血管基膜衍生多功能肽在大肠杆菌中的表达及抗肿瘤活性的测定 被引量：10

1

作者 彭淑平 方唯意 +3 位作者 蒋日成 周建国 董琳 曹建国 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期678-682,共5页

目的 构建血管基膜衍生多功能肽(VBMDMP)原核表达载体、诱导表达GST-VBMDMP融合蛋白,观察其对Lewis肺癌自发转移瘤模型的影响。方法 人工合成VB-MDMP DNA序列(人源性IgG3上游铰链区连接肽连接的Tumstatin的两个功能区获得性肽基因序列)... 目的 构建血管基膜衍生多功能肽(VBMDMP)原核表达载体、诱导表达GST-VBMDMP融合蛋白,观察其对Lewis肺癌自发转移瘤模型的影响。方法 人工合成VB-MDMP DNA序列(人源性IgG3上游铰链区连接肽连接的Tumstatin的两个功能区获得性肽基因序列),构建克隆载体PUC19-VBMDMP,亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体上,经测序和酶切分析鉴定获得了未发生移码突变的PGEX-4T-1-VBMDMP融合载体质粒。转化入大肠杆菌后,用 IPTG诱导表达融合蛋白。Glutathione sepharose 4B层析柱纯化蛋白表达产物。采用Lewis肺癌自发转移瘤模型,检测VBMDMP的抗肿瘤作用。结果 成功的构建pUC19-VB-MDMP克隆和pGEX-4T-1-VBMDMP表达载体,在大肠杆菌获得稳定表达,用Glutathione sepharose 4B层析柱获得纯化的GST-VBMDMP融合蛋白。VBMDMP(GST-VBM-DMP 10、6、2 mg·kg^(-1))对小鼠Lewis肺癌原发瘤具有抑制作用(瘤重抑制率分别为95.5％,80.4％,60.05％)。VBMDMP(GST-VBMDMP 10,6,2 mg·kg^(-1))对小鼠Lewis肺癌自发性肺转移具有抑制作用(自发性肺转移瘤结节抑制率分别为94.8％,86.4％,73.9％)。结论 VBM-DMP对小鼠Lewis肺癌原发瘤和肺转移具有抑制作用。 展开更多

关键词 血管基膜衍生多功能肽 原核表达 LEWIS肺癌 治疗作用

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半滑舌鳎生长激素及其受体基因的原核表达 被引量：5

2

作者 马骞 柳淑芳 +1 位作者 庄志猛 唐启升 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期956-962,共7页

根据已克隆的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)生长激素(GH)基因和生长激素受体Ⅰ(GHR-Ⅰ)基因的cDNA序列信息设计引物,用于扩增半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因序列。随后,分别利用表达载体pET-32a和pGEX-6P-1成功构建了包含半滑舌鳎GH、GHR-... 根据已克隆的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)生长激素(GH)基因和生长激素受体Ⅰ(GHR-Ⅰ)基因的cDNA序列信息设计引物,用于扩增半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因序列。随后,分别利用表达载体pET-32a和pGEX-6P-1成功构建了包含半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因ORF全序列及不同ORF片段的6个重组质粒,并将获得的重组质粒在表达宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示:重组GH的pET-32a-CSGH质粒在40 kD处有特异性的蛋白条带,重组GHR-Ⅰ胞内区的pGEX-6P-1-CSGHR1-2质粒在70 kD处发现诱导的蛋白条带,其表达量分别占细胞蛋白总量的37.6%和20.2%;而构建的pGEX-6P-1-CSGH重组质粒和含有GHR-Ⅰ基因跨膜区的重组质粒(pET-32a-CSGHR1-1、pET-32a-CSGHR1-2和pGEX-6P-1-CSGHR1-1)均未获得表达产物。由此可见,半滑舌鳎GHR-Ⅰ基因的跨膜区可能影响其在大肠杆菌中的表达。研究结果为实现半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ制剂的开发及应用于养殖生产实践奠定基础。 展开更多

