GFP基因转染对骨髓基质细胞体内向软骨细胞分化的示踪作用 被引量：8

1

作者 周广东 王晓云 +3 位作者 刘德莉 崔磊 刘伟 曹谊林 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期27-30,共4页

目的 :实现绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)报告基因在骨髓基质细胞 (BMSC)中的高效、稳定、持久表达 ,直接示踪BMSC在关节软骨缺损内的分布及分化。方法 :构建重组逆转录病毒表达载体RV GFP ,通过PT6 7包装细胞克隆、G4 1... 目的 :实现绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)报告基因在骨髓基质细胞 (BMSC)中的高效、稳定、持久表达 ,直接示踪BMSC在关节软骨缺损内的分布及分化。方法 :构建重组逆转录病毒表达载体RV GFP ,通过PT6 7包装细胞克隆、G4 18筛选及扩增 ,获得大量含GFP基因的假病毒液 ,并直接转染BMSC。将含有GFP基因转染标记的BMSC与生物可降解材料复合后 ,植入猪自体关节软骨缺损处 ,7个月后共聚焦显微镜检测修复组织中GFP标记的BMSC的分布及分化。结果 :经双酶切鉴定证实重组逆转录病毒表达载体RV GFP构建成功 ,转染PT6 7细胞后可在荧光激发波长下 ,发出明亮的绿色荧光 ,转染率达 2 0 %～ 5 0 % ,经G4 18筛选后可达 10 0 %。筛选、扩增后 ,PT6 7细胞的上清培养液可成功地转染BMSC ,筛选后能稳定、持久、高效表达GFP。将标记的BMSC植入关节软骨缺损 7个月后 ,修复组织仍能高效表达GFP ,激光共聚焦显微镜下显示 ,多数新生软骨陷窝内有GFP标记的细胞。结论 :构建的重组逆转录病毒GFP载体 ,能持久标记骨髓基质细胞 ,用于细胞动态变化的研究及细胞转归的示踪 ,该方法简便、灵敏、可靠、直观。标记的BMSC可在关节软骨缺损内分化为成熟的软骨细胞 。 展开更多

关键词 重组逆转录病毒载体 绿色荧光蛋白 骨髓基质细胞 软骨形成

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绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建及其表达 被引量：7

2

作者 刘德莉 胡晓洁 +2 位作者 吴娟娟 刘伟 曹谊林 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期424-425,438,共3页

目的　实现绿色荧光蛋白 (GFP)报告基因在组织工程化细胞中的高效、稳定、长久表达。方法　构建重组逆转录病毒表达载体RV GFP ,通过PT6 7包装细胞克隆 ,经G418筛选、扩增 ,获得大量含GFP基因的病毒液 ,并直接感染靶细胞。结果　转染细... 目的　实现绿色荧光蛋白 (GFP)报告基因在组织工程化细胞中的高效、稳定、长久表达。方法　构建重组逆转录病毒表达载体RV GFP ,通过PT6 7包装细胞克隆 ,经G418筛选、扩增 ,获得大量含GFP基因的病毒液 ,并直接感染靶细胞。结果　转染细胞于 48h后 ,在荧光显微镜蓝光激发波长下 ,可发出明亮的绿色荧光 ,转染率达 2 0 %～5 0 %。感染靶细胞内GFP的有效表达可维持 2个月。结论　构建的重组逆转录病毒GFP载体 ,可作为组织工程化细胞标记 ,用于细胞动态研究 ,其方法简便、灵敏。 展开更多

关键词 重组逆转录病毒载体 绿色荧光蛋白 细胞标记 GFP

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应用GFP标记技术示踪裸鼠体内组织工程化骨的形成 被引量：4

3

作者 袁捷 刘德莉 +4 位作者 周广东 苗春雷 崔磊 刘伟 曹谊林 《上海第二医科大学学报》 CSCD 2004年第4期235-237,266,共4页

目的 应用绿色荧光蛋白(GFP)标记技术,观察组织工程化骨体内形成过程中种子细胞的变化与转归。方法 用GFP重组逆转录病毒载体(GFP-RV)转染犬骨髓基质干细胞(BMSCs),将其接种于β-磷酸三钙(β-TCP),形成细胞一材料复合物,移植于裸鼠皮下... 目的 应用绿色荧光蛋白(GFP)标记技术,观察组织工程化骨体内形成过程中种子细胞的变化与转归。方法 用GFP重组逆转录病毒载体(GFP-RV)转染犬骨髓基质干细胞(BMSCs),将其接种于β-磷酸三钙(β-TCP),形成细胞一材料复合物,移植于裸鼠皮下。术后8周,HE染色观察组织结构,碱性磷酸酶(AKP)染色和骨钙素(OCN)免疫组化检测功能蛋白,激光共聚焦显微镜下对GFP进行示踪观察。结果 8周后,大体可见组织工程化新骨形成,组织学示新生骨小梁围绕材料孔隙生成,AKP染色和OCN免疫组化结果阳性,并可见新生组织内有呈绿色的GFP标记细胞,β-TCP部分降解。结论组织工程化骨组织学结构与松质骨小梁类似。新生组织表达GFP,证实组织工程化骨组织的形成来源于供体细胞。 展开更多

