实时荧光定量PCR的数据分析方法 被引量：28

1

作者 易健明 屈武斌 张成岗 《生物技术通讯》 CAS 2015年第1期140-145,共6页

实时荧光定量PCR是目前检测目的核酸拷贝数及分析靶基因在mRNA表达水平相对变化的主流技术。研究表明,分析结果的准确性依赖于数据分析方法的可靠性。我们简要综述实时荧光定量PCR的数据分析方法。

关键词 实时荧光定量pcr 绝对定量 相对定量 动力学法

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实时荧光定量PCR技术的实验研究 被引量：20

2

作者 袁继红 《现代农业科技》 2010年第13期20-22,共3页

实时荧光定量PCR技术是在普通PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术,已广泛应用于不同研究领域。论述了荧光定量PCR技术的基本原理、主要类型和定量实验方法,探讨了实验条件的控制、影响因素和优化实验结果的方法。

关键词 荧光定量pcr技术 原理 主要类型 定量方法 优化

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丙型肝炎检验方法的临床研究与分析 被引量：12

3

作者 欧慧 《中国医药科学》 2013年第13期125-126,共2页

目的回顾性分析丙型肝炎患者检验结果,探讨丙型肝炎的有效检验方法。方法对209份标本进行酶联免疫法(ELISA)检测抗-HCV和实时荧光定量PCR法(FQ-PCR)检测HCV-RNA,分析两种检测方法的有效性及差异。结果检出抗-HCV阳性138份(66.03%),HCV-... 目的回顾性分析丙型肝炎患者检验结果,探讨丙型肝炎的有效检验方法。方法对209份标本进行酶联免疫法(ELISA)检测抗-HCV和实时荧光定量PCR法(FQ-PCR)检测HCV-RNA,分析两种检测方法的有效性及差异。结果检出抗-HCV阳性138份(66.03%),HCV-RNA阳性128份(61.24%),差异无统计学意义(P>0.05)。抗-HCV与HCV-RNA均阳性者112份(53.59%),两者均阴性的55例(26.32%)。两种检测方法总符合率为79.90%(配对x2=2.3810,P>0.05)。结论 ELISA和FQ-PCR法检测HCV比较无显著差异,但二者结合检测可提高HCV检出率。 展开更多

关键词 丙型肝炎 检验 实时荧光定量pcr法 酶联免疫法

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产气荚膜梭菌TaqMan实时荧光定量PCR特异性引物设计和方法验证 被引量：1

4

作者 马嘉琦 孙波 +4 位作者 马红梅 王东 赵志军 李勇 曾瑾 《中国食品卫生杂志》 CSCD 北大核心 2024年第2期147-155,共9页

目的建立针对水样中产气荚膜梭菌检测的TaqMan实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法,并测试该方法在自来水样中的检测效果。方法选择位于该菌拟核中高度保守的plc基因,设计特异性引物和TaqMan探针,经优化后建立了针对该菌的TaqMan实时... 目的建立针对水样中产气荚膜梭菌检测的TaqMan实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法,并测试该方法在自来水样中的检测效果。方法选择位于该菌拟核中高度保守的plc基因,设计特异性引物和TaqMan探针,经优化后建立了针对该菌的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,结合滤膜法处理含有plc基因的标准菌株的模拟污染水样,并对所建立的方法进行测试。结果所建立的产气荚膜梭菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有高度的特异性,13株食源性致病菌、3株艰难梭菌及1株腐败梭菌的Ct值大于40;该方法的最低检出限为1×10 copies/μL,具有较高的灵敏性;对模拟污染水样的最低检测限为1.0×10^(2)CFU/mL。应用该方法对4份人工模拟污染阳性水样与90份自来水样进行检测发现,2份1.0×10^(2)CFU/mL的模拟污染水样可检出产气荚膜梭菌,2份1.0×10 CFU/mL的模拟污染水样与90份自来水样均未检出产气荚膜梭菌。结论所建立的产气荚膜梭菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有特异性好、灵敏性高的优点,对水体中产气荚膜梭菌的检测具有较高的应用价值。 展开更多