关键词 半滑舌鳎 生长激素基因 生长激素受体Ⅰ基因 原核表达

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细粒棘球绦虫MDH基因的克隆表达结构功能预测及蛋白定位

3

作者 普娜 赵文卿 +5 位作者 张玉霞 陈旭珂 张艳艳 孙艳 薄新文 王正荣 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期393-402,共10页

为了探究苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)基因在细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)生长发育中的生物学功能并初步评价MDH作为疫苗候选抗原的潜力,从NCBI GenBank数据库中获得Eg MDH基因序列,设计特异性引物,以细粒棘球绦... 为了探究苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)基因在细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)生长发育中的生物学功能并初步评价MDH作为疫苗候选抗原的潜力,从NCBI GenBank数据库中获得Eg MDH基因序列,设计特异性引物,以细粒棘球绦虫原头蚴的cDNA为模板,用PCR扩增MDH基因全长序列;采用生物信息学软件对MDH蛋白的理化性质、结构特点等进行分析;构建重组质粒pET28a-MDH并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用SDS-PAGE检测蛋白的表达,随后纯化、复性蛋白,并通过Western-blot对蛋白进行抗原性分析;利用间接免疫荧光试验检测原头蚴中目的蛋白的定位;应用实时荧光定量PCR分析Eg MDH基因m RNA在原头蚴及成虫中的相对转录水平。生物信息学分析结果显示,Eg MDH基因长999 bp,编码332个氨基酸,蛋白分子式为C1639H2599N445O475S16,相对分子质量为36 651.32,理论等电点为8.11,且编码蛋白没有信号肽和跨膜区,含有40个磷酸化位点,3个N连接型糖基化位点,9个优势B细胞抗原表位。二级结构由α-螺旋(46.69%)、无规则卷曲(31.93%)、延伸链结构(16.87%)和β-转角(4.52%)构成。克隆的基因长975 bp,预测分子质量为35.7 ku;Western-blotting显示,重组蛋白可以被抗His标签的家兔多克隆抗体和原头蚴可溶性全蛋白小鼠多克隆抗体识别;间接免疫荧光试验显示,Eg MDH蛋白定位在原头蚴的囊壁;实时荧光定量PCR显示,Eg MDH基因在成虫及原头蚴中均有表达,且原头蚴阶段的转录水平显著高于成虫(P<0.05)。本研究结果初步表明Eg MDH具有作为疫苗候选抗原的潜力,以期为后续细粒棘球绦虫疫苗研发提供候选抗原;同时也为后续细粒棘球绦虫MDH基因的深入研究奠定了基础。 展开更多

关键词 细粒棘球绦虫 苹果酸脱氢酶 生物信息学 原核表达 间接免疫荧光

原文传递

松材线虫类毒过敏原蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 被引量：3

4

作者 林世锋 简恒 +2 位作者 赵海娟 卜祥霞 刘倩 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期128-135,共8页

利用重叠延伸PCR基因合成法,按大肠杆菌偏爱密码子,合成松材线虫类毒过敏原蛋白基因(Bxvap2),将其连接到原核表达载体pET-29b(+)上。获得的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,目的蛋白以可溶形式高... 利用重叠延伸PCR基因合成法,按大肠杆菌偏爱密码子,合成松材线虫类毒过敏原蛋白基因(Bxvap2),将其连接到原核表达载体pET-29b(+)上。获得的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,目的蛋白以可溶形式高效表达,占细菌总蛋白的33.5%。将表达产物经Ni-NTA亲和柱纯化后进行质谱分析,结果显示纯化的蛋白为BXVAP2蛋白。用制备的BXVAP2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,间接ELISA测得抗体灵敏度5.4 ng.mL-1(效价为1∶1 360 000),为进一步研究该蛋白的组织定位及功能,明确该基因在致病过程中的作用机理奠定了基础。 展开更多

关键词 松材线虫 类毒过敏原蛋白 基因优化 原核表达 多克隆抗体

原文传递

MBP-PTP19融合蛋白载体构建及蛋白纯化 被引量：2

5

作者 霍晨敏 刘士毓 +3 位作者 辛静 宁可欣 李川玲 商建秀 《河北师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2017年第3期256-263,共8页