关键词 绿色荧光蛋白标记技术 组织工程 骨组织 重组逆转录病毒载体 Β-磷酸三钙 供体细胞

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转基因人肝癌细胞株(BEL 7404/TNF)的建立及其生物活性的初步研究 被引量：3

4

作者 邱庆明 陆云飞 《广西医科大学学报》 CAS 1999年第4期408-409,共2页

目的 :研究转基因肝癌细胞和其来源肝癌细胞株的生物学特性的差异。方法 :构建含人肿瘤坏死因子α基因 ( TNFα基因 )的重组逆转录病毒载体 ,将其导入人肝癌细胞株 BEL 74 0 4。通过 MTT比色法测定比较转基因肝癌细胞株及未转基因肝癌... 目的 :研究转基因肝癌细胞和其来源肝癌细胞株的生物学特性的差异。方法 :构建含人肿瘤坏死因子α基因 ( TNFα基因 )的重组逆转录病毒载体 ,将其导入人肝癌细胞株 BEL 74 0 4。通过 MTT比色法测定比较转基因肝癌细胞株及未转基因肝癌细胞株的生物活性。结果 :成功建立转基因肝癌细胞株。MTT比色法测定结果表明转基因的肝癌细胞株生长速度显著减慢。结论 :TNF基因转入肝癌细胞后 。 展开更多

关键词 逆转录病毒载体 TNF基因 MTT比色法 肝肿瘤

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骨形成蛋白-7基因逆转录病毒载体的构建及其表达 被引量：3

5

作者 祝联 刘伟 +5 位作者 陈兵 刘德莉 刘方军 吴娟娟 陆俊弘 曹谊林 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期329-331,共3页

目的 :实现骨形成蛋白 7(BMP 7)基因在骨髓基质干细胞中的稳定、长久表达。方法 :构建重组BMP 7逆转录病毒表达载体。通过PT6 7包装细胞克隆 ,嘌呤霉素筛选、扩增 ,获得含BMP 7基因的逆转录病毒液 ,直接感染骨髓基质干细胞 ,用免疫组化... 目的 :实现骨形成蛋白 7(BMP 7)基因在骨髓基质干细胞中的稳定、长久表达。方法 :构建重组BMP 7逆转录病毒表达载体。通过PT6 7包装细胞克隆 ,嘌呤霉素筛选、扩增 ,获得含BMP 7基因的逆转录病毒液 ,直接感染骨髓基质干细胞 ,用免疫组化方法检测BMP 7的表达。结果 :成功地构建了重组BMP 7逆转录病毒表达载体 ,并可在骨髓基质干细胞中表达BMP 7。结论 :重组逆转录病毒表达载体转染的靶细胞可表达BMP 7,为组织工程中骨和软骨种子细胞的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 重组逆转录病毒载体 骨形成蛋白—7 组织工程 骨髓基质干细胞

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pLEGFP—N1-端粒酶逆转录酶载体的构建及其表达 被引量：3

6

作者 谭挺 胡志奇 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期2108-2110,F0003,共4页

目的构建逆转录病毒载体pLEGFP—N1．端粒酶逆转录酶（TERT），并观察其在新生鼠真皮细胞中的表达。方法将聚合酶链反应（PCR）扩增出TERT全部片段，定向连接到被Hindm和Sall双酶切的质粒，经酶切测序鉴定后筛选阳性克隆。将pLEGFP-N1—... 目的构建逆转录病毒载体pLEGFP—N1．端粒酶逆转录酶（TERT），并观察其在新生鼠真皮细胞中的表达。方法将聚合酶链反应（PCR）扩增出TERT全部片段，定向连接到被Hindm和Sall双酶切的质粒，经酶切测序鉴定后筛选阳性克隆。将pLEGFP-N1—TERT质粒和PIKpackaging质粒以磷酸钙共沉淀法转染包装细胞293FT，包装产生逆转录病毒。进行病毒滴度测定后，取病毒上清感染新生鼠真皮细胞，筛选转基因细胞。比较转染前后TERT在mRNA水平的表达，端粒酶活性的变化，荧光显微镜观察细胞荧光表达。结果BamHI酶切鉴定及测序鉴定，证明pLEGFP-N1-TERT构建成功。转染后细胞稳定表达绿色荧光蛋白，并经Westernblots及免疫组织化学检测TERT高表达。结论构建的逆转录病毒表达载体pLEGFP—N1-TERT能够产生高滴度的逆转录病毒，促使外源性TERT基因转入新生鼠真皮细胞后得到高表达，为皮肤组织工程及细胞移植疗法奠定基础。 展开更多