关键词 产气荚膜梭菌 实时荧光定量pcr TaqMan探针法 水样检测 食源性致病菌

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培干扰素α1b原液中残留DNA定量PCR检测法的验证

5

作者 李珺 薛亚慧 +3 位作者 杨宇峰 田石华 刘敏 何成 《国际生物制品学杂志》 CAS 2024年第2期85-89,共5页

目的验证聚乙二醇修饰的干扰素(培干扰素)α1b原液中残留DNA检测的实时荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)。方法提取4批培干扰素α1b原液的残留DNA,使用qPCR检测试剂盒进行扩增反应,绘制标准曲线,建立残留DNA的qPCR检测方法,对建立的... 目的验证聚乙二醇修饰的干扰素(培干扰素)α1b原液中残留DNA检测的实时荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)。方法提取4批培干扰素α1b原液的残留DNA,使用qPCR检测试剂盒进行扩增反应,绘制标准曲线,建立残留DNA的qPCR检测方法,对建立的方法进行线性、重复性、准确性、精密度、定量限和耐用性的验证,并与探针杂交法进行比较。结果qPCR检测在300 pg/μl~30 fg/μl浓度范围内线性关系良好。6次检测相对标准偏差为7.45%;加标回收率为95.67%~129.28%;不同人员检测相对标准偏差小于30%;定量限为30 fg/μl。不同孵育温度条件下检测结果无明显差异,耐用性良好。探针杂交法与qPCR的检测结果均小于中国药典2020年版规定的10 ng/剂。结论qPCR检测培干扰素α1b原液中DNA残留具有良好的线性、重复性、准确性、精密度和耐用性,适用于该项检测。 展开更多

关键词 实时荧光定量聚合酶链反应 残留DNA 探针杂交法 方法验证 质量控制

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实时荧光定量PCR检测转基因玉米Bt176测量不确定度分析 被引量：3

6

作者 熊娟 黄启红 +4 位作者 伍玲燕 蔡大川 张志军 黄璇莹 陈敏儿 《安徽农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期119-123,共5页

应用实时定量PCR方法测定样品中转基因玉米Bt176的含量,并从多个方面来分析测量的不确定度。结果显示,A类不确定度为0.0003,B类不确定度为0.0007,合成不确定度为0.001,有效自由度veff为272,包含概率P为95%,扩展不确定度U=0.002,测量结果... 应用实时定量PCR方法测定样品中转基因玉米Bt176的含量,并从多个方面来分析测量的不确定度。结果显示,A类不确定度为0.0003,B类不确定度为0.0007,合成不确定度为0.001,有效自由度veff为272,包含概率P为95%,扩展不确定度U=0.002,测量结果为(0.8±0.2)%。不确定度评估结果表明,测量不确定度的主要来源是微量液体转移量的偏差。 展开更多

关键词 转基因玉米Bt176 实时荧光定量pcr 定量检测 不确定度评估

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基于实时荧光定量PCR筛选巨菌草内参基因 被引量：3

7

作者 李苏涛 李妍 +6 位作者 张磊 陈思齐 韩雪林 张娟 苏德伟 罗海凌 周晶 《草业科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期907-921,共15页

以巨菌草(Pennisetum giganteum)的叶片、茎、根为试验材料,通过分析8个基因18s rRNA、Actin、GAPDH、ACTB、EF-1α、UBQ、CYP、TUB在正常生长、干旱以及盐碱胁迫下荧光定量PCR中稳定性表达情况,筛选巨菌草的稳定内参基因。利用geNorm、... 以巨菌草(Pennisetum giganteum)的叶片、茎、根为试验材料,通过分析8个基因18s rRNA、Actin、GAPDH、ACTB、EF-1α、UBQ、CYP、TUB在正常生长、干旱以及盐碱胁迫下荧光定量PCR中稳定性表达情况,筛选巨菌草的稳定内参基因。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件计算内参基因的表达稳定值并进行排序,最终通过赋值法综合排序确定稳定内参基因。结果表明,内参基因的稳定性在不同处理下存在差异。其中,ACTB稳定性好,为本研究筛选出巨菌草的内参基因。本研究筛选出的内参基因,为后续巨菌草功能基因表达分析奠定了基础。 展开更多

关键词 巨菌草 实时荧光定量pcr 内参基因 稳定性评价 干旱胁迫 盐碱胁迫 赋值法综合排序

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寨卡病毒核酸实时荧光PCR超敏检测方法的建立 被引量：3