蛋白磷酸酶在植物生长发育过程中发挥着重要的调控作用.酪氨酸蛋白磷酸酶属于蛋白磷酸酶中一个亚家族,在植物领域的研究中涉及较少.笔者所在实验室研究数据表明,酪氨酸蛋白磷酸酶19(PTP19)在植物盐响应中起负调控作用.使用MBP标签载体,... 蛋白磷酸酶在植物生长发育过程中发挥着重要的调控作用.酪氨酸蛋白磷酸酶属于蛋白磷酸酶中一个亚家族,在植物领域的研究中涉及较少.笔者所在实验室研究数据表明,酪氨酸蛋白磷酸酶19(PTP19)在植物盐响应中起负调控作用.使用MBP标签载体,构建MBP-PTP19融合蛋白表达载体,转化BL21大肠杆菌.以IPTG浓度、诱导时间、诱导温度3个因素设计L18正交实验探索MBP-PTP19蛋白的最佳诱导表达条件.找到该蛋白表达的最适诱导条件为IPTG终浓度0.1mmol/L、诱导时间4h、诱导温度37℃.该融合蛋白在上清液以及包涵体中均有分布.用直链淀粉树脂纯化得到了MBP-PTP19蛋白,并以其为抗原制备了PTP19的抗体,且抗体可识别PTP19蛋白,这为研究PTP19蛋白生化性质及其功能奠定了基础. 展开更多

关键词 拟南芥 酪氨酸蛋白磷酸酶 正交设计 原核表达 抗体

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人源性防御素HD-5的原核表达及抗真菌作用的初步研究 被引量：1

6

作者 张萍萍 尹利荣 +2 位作者 王芳 孙蓓 霍彦 《天津医药》 CAS 北大核心 2014年第8期755-758,共4页

目的构建pQE-30Xa/HD-5原核表达载体,纯化重组蛋白并进行抗真菌活性的初步鉴定。方法以pcDNA3.1(+)/HD-5为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增编码HD-5成熟肽的基因。构建pQE-30Xa/HD-5重组表达载体,并对重组质粒进行酶切、基因序列分析。将鉴... 目的构建pQE-30Xa/HD-5原核表达载体,纯化重组蛋白并进行抗真菌活性的初步鉴定。方法以pcDNA3.1(+)/HD-5为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增编码HD-5成熟肽的基因。构建pQE-30Xa/HD-5重组表达载体,并对重组质粒进行酶切、基因序列分析。将鉴定正确的质粒转化入大肠杆菌M15后进行异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。通过镍柱亲和层析纯化蛋白并进行蛋白复性,蛋白免疫印迹(Western blot)鉴定纯化产物。以KB纸片法初步验证纯化获得的重组蛋白对白色假丝酵母菌的抑菌活性。结果成功克隆了HD-5基因并构建了重组质粒pQE-30Xa/HD-5。重组质粒在大肠杆菌M15中诱导表达出HD-5融合蛋白;Western blot分析结果显示纯化后的融合蛋白与目的蛋白相符;KB纸片法证实纯化后的融合蛋白对白色假丝酵母菌具有一定的抑菌活性。结论成功构建HD-5原核表达载体,经诱导表达后纯化获得具有良好抑菌活性的HD-5融合蛋白。 展开更多

关键词 防御素类 重组融合蛋白质类 大肠杆菌 防御素-5 原核表达 亲和层析 抗真菌活性

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少棘蜈蚣候选杀虫肽κ-SLPTX-Ssm2e的原核表达与纯化 被引量：1