关键词 端粒酶逆转录酶 逆转录病毒载体 真皮细胞

原文传递

嵌合跨膜型人CD55基因的重组逆病毒表达质粒的构建 被引量：1

7

作者 杜瑞琴 白云 +1 位作者 黎万玲 姜曼 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期48-51,共4页

目的　构建嵌合跨膜型CD5 5基因的重组逆病毒表达质粒。方法　采用PCR技术扩增编码CD5 5信号肽及成熟蛋白胞外区 (-3 4 -3 0 4aa)的DNA片段 ,双侧引入EcoRⅠ、SspⅠ位点 ,与编码CD46分子的跨膜区及膜内区 (2 70～ 3 5 0aa)的DNA片段的5... 目的　构建嵌合跨膜型CD5 5基因的重组逆病毒表达质粒。方法　采用PCR技术扩增编码CD5 5信号肽及成熟蛋白胞外区 (-3 4 -3 0 4aa)的DNA片段 ,双侧引入EcoRⅠ、SspⅠ位点 ,与编码CD46分子的跨膜区及膜内区 (2 70～ 3 5 0aa)的DNA片段的5’末端自身的StuI位点连接 ,构建嵌合跨膜型CD5 5DNA片段 ,序列测定后将此嵌合CD5 5片段与pLXSN逆病毒载体连接构建重组表达质粒 ,酶切鉴定插入片段的方向。结果　DNA序列测定证实所构建的嵌合跨膜型CD5DNA阅读框完整、连接部位序列正确 ;HindⅢ酶切鉴定得到了正向插入的CD5 5TM pLXSN重组表达质粒。结论　我们成功构建了嵌合跨膜型CD5 5DNA片段及含此片段的重组逆病毒表达载体CD5 5TM pLXSN ,为进一步在真核细胞中表达嵌合分子 ,比较研究GPI锚固型CD5 5分子与细胞活化信号转导的关系建立良好对照并为应用跨膜型的CD5 5分子对PNH进行基因治疗奠定了分子生物学基础。 展开更多

关键词 嵌合跨膜型分子 重组逆转录病毒表达载体 CD55基因 质粒

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人BDNF重组逆转录病毒载体的构建 被引量：1

8

作者 阳运康 林月秋 +1 位作者 汤逊 蔡培强 《中国骨肿瘤骨病》 2005年第4期224-227,共4页

目的构建PLEGFP—BDNF真核表达重组逆转录病毒,为进一步在细胞中表达及移植治疗作准备。方法按照hBDNF基因全长编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出744bp的hBDNF基因片段,插入到PMD18-T载体上,转化DH5α大肠杆菌菌株,获得PMD18T... 目的构建PLEGFP—BDNF真核表达重组逆转录病毒,为进一步在细胞中表达及移植治疗作准备。方法按照hBDNF基因全长编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出744bp的hBDNF基因片段,插入到PMD18-T载体上,转化DH5α大肠杆菌菌株,获得PMD18T—BDNF克隆,对该克隆进行限制性酶切分析和DNA序列测定;从阳性克隆中获取hBDNF全长编码片段,与真核表达载体PLEGFP质粒连接,构建PLEGFP—BDNF真核表达重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌JM109,再经氨苄LB培养基筛选,酶切,PCR与测序鉴定。结果PLEGFP—BDNF重组逆转录病毒构建成功。结论hBDNF在大肠杆菌中的成功表达在转基因治疗CNS病变方面具有潜在应用价值。 展开更多

关键词 HBDNF 基因克隆 重组逆转录病毒载体 质粒 BDNF基因 真核表达重组质粒 限制性酶切分析 全长编码序列 大肠杆菌菌株 真核表达载体

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转基因饲养层细胞体外促进脐带血CD34^+ HSPC增殖

9

作者 胡志清 杨吉成 +5 位作者 盛伟华 井莹莹 苗莉 张日 朱南康 缪竞诚 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2009年第9期911-915,共5页