8

作者 杨丽琼 刘晓 +1 位作者 张姚 叶敏 《生物技术》 CAS 2021年第5期444-448,共5页

[目的]建立寨卡病毒核酸实时荧光定量PCR超敏检测方法。[方法]选取寨卡病毒基因NS5片段保守序列设计寨卡病毒特异性引物和探针,体外转录建立寨卡病毒标准品(1×10^(1)~1×10^(8)拷贝/μL);以寨卡病毒标准品为模板,对反应体系探... [目的]建立寨卡病毒核酸实时荧光定量PCR超敏检测方法。[方法]选取寨卡病毒基因NS5片段保守序列设计寨卡病毒特异性引物和探针,体外转录建立寨卡病毒标准品(1×10^(1)~1×10^(8)拷贝/μL);以寨卡病毒标准品为模板,对反应体系探针浓度、退火温度和反应时间进行优化;以标准品为模板,建立标准曲线,并确定检测灵敏度;使用登革病毒、黄热病毒等对该方法进行特异性评估;以1×10^(8)~1×10^(4)拷贝/μL标准品为模板,评估该方法组间和组内重复性。[结果]实时荧光定量PCR反应的探针浓度分别为0.3μmol/L,PCR扩增的反应温度为59℃,反应时间为45 s;标准曲线为:y=-3.1766x+40.224(R^(2)=0.999 9),敏感度为10^(1)拷贝;该方法对登革病毒、黄热病度、基孔肯雅病毒、乙型脑炎病毒、流感病毒未见扩增;该方法组内和组间重复性均小于2%,重复性良好。[结论]成功建立了一种寨卡病毒实时荧光定量PCR检测方法,灵敏度为10;拷贝,对登革病毒、黄热病毒等未见扩增,组间和组内重复性均小于2%。 展开更多

关键词 寨卡病毒 实时荧光定量pcr 检测方法 灵敏度 特异性 重复性

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流感病毒检测中细胞培养法与实时荧光定量PCR法效果比较 被引量：2

9

作者 王颖 《医学信息》 2021年第9期179-181,共3页

目的分析流感病毒检测中细胞培养法与实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法的应用效果。方法选取2018年10月~2020年10月我中心604例疑似流感样本为研究对象,分别通过细胞培养法和实时荧光定量PCR法进行检测,比较检测结果。结果实时荧光定量... 目的分析流感病毒检测中细胞培养法与实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法的应用效果。方法选取2018年10月~2020年10月我中心604例疑似流感样本为研究对象,分别通过细胞培养法和实时荧光定量PCR法进行检测,比较检测结果。结果实时荧光定量PCR法阳性率为26.49%,高于细胞培养法的12.58%,差异有统计学意义(P<0.05);实时荧光定量PCR阳性样本分离率为37.50%,高于阴性样本分离率的3.60%,差异有统计学意义(P<0.05);以细胞培养法为金标准,实时荧光定量PCR法检测灵敏度为90.79%,特异度为98.42%。结论实时荧光定量PCR法检测流感病毒的应用价值较高,具有检测速度快、灵敏度高、特异性强等优势,可用于应急检测、常规检测等。细胞培养能够获取毒株,有利于进一步对病毒抗原性、基因特性以及耐药性的研究。 展开更多

关键词 流感病毒检测 细胞培养法 实时荧光定量pcr法

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基于微生物学的速食食品致病菌检验研究 被引量：2

10

作者 王辉 张亮 周美静 《粘接》 CAS 2022年第4期84-87,共4页

分析基于微生物学的速食食品致病菌检验检测结果,总结相应的检验方法。采用传统细菌分离培养法和实时荧光定量PCR法进行检验。对两种检验方法下的致病菌阳性检出情况进行统计,计算出总阳性率。并对两组检验所耗费的时间进行记录,计算出... 分析基于微生物学的速食食品致病菌检验检测结果,总结相应的检验方法。采用传统细菌分离培养法和实时荧光定量PCR法进行检验。对两种检验方法下的致病菌阳性检出情况进行统计,计算出总阳性率。并对两组检验所耗费的时间进行记录,计算出平均用时结果。经统计与组间比较,实时荧光定量PCR法的样本阳性检出率为11.00%,较传统细菌分离培养法的8.00%明显较高,P<0.05。对比不同检验方法下的用时情况,可得实时荧光定量PCR法的平均用时为(2.35±0.12)h,明显短于传统细菌分离培养法的(37.35±0.15)h,P<0.05。基于微生物学的速食食品致病菌检验检过程中应用不同的检验方法均能获得一定的检验结果,其中实时荧光定量PCR法的检验效果更为理想。 展开更多