7

作者 姚梦 赵丹 +2 位作者 刘长军 王干 吴磊 《生命科学研究》 CAS CSCD 2017年第6期477-481,共5页

κ-SLPTX-Ssm2e是一条通过生物信息学同源序列分析获得的与已知具有杀虫活性的毒素κ-SLPTX-Ssm2a高度同源的少棘蜈蚣毒素,由31个氨基酸残基组成,且含有3对二硫键。为了后续便于对其结构和功能进行研究,现采用原核表达与纯化的方法来获... κ-SLPTX-Ssm2e是一条通过生物信息学同源序列分析获得的与已知具有杀虫活性的毒素κ-SLPTX-Ssm2a高度同源的少棘蜈蚣毒素,由31个氨基酸残基组成,且含有3对二硫键。为了后续便于对其结构和功能进行研究,现采用原核表达与纯化的方法来获取较高产量的毒素多肽。文中首先利用大肠杆菌自动诱导表达系统,在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中表达融合蛋白GST-SUMO-κ-SLPTX-Ssm2e,将其通过GST亲和层析纯化后,采用Ulp1激酶酶切,以释放毒素分子。随后,通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进一步纯化。最后,利用MALDI-TOF/TOF质谱仪鉴定目的多肽峰的相对分子质量为3 475.732,与κ-SLPTX-Ssm2e的理论相对分子质量3 475.07基本一致,说明κ-SLPTX-Ssm2e很有可能被成功表达。上述结果为进一步研究κ-SLPTX-Ssm2e的杀虫活性奠定了基础。 展开更多

关键词 κ-SLPTX-Ssm2e 杀虫肽 少棘蜈蚣 原核表达 大肠杆菌BL21(DE3)

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条斑紫菜锰超氧化物歧化酶原核表达及多克隆抗体制备 被引量：1

8

作者 邵林 茅云翔 +2 位作者 阎斌伦 孔凡娜 王健 《中国海洋大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期47-52,共6页

研究紫菜抗逆的分子机制,将本实验室克隆的条斑紫菜(Porphyra yezoensisUeda)锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn SOD)基因全长cDNA克隆到质粒pET-30c(+)中,构建原核表达载体pET-S,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达Mn SOD,... 研究紫菜抗逆的分子机制,将本实验室克隆的条斑紫菜(Porphyra yezoensisUeda)锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn SOD)基因全长cDNA克隆到质粒pET-30c(+)中,构建原核表达载体pET-S,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达Mn SOD,表达产物的分子量约为30 KDa。利用不同浓度的Mn2+诱导重组Mn SOD的表达,可以检测到比活力随Mn2+浓度增高而上升的趋势。用重组Mn SOD免疫新西兰大白兔,制备了多克隆抗体,多克隆抗体的效价为1∶8 000。免疫印迹实验(Western Blot)表明该多克隆抗体具有很好的特异性。 展开更多

关键词 条斑紫菜 锰超氧化物歧化酶(Mn SOD) 原核表达 酶活性 多克隆抗体

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鸭肠炎病毒UL18基因的转录、表达特征及原核表达蛋白的初步应用

9

作者 陈希文 程安春 +5 位作者 汪铭书 常华 陈舜 孙昆峰 朱德康 贾仁勇 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期1479-1486,共8页

为了探讨鸭肠炎病毒（duck enteritis virus，DEV）UL18基因的特性和功能，本研究运用生物信息学软件对DEVUI，18基因及其编码蛋白进行了分析。构建原核表达质粒pET32a-UL18，并将其转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导后获得了大小约... 为了探讨鸭肠炎病毒（duck enteritis virus，DEV）UL18基因的特性和功能，本研究运用生物信息学软件对DEVUI，18基因及其编码蛋白进行了分析。构建原核表达质粒pET32a-UL18，并将其转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导后获得了大小约为55000的pET32a／DEV-UL18重组蛋白。将该重组蛋白纯化后免疫家免，获得了兔抗pET32a／DEV-UL18重组蛋白高免血清。采用荧光定量RT-PCR和Westernblot对DEV感染鸭胚成纤维细胞（DEF）后uL18基因的转录和表达情况进行检测，采用间接免疫荧光对DEV感染鸭的肠道和食道进行检测。生物信息学分析结果表明，DEVUL18基因大小969bp，编码1条由322个氨基酸残基组成的多肽，含15个潜在的磷酸化位点和2个N-糖基化位点，合15个潜在的B细胞表位；系统进化树分析表明，DEVUL18属于＆一疱疹病毒的1个成员，与MeHV-1亲缘关系最近；密码子偏爱性分析结果表明，若对DEVUL18基因进行外源表达，真核表达系统可能更容易，若选择原核表达系统，则需对宿主表达菌进行选择和条件优化。荧光定量RT-PCR和westernblot结果表明，DEV感染DEF后2h，UL18基因开始转录，感染后12h开始表达，感染24h后转录和表达产物急剧上升，到36和48h后转录和表达产物分别达最大值，之后逐渐下降。间接免疫荧光结果表明，被DEV感染鸭肠道、食道等组织能检测到明显的阳性信号，表明制备的DEVUL18原核表达蛋白及其兔抗多克隆抗体可用于DEV的诊断试剂材料。 展开更多

