瘤早期诊断中的应用价值。方法重组PET32a-survivin质粒转化BL21感受态细胞,IPTG诱导表达8h后对表达产物行溶菌酶处理、冻融... 目的实现重组survivin在大肠杆菌中的高效、可溶性表达,检测健康人和肿瘤患者血清中anti-survivin并探讨其在肿瘤早期诊断中的应用价值。方法重组PET32a-survivin质粒转化BL21感受态细胞,IPTG诱导表达8h后对表达产物行溶菌酶处理、冻融及超声处理,SDS-PAGE及Westernblot鉴定后用镍离子金属螯合层析柱纯化。建立基于重组融合蛋白的survivin特异性抗体的检测方法,对300份健康血清、144份肿瘤血清anti-survivin进行了检测,并将anti-sur-vivin与肝癌、肠癌、胰腺癌、卵巢癌患者中AFP、CEA、CA199、CA125等肿瘤标志物进行了联合分析。结果重组survivin融合蛋白在BL21中获得了高效、可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的30%。建立了检测survivin抗体的间接ELISA方法,anti-survivin在不同的肿瘤血清中均有表达,阳性率各不相同。结论成功的实现了survivin蛋白在大肠杆菌中的高效、可溶性表达;结果提示在肿瘤的辅助诊断中,anti-survivin与现有的肿瘤标志物CA199、CEA、CA-199和CA-125联合检测,可以互相补充其不足,提高肿瘤的诊断率。 展开更多

关键词 生存素 生存素抗体 酶联免疫吸附实验 重组融合蛋白

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猪囊尾蚴重组体的培养及其诱导表达 被引量：1

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作者 王敏 徐之杰 +3 位作者 李雅杰 王光岳 孙树汉 郭瀛军 《哈尔滨医科大学学报》 CAS 1998年第1期15-17,共3页

将猪囊尾蚴λｇｔ１１重组体转染ＥｃｏｌｉＹ１０９０并经ＩＰＴＧ诱导表达融合蛋白（ＦＰ），观察重组体数量、培养时间及ＩＰＴＧ浓度对ＦＰ产量的影响，结果表明，重组噬菌体数量及培养时间对ＦＰ制备有较大影响，ＩＰＴＧ的浓度对... 将猪囊尾蚴λｇｔ１１重组体转染ＥｃｏｌｉＹ１０９０并经ＩＰＴＧ诱导表达融合蛋白（ＦＰ），观察重组体数量、培养时间及ＩＰＴＧ浓度对ＦＰ产量的影响，结果表明，重组噬菌体数量及培养时间对ＦＰ制备有较大影响，ＩＰＴＧ的浓度对ＦＰ制备有调节作用。单克隆ＦＰ经简化－Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ（ＳＷＢ）检测，λＣＣ２检出率最高，为７３．３％；４个克隆以等比联合应用（λＣＭ），其检出率为８６．７％，高于单克隆ＦＰ的检测结果，应用λＣＣ２及λＣＭ检测其特异性均为１００％。 展开更多

关键词 猪囊尾蚴 基因 重组 融合蛋白 培养 表达 囊虫病

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HEV ORF2截短融合蛋白的原核表达及其免疫原性

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作者 周永飞 乔宏雷 +7 位作者 赵丹莹 唐剑光 常东英 韩顺子 常军亮 张健 刘玉林 曹玉锋 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2020年第8期880-884,889,共6页

目的原核表达3型戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)第2个开放阅读框(open reading frame 2,ORF2)截短融合蛋白(HEV3-179-Fe),并检测其免疫原性。方法分别扩增HEV3-179和Fe蛋白基因片段,经Overlap PCR法连接并扩增,克隆至载体pET-28a... 目的原核表达3型戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)第2个开放阅读框(open reading frame 2,ORF2)截短融合蛋白(HEV3-179-Fe),并检测其免疫原性。方法分别扩增HEV3-179和Fe蛋白基因片段,经Overlap PCR法连接并扩增,克隆至载体pET-28a,构建重组表达质粒pET-28a-HEV179-Fe,将其转化感受态E.coli BL21(DE3),取阳性菌株,IPTG诱导表达融合蛋白HEV3-179-Fe,进行10%SDS-PAGE分析。目的蛋白经镍离子金属鳌合亲和层析纯化后,加入硫酸铵进行病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)重构,置电镜下观察。HEV3-179-Fe蛋白VLPs与氢氧化铝佐剂吸附后免疫小鼠,ELISA法测定效价,以评价HEV ORF2截短融合蛋白的免疫原性。结果重组表达质粒pET-28a-HEV3-179-Fe构建正确。目的蛋白HEV3-179-Fe相对分子质量约40000,主要以包涵体形式存在,表达量均达35%以上,纯度约95%,可与鼠抗HEV 3多抗发生特异性反应。硫酸铵重构后于电镜下可见直径约20 nm的VLPs,其免疫小鼠的血清效价达1∶4800000以上。结论原核表达了HEV3-179-Fe,且在小鼠体内具有较好的免疫原性。本实验为以HEV ORF2-179蛋白为基础的VLPs基因工程疫苗的研发奠定了基础。 展开更多