关键词 速食食品 致病菌 检验 实时荧光定量pcr法 传统细菌分离培养法

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水貂阿留申病毒VP2基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：2

11

作者 闫文卓 陆涛峰 +2 位作者 周洁 赵丽丽 陈洪岩 《实验动物与比较医学》 CAS 2020年第4期289-295,共7页

目的建立一种方便、灵敏的水貂阿留申病毒(AMDV)荧光定量PCR检测方法,从而实现临床样品中AMDV的快速定量检测。方法根据AMDV的结构蛋白VP2的基因保守区域设计一对特异性引物和探针,优化PCR反应条件,建立TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,... 目的建立一种方便、灵敏的水貂阿留申病毒(AMDV)荧光定量PCR检测方法,从而实现临床样品中AMDV的快速定量检测。方法根据AMDV的结构蛋白VP2的基因保守区域设计一对特异性引物和探针,优化PCR反应条件,建立TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,绘制标准曲线,并进行特异性、敏感性和稳定性分析。结果建立的标准曲线在1.0×10^2拷贝/μL至1.0×10^8拷贝/μL之间具有良好的线性关系,相关系数(r^2)大于0.994。该方法检测的灵敏度为10^2拷贝/μL,且与犬细小病毒、犬腺病毒、犬瘟热病毒和水貂病毒性肠炎病毒均无明显交叉反应,特异性良好。重复性试验结果显示,该方法的组内和组间变异系数均小于3%,重复性良好。利用该方法对417份临床组织样品进行检测的结果显示,中国部分地区的AMDV阳性率为81.5%。结论本研究建立了一种重复性、特异性和敏感性良好的AMDV荧光定量PCR检测方法,可用于AMDV的临床检测和流行病学调查。 展开更多

关键词 水貂阿留申病 水貂阿留申病毒 实时荧光定量pcr VP2 检测方法

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EvaGreen实时荧光定量PCR检测H3N8亚型马流感病毒方法的建立 被引量：1

12

作者 朱超 郭巍 +4 位作者 胡哲 赵钊 刘彦辰 王晓钧 曲娟娟 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第9期29-32,共4页

为了特异性地检测H3N8亚型马流感病毒,试验根据H3N8亚型马流感病毒(EIV)HA基因特异保守序列设计1对引物,建立了检测H3N8亚型EIV的Eva Green实时荧光定量PCR方法,并对该方法进行评价。结果表明:该方法能特异性地扩增H3N8亚型EIV,而对H7N... 为了特异性地检测H3N8亚型马流感病毒,试验根据H3N8亚型马流感病毒(EIV)HA基因特异保守序列设计1对引物,建立了检测H3N8亚型EIV的Eva Green实时荧光定量PCR方法,并对该方法进行评价。结果表明:该方法能特异性地扩增H3N8亚型EIV,而对H7N7亚型EIV、马传染性贫血病毒、马动脉炎病毒、马疱疹病毒均无特异性反应;最低检测限度能达到10拷贝/μL;并且该方法具有良好的重复性。说明Eva Green这种新型荧光染料可以敏感有效地检测EIV,可用于马流感的诊断。 展开更多

关键词 H3N8亚型马流感病毒 EvaGreen实时荧光定量pcr 方法 建立

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鹅圆环病毒TB Green实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用 被引量：1

13

作者 赵敏 李家玉 +1 位作者 黄瑜 万春和 《福建畜牧兽医》 2022年第4期26-30,共5页

鹅圆环病毒主要感染宿主的淋巴细胞,导致其免疫功能下降,造成继发感染和共感染。为建立鹅圆环病毒分子检测方法,本研究根据NCBI数据库中GoCV基因特征,设计特异性引物,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法。结果显示,建立检测GoCV... 鹅圆环病毒主要感染宿主的淋巴细胞,导致其免疫功能下降,造成继发感染和共感染。为建立鹅圆环病毒分子检测方法,本研究根据NCBI数据库中GoCV基因特征,设计特异性引物,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法。结果显示,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法,灵敏度高,最低检测限为54.10拷贝/μL;特异性好,与水禽常见传染病病原均无交叉反应,扩增产物的熔解曲线仅GoCV出现1个特异性单峰,Tm值为(84.46±0.09)℃;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.26%~0.55%和0.23%~0.87%。利用建立的TB Green实时荧光定量PCR方法和常规PCR方法同时对64份临床样品进行GoCV感染的检测,结果显示,常规PCR方法检出阳性样品15份,阳性率为23.44%;TB Green实时荧光定量PCR方法检出阳性样品18份,阳性率28.13%,且15份PCR阳性样品经TB Green实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究为后续开展GoCV感染的分子流行病学调查和致病机理研究提供技术支撑。 展开更多