关键词 鸭肠炎病毒 UL18基因 分子特征 原核表达 间接免疫荧光

原文传递

家蚕微孢子虫海藻糖合成酶基因Nbtps1的克隆与原核表达

10

作者 朱峰 李孝良 +3 位作者 唐旭东 徐莉 白兴荣 沈中元 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期796-802,共7页

海藻糖在保护细胞质膜和生物大分子空间结构,维持胞内渗透压增大的过程中发挥重要作用,海藻糖合成酶是海藻糖合成途径中的一个关键酶。通过检索微孢子虫基因组数据库发现,家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)基因组中含有4个海藻糖合成酶基因... 海藻糖在保护细胞质膜和生物大分子空间结构,维持胞内渗透压增大的过程中发挥重要作用,海藻糖合成酶是海藻糖合成途径中的一个关键酶。通过检索微孢子虫基因组数据库发现,家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)基因组中含有4个海藻糖合成酶基因,其中Nbtps1基因的开放阅读框长1 386 bp,为单外显子结构,编码461个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量53.7 k D,等电点5.19。Nb TPS1蛋白序列含有1个糖基转移酶结构域和4个潜在的N-糖基化位点,亚细胞定位预测该蛋白质位于细胞质中。多重序列比对分析结果表明,Nb TPS1与东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)海藻糖合成酶的氨基酸序列相似度分别为59.0%、54.7%,系统发育进化树显示三者的亲缘关系与之相符。构建重组表达载体Nbtps1/p ET-28a(+)并转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达及亲和纯化后获得最终质量浓度为1.18 mg/m L的重组融合蛋白His-Nb TPS1。用纯化后的融合蛋白制备兔多克隆抗体Anti-Nb TPS1,利用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价达1∶25 600,并通过Western blotting检测验证了该多克隆抗体的特异性,为研究Nb TPS1的生物学功能以及家蚕微孢子虫的间接免疫检测奠定了实验基础。 展开更多

关键词 家蚕微孢子虫 海藻糖合成酶 基因克隆 序列分析 原核表达 多克隆抗体

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日本血吸虫碱性调宁蛋白样蛋白P14基因的原核表达及鉴定

11

作者 季丰 姜玉新 唐小牛 《皖南医学院学报》 CAS 2012年第6期431-434,共4页

目的:原核表达并鉴定日本血吸虫P14基因(SjP14)。方法:提取日本血吸虫成虫总RNA,RT-PCR扩增SjP14基因,插入pGEM-T载体后酶切鉴定,再亚克隆至pET28a(+)原核表达载体并转化感受态细胞E.coli BL21,1mmol/L的IPTG诱导表达后,用纯化试剂盒纯... 目的:原核表达并鉴定日本血吸虫P14基因(SjP14)。方法:提取日本血吸虫成虫总RNA,RT-PCR扩增SjP14基因,插入pGEM-T载体后酶切鉴定,再亚克隆至pET28a(+)原核表达载体并转化感受态细胞E.coli BL21,1mmol/L的IPTG诱导表达后,用纯化试剂盒纯化并进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。结果:RT-PCR扩增后获得一特异性基因片段,测序及比对后确认为SjP14基因。用IPTG诱导含重组pET28a(+)-SjP14的E.coli BL21后,经SDS-PAGE分析表明其表达成功,分子量约为38 ku。Western blot鉴定结果表明纯化后的SjP14蛋白可被SjP14多克隆抗体识别。结论:成功表达并纯化了日本血吸虫P14基因产物,为下一步动物免疫保护性实验奠定了基础。 展开更多