关键词 戊型肝炎病毒 基因重组 原核表达 截短融合蛋白 Fe蛋白 免疫原性

原文传递

人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxAIκBα融合蛋白的制备

16

作者 陈海锋 程远 +1 位作者 黄爱龙 刘冰榕 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期358-361,共4页

目的　利用基因重组技术构建人IκBα基因原核表达质粒 ,制备TrxA IκBα融合蛋白 ,以便进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体。方法　以重组质粒pGEM T IκBα为模板 ,利用PCR方法扩增出带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的人IκBα基... 目的　利用基因重组技术构建人IκBα基因原核表达质粒 ,制备TrxA IκBα融合蛋白 ,以便进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体。方法　以重组质粒pGEM T IκBα为模板 ,利用PCR方法扩增出带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的人IκBα基因cDNA ,经相应酶切后插入原核表达载体pET 32a(+)。重组表达质粒pET32a(+) IκBα转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导表达TrxA IκBα融合蛋白。Westernblot试验鉴定表达蛋白。超声波破菌后采用Ni NTA树脂对TrxA IκBα融合蛋白进行纯化。结果　酶切鉴定证实人IκBα基因cDNA已插入原核表达载体pET 32a(+)。重组表达质粒pET32a(+) IκBα在大肠杆菌BL2 1(DE3)中成功地表达了TrxA IκBα融合蛋白 ,其相对分子质量(Mr)约为 5 6× 10 3 ,表达量约占细菌总蛋白的 2 5 %。Westernblot试验显示TrxA IκBα融合蛋白与兔抗IκBα多克隆抗体呈特异性免疫反应。经Ni NTA树脂纯化后 ,TrxA IκBα融合蛋白的纯度可高达 95 %以上。结论　人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxA IκBα融合蛋白的制备为进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体奠定了物质基础。 展开更多

关键词 IκBα基因 TrxA/IκBα融合蛋白 基因重组 原核表达 抗体制备 免疫检测

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人体铜伴侣蛋白Atox1在大肠杆菌中的表达

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作者 张雪峰 高旭 +3 位作者 尹珅 周虹 Narindrasorasak S Sarkar B 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2001年第5期471-473,共3页

利用PCR技术扩增出人体转铜伴侣蛋白Atox1的cDNA片段 ,直接克隆到PCRII载体上 ,经DNA序列测定后 ,再插入到谷胱甘肽巯基转移酶 (GST)融合表达载体PGEX 6p 2上 ,构成重组表达质粒PGEA ,将此质粒导入大肠杆菌 ,经IPTG诱导后获得PGEA融合... 利用PCR技术扩增出人体转铜伴侣蛋白Atox1的cDNA片段 ,直接克隆到PCRII载体上 ,经DNA序列测定后 ,再插入到谷胱甘肽巯基转移酶 (GST)融合表达载体PGEX 6p 2上 ,构成重组表达质粒PGEA ,将此质粒导入大肠杆菌 ,经IPTG诱导后获得PGEA融合蛋白的表达 表达的融合蛋白经亲和层析。 展开更多

关键词 转铜伴侣 基因重组 亲和层析 融合蛋白 大肠杆菌 表达

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主动免疫猪活化素重组融合蛋白疫苗对巴马小型猪生长性能的影响研究

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作者 冯雪萍 兰干球 +5 位作者 郭亚芬 陈江伟 阮志华 易德桥 范晶 李柏 《广西农业科学》 CAS CSCD 2009年第7期906-910,共5页