关键词 鹅圆环病毒 TB Green 实时荧光定量pcr方法

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实时荧光定量PCR方法实现羊肉中鸡成分的精确定量 被引量：1

14

作者 唐廷廷 陈世界 +5 位作者 张婧 杨苗 安微 王成程 韩国全 林华 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期3967-3976,共10页

近年来,世界各地肉制品掺假情况频繁发生。为维护市场稳定,保障食品安全,迫切需要量化肉制品中所含动物成分的质量百分比。本研究建立了一种实时荧光定量PCR定量检测系统,借助微滴式数字PCR技术(droplet digital,ddPCR),有效实现靶向基... 近年来,世界各地肉制品掺假情况频繁发生。为维护市场稳定,保障食品安全,迫切需要量化肉制品中所含动物成分的质量百分比。本研究建立了一种实时荧光定量PCR定量检测系统,借助微滴式数字PCR技术(droplet digital,ddPCR),有效实现靶向基因拷贝数的绝对定量,利用实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative PCR detecting system,q-PCR),将扩增Ct值转化为基因拷贝数,再从基因拷贝数转换为肉的质量,有效实现了Ct值与质量间的转化,从而实现了羊肉中掺假鸡肉的精确定量。实验数据表明,该方法可以很好地应用于掺假羊肉中鸡肉质量百分比的检测,鸡肉的最低定量检测限(LOD)为5%,在5%~80%范围内相对误差小于±9%,相对标准偏差(RSD)小于±20%,定量结果准确、重复性高,可以有效区分生产污染与故意掺假,为肉类掺假的监管工作提供有力的技术参考。 展开更多

关键词 羊肉 精确定量 实时荧光定量pcr

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鸭肠炎病毒疫苗株EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立

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作者 万春和 刘荣昌 +5 位作者 程龙飞 傅光华 施少华 陈红梅 傅秋玲 黄瑜 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期1558-1566,共9页

鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)疫苗株自1960年以来一直被用于防控DEV感染,该疫苗安全稳定、生产技术成熟、可快速诱导机体体液免疫和细胞免疫。DEV的基因组庞大,复制非必需区多,可容纳多个外源基因的插入,被广泛用来作为基因工... 鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)疫苗株自1960年以来一直被用于防控DEV感染,该疫苗安全稳定、生产技术成熟、可快速诱导机体体液免疫和细胞免疫。DEV的基因组庞大,复制非必需区多,可容纳多个外源基因的插入,被广泛用来作为基因工程载体来开发疫苗。当前,尚未见仅针对DEV疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法相关研究报道。本研究通过分析DEV疫苗株和强毒株UL2基因特点,明确DEV疫苗株在UL2基因上存在528bp连续核苷酸缺失,设计针对该差异的实时荧光定量PCR引物,建立了EvaGreen实时荧光定量PCR检测DEV疫苗株的方法。结果表明,建立的检测DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,当UL2基因含量为5.25×101~5.25×106拷贝·μL^(-1)时有良好的线性扩增,其标准曲线方程Y轴截距为34.95,斜率为-3.218,扩增相关系数为0.999,扩增效率为100%;敏感性强,最低检测限为52.5拷贝·μL^(-1);特异性好,对DEV疫苗株扩增产物的熔解曲线分析,仅出现1个单特异峰值[Tm=(90.62±0.28)℃],无引物二聚体,对其他鸭源传染病病原(如鸭肠炎病毒强毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、番鸭源鹅细小病毒、新型基因重组型鸭细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭源鹅多瘤病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.55%~1.72%和0.92%~2.49%。本研究建立了DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,为评价DEV活载体基因工程疫苗免疫防控机制提供参考。 展开更多

关键词 鸭肠炎病毒 疫苗株 UL2基因 EvaGreen 实时荧光定量pcr方法

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猪LFA-1和CTLA-4实时荧光定量PCR检测方法的建立