目的构建转hOSM基因细胞系作为饲养层细胞,观察其对脐带血CD34+HSPC的扩增作用。方法用分子生物学技术建立转hOSM基因细胞系作为饲养层细胞,免疫磁珠法分离脐带血CD34+HSPC,将其与饲养层细胞共培养7 d后,流式细胞术检测其增殖,将扩增后... 目的构建转hOSM基因细胞系作为饲养层细胞,观察其对脐带血CD34+HSPC的扩增作用。方法用分子生物学技术建立转hOSM基因细胞系作为饲养层细胞,免疫磁珠法分离脐带血CD34+HSPC,将其与饲养层细胞共培养7 d后,流式细胞术检测其增殖,将扩增后染色的CD34+细胞移植入SC ID小鼠体内,应用荧光显微镜和RT-PCR法观察移植效果。结果CD34+HSPC与饲养层细胞共培养后扩增了9.4倍,其表面归巢相关分子CXCR4和CD54阳性率仍较高,植入小鼠体内4周后,可成功归巢到小鼠骨髓。结论建立的转hOSM基因饲养层细胞可以有效地扩增CD34+HSPC,并维持其较高的移植效率和造血活性。 展开更多

关键词 人抑瘤素M 反转录病毒载体 造血干/祖细胞 重度联合免疫缺陷病小鼠

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重组逆转录病毒载体系统的建立及其感染滴度的研究

10

作者 王凤阳 扈荣良 +2 位作者 殷震 赵宝全 池海英 《延边大学农学学报》 2000年第4期283-286,共4页

选择新霉素磷酸转移酶II(NeoR)做为标记基因 ,将重组逆转录病毒载体经包装细胞包装后得到的重组病毒浓缩后 ,应用该重组逆转录病毒载体系统体外感染靶细胞NIH3T3以测定其滴度 ,其滴度可达到 1 0 6。

关键词 重组逆转录病毒载体系统 感染 靶细胞

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口蹄疫病毒P12A和3C基因重组逆转录病毒表达载体的构建 被引量：8

11

作者 刘艳红 李炯 +3 位作者 刘俊林 刘湘涛 尚佑军 殷宏 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期606-610,共5页

以A型口蹄疫病毒(FMDV)AV88(L)和XJ99株的P12X基因和AV88(L)3C基因的阳性克隆质粒为模板,用PCR扩增各基因片段,酶切后分步定向亚克隆至逆转录病毒表达载体pBABE-puro上经PCR、酶切鉴定及测序。结果表明,获得了2个含不同RGD基序的A型FMD... 以A型口蹄疫病毒(FMDV)AV88(L)和XJ99株的P12X基因和AV88(L)3C基因的阳性克隆质粒为模板,用PCR扩增各基因片段,酶切后分步定向亚克隆至逆转录病毒表达载体pBABE-puro上经PCR、酶切鉴定及测序。结果表明,获得了2个含不同RGD基序的A型FMDV衣壳蛋白和蛋白酶基因的重组逆转录病毒表达载体pBABE-AV88(L)P1 2X3C和pBABE-XJ99 P1 2X3C,为研究安全、高效、低成本的FMDV空衣壳亚单位疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 A型口蹄疫病毒 衣壳蛋白基因 蛋白酶基因 重组逆转录病毒表达载体

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日本血吸虫卵黄铁蛋白基因的体外扩增及逆转录病毒pLXSN-Fer1重组质粒的构建 被引量：4

12

作者 周俊梅 余新炳 +2 位作者 吴忠道 郑亦男 李焱 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2000年第1期32-34,共3页

目的　构建日本血吸虫ｐＬＸＳＮ－ Ｆｅｒ１ 真核表达重组逆转录病毒，为进一步在细胞中表达及ＤＮＡ免疫作准备。方法　用ＰＣＲ技术从日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ文库中扩增编码卵黄铁蛋白（ｙｏｌｋ ｆｅｒｒｉｔｉｎ，Ｆｅｒｌ） 的基... 目的　构建日本血吸虫ｐＬＸＳＮ－ Ｆｅｒ１ 真核表达重组逆转录病毒，为进一步在细胞中表达及ＤＮＡ免疫作准备。方法　用ＰＣＲ技术从日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ文库中扩增编码卵黄铁蛋白（ｙｏｌｋ ｆｅｒｒｉｔｉｎ，Ｆｅｒｌ） 的基因片段，定向克隆入ｐＬＸＳＮ 逆转录病毒载体，然后经氨苄ＬＢ培养基筛选，酶切、ＰＣＲ鉴定。结果　从日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ文库中扩增出特异的卵黄铁蛋白的基因片段，克隆成功ｐＬＸＳＮ－ Ｆｅｒ１ 重组逆转录病毒。结论　构建成功ｐＬＸＳＮ－ Ｆｅｒ１ 重组逆转录病毒。 展开更多

关键词 日本血吸虫 卵黄铁蛋白 pLXSN-Fer1 质粒

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