关键词 日本血吸虫 SjP14基因 原核表达 鉴定

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嗜酸性乳杆菌MG株S层蛋白的高级结构预测分析及原核表达

12

作者 王敏 小琴 +4 位作者 那日苏 王彩凤 特尼格尔 赵慧 格日勒图 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第4期18-22,共5页

以嗜酸性乳杆菌MG株slp基因(表达S层蛋白的基因)为材料,应用Genetyx软件推导出其正确的开放阅读框(ORF),并用CPHmodels,Swiss-Model和Swiss-PdbViewer生物软件预测SLP蛋白质的高级结构;此外,构建slp基因的原核表达载体pGEX-slp,经IPTG... 以嗜酸性乳杆菌MG株slp基因(表达S层蛋白的基因)为材料,应用Genetyx软件推导出其正确的开放阅读框(ORF),并用CPHmodels,Swiss-Model和Swiss-PdbViewer生物软件预测SLP蛋白质的高级结构;此外,构建slp基因的原核表达载体pGEX-slp,经IPTG诱导后,成功表达出重组S层蛋白(S-layer protein,SLP),并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果表明,使用3种不同的软件预测SLP蛋白质的高级结构,预测结果具有很高的相似性,其中α螺旋占3.33%,线性结构占45%,无规则卷曲占51.67%,平均亲水值为-0.262,亲水氨基酸比例为59.1%;表达载体pGEX-slp在E.coli BL21中经IPTG诱导成功表达出重组SLP蛋白,其GST融合蛋白的大小约为70ku。本研究结果为进一步以SLP为材料的生物制品的制备和应用开发奠定了基础。 展开更多

关键词 嗜酸性乳杆菌MG株 S层蛋白 高级结构预测 原核表达

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类人胰岛素原多拷贝重复基因原核表达载体的构建与表达

13

作者 罗联忠 陈仲巍 叶子坚 《南昌大学学报（理科版）》 CAS 北大核心 2014年第3期234-242,共9页

根据大肠杆菌密码子偏好性,优化人胰岛素原基因序列,同时用2个赖氨酸取代C链。重叠PCR扩增法克隆优化的类人胰岛素原基因,PCR扩增引物中引入胰蛋白酶酶切位点和核酸限制性内切酶识别位点。经酶切、拼接获得类人胰岛素原多拷贝基因,并构... 根据大肠杆菌密码子偏好性,优化人胰岛素原基因序列,同时用2个赖氨酸取代C链。重叠PCR扩增法克隆优化的类人胰岛素原基因,PCR扩增引物中引入胰蛋白酶酶切位点和核酸限制性内切酶识别位点。经酶切、拼接获得类人胰岛素原多拷贝基因,并构建人胰岛素原基因多拷贝原核表达载体,转化感受态大肠杆菌诱导表达融合蛋白。表达产物经SDS-PAGE电泳,考马斯亮兰染色和融合蛋白染色条带光密度分析表明,含有4拷贝的类人胰岛素原重复基因序列原核表达载体的诱导表达类人胰岛素原效率最高,是单拷贝类人胰岛素基因原核表达载体表达效率的3倍左右。表达产物经质谱鉴定,确定为优化设计的类人胰岛素原,表明构建的多拷贝类人胰岛素原基因表达载体可应用于后续人胰岛素原的高效表达生产研究。 展开更多