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作者 遇奇 李焕荣 +1 位作者 孙英健 隋丽华 《中国农学通报》 CSCD 北大核心 2009年第21期13-17,共5页

【目的】建立猪LFA—1和CTLA-4实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank中核苷酸序列设计猪淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）的特异性引物，经RT-PCR扩增、目的片段与载体连接转化以及重... 【目的】建立猪LFA—1和CTLA-4实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank中核苷酸序列设计猪淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）的特异性引物，经RT-PCR扩增、目的片段与载体连接转化以及重组质粒的鉴定，并对重组质粒标准品和样品cDNA进行检测，构建LFA－1和CTLA-4荧光定量RT-PCR标准曲线。【结果】以1×10^2～1×10^9拷贝／μl不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增后，统计学分析显示标准品浓度的对数与Ct值之间存在良好的线性关系（LFA—1：RSq=0．992；CTLA-4：RSq=0．994）；样品检测显示LFA－1与CTLA－4引物的扩增曲线图和熔解曲线图的特异性。【结论】所构建的质粒标准品具有线性关系好、重复性好、敏感性高等特点，以及其引物在样品检测中的可应用性，为分析猪免疫细胞在感染病毒前后LFA－1和CTLA－4表达的变化以及评估猪体免疫功能，提供必要的技术平台。 展开更多

关键词 猪 实时荧光定量pcr 检测方法 LFA-1 CTLA-4

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鸡圆环病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：1

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作者 陈佳圣 赵天琪 +3 位作者 刘东华 孙祥茹 陈文德 李根 《中国家禽》 北大核心 2024年第1期56-61,共6页

为快速准确检测鸡圆环病毒(CCV),试验根据CCV Rep基因设计特异性引物,以CCV阳性病料提取的DNA为模板进行PCR扩增,构建CCV重组质粒,建立检测CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:试验建立的方法对2.87×10^(8)~2.87×... 为快速准确检测鸡圆环病毒(CCV),试验根据CCV Rep基因设计特异性引物,以CCV阳性病料提取的DNA为模板进行PCR扩增,构建CCV重组质粒,建立检测CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:试验建立的方法对2.87×10^(8)~2.87×10^(1)copies/μL浓度范围的CCV重组质粒标准品呈现良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9936,灵敏度比常规PCR高100倍;该方法对鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等常见鸡病毒性病原以及多杀性巴氏杆菌、禽致病性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌无特异性扩增,批内和批间变异系数均不超过1%;该方法对60份疑似CCV感染临床样品检测结果显示,CCV阳性检出率(16.67%)高于常规PCR。上述结果表明,研究建立的CCV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,检出限为2.87×10^(1)copies/μL,可以用于CCV的快速定量检测。 展开更多

关键词 鸡圆环病毒 SYBR GreenⅠ实时荧光定量pcr 检测方法

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基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体TaqMan检测方法的建立及其遗传演化分析

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作者 江锦秀 张靖鹏 +3 位作者 林裕胜 刘维巍 胡奇林 万春和 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1684-1695,共12页

热休克蛋白70 (heat shock protein 70,Hsp70)是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)的重要膜蛋白,是机体内高度保守的生物分子,但在种间差异大,可作为分子生物学检测的候选靶区。为建立基于Hsp70基因的Movi通用型TaqMan实... 热休克蛋白70 (heat shock protein 70,Hsp70)是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)的重要膜蛋白,是机体内高度保守的生物分子,但在种间差异大,可作为分子生物学检测的候选靶区。为建立基于Hsp70基因的Movi通用型TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,并进一步了解其遗传变异情况,本研究基于GenBank中Movi的Hsp70基因特征,设计特异性的引物及探针,建立了基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体qPCR检测方法。应用建立的检测方法对88份山羊鼻拭子样品及43份疑似羊支原体性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)病料进行检测。将检测结果为Movi阳性的肺组织样品进行分离鉴定,并对分离株Hsp70基因进行序列分析。结果显示,建立的qPCR检测方法其相关系数为1.00,扩增效率为96.0%,斜率为-3.411,Y轴截距为37.29。特异性强,与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri, Mmc)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae, Mccp)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii, AL)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae, Maga)、伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis, CP)、羊口疮病毒(orf virus, ORFV)、牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)等牛羊常见病原均无交叉反应;敏感性高,最低检测限为5.72 copies·μL^(-1);重复性优,组内变异系数和组间变异系数均小于1.00%。6株Movi分离株Hsp70基因全长均为1 818 bp,与其它Movi参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.4%和98.0%~100.0%;进一步分析发现,山羊源Movi均比绵羊源多1个N-糖基化位点。遗传演化分析表明,其均处于ClusterⅠA亚分支(均为山羊源)。综上,本研究建立了特异性强、敏感性高、重复性优的基于Hsp70基因的Movi的qPCR检测方法。序列分析发现,不同来源Movi的Hsp70基因核苷酸同源性高;遗传演化分析证实,Movi福建株与山羊源分离株遗传关系较近。本研究不仅为Movi 展开更多