以含有巴马小型猪活化素成熟肽基因的重组质粒pRSETA-ACTA和pRSETA-ACTB的重组融合蛋白疫苗,对60日龄的巴马小型猪进行免疫,以探讨活化素免疫调控动物生长性能的作用机理。结果表明:主动免疫重组融合蛋白疫苗ACTA对巴马小型猪的日增重... 以含有巴马小型猪活化素成熟肽基因的重组质粒pRSETA-ACTA和pRSETA-ACTB的重组融合蛋白疫苗,对60日龄的巴马小型猪进行免疫,以探讨活化素免疫调控动物生长性能的作用机理。结果表明:主动免疫重组融合蛋白疫苗ACTA对巴马小型猪的日增重无显著影响(P>0.05);而主动免疫重组融合蛋白疫苗ACTB后1～28d、29～56d、1～56d,试验组日增重比对照组分别提高了5.3%(P>0.05)、17.4%(P<0.05)和14.2%(P<0.05)。ELISA检测结果发现,试验猪主动免疫ACTA或ACTB重组融合蛋白疫苗后均能显著产生抗活化素抗体(P<0.05);主动免疫ACTB重组融合蛋白疫苗极显著地提高了血清中卵泡抑制素(FS)的浓度(P<0.01)。可见,该研究制备的ACTB重组融合蛋白疫苗可有效促进巴马小型生长猪的生长、提高血清中FS的浓度。 展开更多

关键词 活化素 重组融合蛋白 巴马小型猪 主动免疫 生长性能

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Nono蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备 被引量：1

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作者 林玲 杨晓敏 +1 位作者 吕京澴 韩晓 《医学分子生物学杂志》 CAS CSCD 2007年第5期375-379,共5页

目的表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Nono(non-POU-domain-containing,octamer-bindingprotein)融合蛋白并制备抗Nono多克隆抗体。方法构建pET-28a(+)-Nono重组表达质粒,转入Rosetta(DE3)大肠埃希菌,以IPTG诱导6×His-Non... 目的表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Nono(non-POU-domain-containing,octamer-bindingprotein)融合蛋白并制备抗Nono多克隆抗体。方法构建pET-28a(+)-Nono重组表达质粒,转入Rosetta(DE3)大肠埃希菌,以IPTG诱导6×His-Nono融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫BALB/C小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-Nono融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫小鼠,获得了高特异性的抗Nono抗血清。结论成功构建pET-28a(+)-Nono原核表达质粒,表达并纯化出高纯度的目标蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体。 展开更多

关键词 COX-2基因 基因重组 融合蛋白 多克隆抗体

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新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的表达优化 被引量：1

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作者 关海容 孙玉英 +6 位作者 袁志宏 张惠丽 梁飞 刘楠 郭斯启 习彩霞 奚永志 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2005年第4期321-324,358,共5页

目的:我们所研创的pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21pLysE工程菌通常情况下更多的是以包涵体形式为主,而少部分为可溶形式,本研究试图在不改变其结构而仅通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素而获得稳定、高效的几乎全部以可溶性形式... 目的:我们所研创的pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21pLysE工程菌通常情况下更多的是以包涵体形式为主,而少部分为可溶形式,本研究试图在不改变其结构而仅通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素而获得稳定、高效的几乎全部以可溶性形式表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白。方法:针对更换不同的培养基、降低或升高诱导温度、增加或减少IPTG的用量、延长或缩短诱导时间等诸多能够增加可溶性表达量的各种因素进行较为系统的探索。结果:该工程菌在无压力选择条件下传代50代后的表达稳定性约为60%;通过大量对比研究,我们最终确定了pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21pLysE菌种的最佳培养诱导表达方案:即过夜活化的菌种以2%浓度接种于2YT培养基,22℃培养至D值约为0.4时加入0.1mmol/LIPTG,诱导12h,由此可获得较高水平的、稳定的、几乎全部为可溶性表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白,目的蛋白量占菌体总蛋白的≥24%。结论:通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素,获得了稳定、高效的几乎全部以可溶性形式表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的工程菌,为进一步有效分离纯化该蛋白奠定了基础。 展开更多

关键词 重组外毒素融合蛋白 B7-2-PE40KDEL 表达优化 工程菌株 免疫抑制 基因表达

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