关键词 类人胰岛素原 重组基因表达 多拷贝基因 原核表达 糖尿病

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牛流行热病毒山东分离株α3基因序列分析及原核表达与纯化

14

作者 朱鸿超 何畅 +4 位作者 侯佩莉 王洪梅 李雪漫 唐文娟 何洪彬 《山东农业科学》 北大核心 2021年第7期107-112,共6页

为深入研究牛流行热病毒(BEFV)编码的α3非结构蛋白的功能及其在研发新型BEFV疫苗和诊断试剂上的应用,本研究对本实验室分离保存的BEFV采用RT-PCR法对其α3基因进行扩增;用DNAStar软件对序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析;用ProtParam... 为深入研究牛流行热病毒(BEFV)编码的α3非结构蛋白的功能及其在研发新型BEFV疫苗和诊断试剂上的应用,本研究对本实验室分离保存的BEFV采用RT-PCR法对其α3基因进行扩增;用DNAStar软件对序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析;用ProtParam和抗原表位分析生物信息学软件研究α3蛋白的亲水性、优势抗原表位区;分别用限制性内切酶双酶切目的基因α3和pGEX-4T-1载体,构建pGEX-4T-1-α3原核表达载体,并进行诱导表达。结果表明,成功扩增出156bp的α3基因序列;该α3基因序列与参考毒株的核苷酸序列同源性为98.0%~100.0%,氨基酸序列的同源性也为98.0%~100.0%,表明α3蛋白具有较高的保守性;BEFV的α3蛋白抗原表位分析表明3~5、9~47aa是α3蛋白的优势抗原表位区段,总平均疏水性为-0.737,说明该蛋白以可溶性形式存在;构建的pGEX-4T-1-α3原核表达质粒在大肠杆菌中成功表达,应用可溶性蛋白纯化的方法获得较高纯度的α3蛋白。本研究为该蛋白的免疫原性验证以及新型牛流行热病毒疫苗研发提供了数据参考。 展开更多

关键词 牛流行热病毒(BEFV) α3蛋白 序列分析 原核表达 纯化

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大黄鱼变形假单胞菌外膜蛋白OMPH和OMPW的原核表达及其多克隆抗体制备

15

作者 叶毅铭 何亮银 +4 位作者 廖青青 林永翔 刘敏 陈虹坚 文宇鑫 《宁德师范学院学报（自然科学版）》 2023年第1期57-64,共8页

为获取变形假单胞菌外膜蛋白OMPH和OMPW的重组蛋白,研究克隆了ompH和ompW的基因序列,构建重组表达载体并转化宿主菌,成功实现了外膜蛋白的原核表达.结果显示,ompH和ompW基因全长分别为603和690bp,对应编码200和229个氨基酸;变性聚丙烯... 为获取变形假单胞菌外膜蛋白OMPH和OMPW的重组蛋白,研究克隆了ompH和ompW的基因序列,构建重组表达载体并转化宿主菌,成功实现了外膜蛋白的原核表达.结果显示,ompH和ompW基因全长分别为603和690bp,对应编码200和229个氨基酸;变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,OMPH和OMPW重组蛋白相对分子质量分别为25.0和28.5ku,通过Ni+亲和层析纯化后的重组蛋白条带单一.以纯化后的重组蛋白OMPH和OMPW分别免疫小鼠制备其多克隆抗体,酶联免疫吸附试验测得鼠源OMPH和OMPW多克隆抗体的效价分别为40000和50000;免疫印迹显示了抗血清与重组蛋白结合活性良好. 展开更多

关键词 大黄鱼 变形假单胞菌 外膜蛋白 原核表达 多克隆抗体

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蜱传脑炎病毒E基因的重组质粒构建及其在原核细胞的表达 被引量：5

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作者 邵宾 陈斌 +2 位作者 谢菲 王林 黄会岭 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期87-91,共5页

通过表达蜱传脑炎病毒E蛋白,为制备蜱传脑炎快速检测试纸条的奠定基础。根据GenBank数据库中已发表的蜱传脑炎病毒的基因序列,检索并合成蜱传脑炎病毒目的基因E,设计引物,PCR扩增,克隆至原核表达载体pET-30a(+)构建重组质粒,在BL21细菌... 通过表达蜱传脑炎病毒E蛋白,为制备蜱传脑炎快速检测试纸条的奠定基础。根据GenBank数据库中已发表的蜱传脑炎病毒的基因序列,检索并合成蜱传脑炎病毒目的基因E,设计引物,PCR扩增,克隆至原核表达载体pET-30a(+)构建重组质粒,在BL21细菌内表达蜱传脑炎病毒E蛋白。结果表明:经过PCR试验和双酶切试验鉴定,克隆测序正确,通过重组质粒,成功地表达出蜱传脑炎病毒E蛋白。 展开更多

关键词 蜱传脑炎病毒 重组质粒 E蛋白 原核表达

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