关键词 绵羊肺炎支原体 HSP70基因 TaqMan实时荧光定量pcr方法 序列分析

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鸭腺病毒3型Hexon基因的克隆及SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立 被引量：4

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作者 陈翠腾 万春和 +6 位作者 程龙飞 傅光华 施少华 刘荣昌 陈珍 朱春华 黄瑜 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1104-1112,共9页

鸭腺病毒3型(duck adenovirus type 3,DAdV-3)是近年来我国新发鸭源禽腺病毒。本试验根据NCBI数据库中DAdV-3 Hexon基因特征,设计特异性引物,获得番鸭源DAdV-3福建株(命名为W1FJ株)Hexon基因全长,明确其分子特征,并基于此建立检测DAdV-3... 鸭腺病毒3型(duck adenovirus type 3,DAdV-3)是近年来我国新发鸭源禽腺病毒。本试验根据NCBI数据库中DAdV-3 Hexon基因特征,设计特异性引物,获得番鸭源DAdV-3福建株(命名为W1FJ株)Hexon基因全长,明确其分子特征,并基于此建立检测DAdV-3的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果表明,克隆的W1FJ株Hexon基因全长为2 814 bp,编码937个氨基酸,和DAdV-3(CH-GD-12-2014株)核苷酸同源性为100%,但和鸭源禽腺病毒B型(也称鸭腺病毒2型,DAdV-2,GR株)核苷酸同源性仅为76.6%。Hexon蛋白遗传进化分析表明,W1FJ株和CH-GD-12-2014株在遗传进化上形成一个独立的分支,与鸭源禽腺病毒B型和鹅源禽腺病毒A型(goose aviadenovirus A)在遗传进化上明显不同,建议将其命名为鸭源禽腺病毒C型(duck aviadenovirus C)。建立的检测DAdV-3的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,灵敏度高,最低检测限为61拷贝/μL;特异性强,和鸭群常见传染病病原均无交叉反应,扩增产物的熔解曲线只出现1个特异性单峰,Tm值为(81.48±0.25)℃;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.49%~1.64%和0.67%~2.40%。本试验为DAdV-3的科学分类和后续开展DAdV-3感染的流行病学调查及致病机理研究奠定基础。 展开更多

关键词 鸭腺病毒3型 Hexon基因 SYBR GreenⅠ实时荧光定量pcr方法

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)病毒含量荧光定量PCR方法的建立 被引量：3

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作者 魏津 蒋卉 +6 位作者 戴志红 关孚时 李翠 张秀英 温芳 陆连寿 王在时 《中国兽药杂志》 2013年第10期39-42,共4页

为快速、准确测定高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)活疫苗(JXA1-R株)的病毒含量,根据GenBank中该病毒的保守基因序列设计合成了引物和探针,优化反应条件,建立了其活疫苗病毒含量的荧光定量PCR方法。用该方法测定疫苗样品的病毒含量... 为快速、准确测定高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)活疫苗(JXA1-R株)的病毒含量,根据GenBank中该病毒的保守基因序列设计合成了引物和探针,优化反应条件,建立了其活疫苗病毒含量的荧光定量PCR方法。用该方法测定疫苗样品的病毒含量,每头份稀释100倍后,Ct均值为17.08,病毒拷贝数均值为4.61×107copy/μL。将建立的荧光定量PCR与传统的TCID50方法进行相关性分析,相关系数r=0.83,表明该方法可用于HP-PRRS活疫苗半成品及成品的病毒含量测定。 展开更多

关键词 高致病性猪繁殖与呼吸综合征 病毒含量测定 荧光定量pcr方法

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