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应用双重PCR技术鉴定猪胎儿性别及其细胞系建立 被引量：5
1
作者 尹智 孔庆然 +3 位作者 格日乐其木格 王振坤 张力 刘忠华 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 2008年第9期49-52,共4页
sry和zfy/x是与哺乳动物性别决定有关的重要基因。本试验针对猪sry基因设计了两对PCR引物,以zfy/x为内参基因,利用双重PCR技术对6只30d左右猪胎儿的性别进行鉴定。结果表明,所有的6个样品都有447bp(雄性)或445bp(雌性)的zfy或zfx序列的... sry和zfy/x是与哺乳动物性别决定有关的重要基因。本试验针对猪sry基因设计了两对PCR引物,以zfy/x为内参基因,利用双重PCR技术对6只30d左右猪胎儿的性别进行鉴定。结果表明,所有的6个样品都有447bp(雄性)或445bp(雌性)的zfy或zfx序列的扩增带,而采用两对不同的引物对sry序列扩增后,有1个样品出现241bp和166bp的扩增带为雄性,其余的无特异性扩增带为雌性,然后采用胶原酶消化培养法建立已知性别的猪胎儿成纤维细胞系。该方法具有简单、快速、准确的特点,为转基因克隆动物研究中尽早转染目的基因以及培养特定性别的胎儿成纤维细胞系提供了可靠的依据。 展开更多
关键词 猪胎儿 双重PCR SRY 性别鉴定
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转EGFP基因猪胎儿神经干细胞的体外分化 被引量：2
2
作者 郑月茂 赵雪 +3 位作者 贺小英 权富生 刘军 张涌 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期3305-3313,共9页
【目的】获得转EGFP基因神经干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能;通过用EGFP对神经干细胞进行标记和体外追踪实验,为EGFP作为示踪标记对神经干细胞进行体内移植研究奠定基础。【方法】利用神经干细胞培养技术体系,从胎龄30d猪... 【目的】获得转EGFP基因神经干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能;通过用EGFP对神经干细胞进行标记和体外追踪实验,为EGFP作为示踪标记对神经干细胞进行体内移植研究奠定基础。【方法】利用神经干细胞培养技术体系,从胎龄30d猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入神经干细胞,诱导转基因神经干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。【结果】成功分离培养出神经干细胞,获得转EGFP基因神经干细胞,神经干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。神经干细胞中Nestin表达强阳性,NogoA、DCX、CyclinD2、CD133、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2);能分化为脂肪细胞(表达LPL和PPARγ-D)、成骨细胞(表达Osteonectin和Osteocalcin)、肌细胞(表达myf-5、myf-6和myoD)、内皮细胞(表达CD31、CD34、CD144和eNOS)和软骨细胞(表达COL2A1)。【结论】从猪胎儿大脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因神经干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,可以用EGFP对神经干细胞进行标记、追踪,作为示踪标记进行神经干细胞体内移植研究。 展开更多
关键词 神经干细胞 EGFP基因 细胞标记 细胞分化 猪胎儿
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猪胎儿神经干细胞的分离培养和分化 被引量：2
3
作者 郑月茂 兰志刚 +2 位作者 赵晓娥 刘军 牛雅静 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1686-1689,共4页
本研究旨在从猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,观察神经干细胞生长特性和体外增殖、分化特点。利用神经干细胞培养体系,从胎龄30 d的猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞并诱导神经干细胞贴壁分化,采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞... 本研究旨在从猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,观察神经干细胞生长特性和体外增殖、分化特点。利用神经干细胞培养体系,从胎龄30 d的猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞并诱导神经干细胞贴壁分化,采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。结果成功分离培养出神经干细胞,神经干细胞具有分化潜能。神经干细胞中Nestin表达强阳性,β-actin、DCX、Hes1、Oct4、Desmin、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2)。结果提示,从猪胎儿脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,神经干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能。 展开更多
关键词 神经干细胞 细胞标记 细胞分化 猪胎儿
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猪胰腺干细胞分离与培养 被引量：2
4
作者 王赟 窦忠英 +2 位作者 乔海 赵婷 杨春荣 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期2554-2562,共9页
【目的】探寻一种简单的胰腺干细胞的分离方法,以便为糖尿病的细胞治疗研究提供丰富的种子细胞。【方法】采用胰酶消化法分离获得细胞,利用仅含有5%的血清的RPMI1640培养基培养细胞,低浓度的血清使得细胞大量死亡漂浮,只留下少数贴壁的... 【目的】探寻一种简单的胰腺干细胞的分离方法,以便为糖尿病的细胞治疗研究提供丰富的种子细胞。【方法】采用胰酶消化法分离获得细胞,利用仅含有5%的血清的RPMI1640培养基培养细胞,低浓度的血清使得细胞大量死亡漂浮,只留下少数贴壁的小圆细胞。而后将血清浓度提高到15%以上继续培养;采用免疫组化方法对获得的细胞是否具有胰腺干细胞特征予以检测,并测定了细胞的生长曲线。【结果】在血清浓度提高后每个小圆细胞能快速增殖并形成一个克隆,经过这样增殖后的细胞可以连续传代,目前已传至60代。经免疫组化检测,细胞表达PDX-1、GLUT-2、vimentin等胰腺干细胞的标志;细胞也表达Glucagon、insulin、somatostatin、polypeptide等胰腺内分泌细胞的标志.【结论】通过本方法获得的细胞经检测确定为胰腺干细胞,在体外可自发分化形成胰胰内分泌部4种主要细胞。 展开更多
关键词 胎猪 胰岛 胰腺干细胞 糖尿病
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胎猪胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定 被引量：1
5
作者 李云龙 郭欣 +1 位作者 杨晓波 黄跃南 《哈尔滨医科大学学报》 CAS 北大核心 2012年第3期222-226,共5页
目的建立胎猪胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定的方法。方法采用胰酶和胶原酶Ⅳ、P消化法分离获得细胞,在含10%胎牛血清的M199培养基中行导管上皮细胞原代培养,而后将血清浓度提高到20%以上继续培养,3～4天后至每个小圆细胞... 目的建立胎猪胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定的方法。方法采用胰酶和胶原酶Ⅳ、P消化法分离获得细胞,在含10%胎牛血清的M199培养基中行导管上皮细胞原代培养,而后将血清浓度提高到20%以上继续培养,3～4天后至每个小圆细胞形成一个集落;采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)的方法对获得的细胞检测CK19、Pdx-1、NeuroD/Beta2、insulin、Glut-2等基因的表达。结果成功分离获得胎猪胰腺导管细胞,并证实该细胞为胎猪导管源胰腺干细胞。经检测,细胞表达CK19,Pdx-1,Glut-2,NeuroD/Beta2等胰腺干细胞的标志,而insulin、Neurogenin3阴性表达。结论该方法可较好地分离纯化出胎猪胰腺导管细胞,经鉴定获得细胞具有胰腺干细胞的特性。 展开更多
关键词 胎猪 导管细胞 干细胞 胰岛素
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胎猪胰腺干细胞扩增及诱导
6
作者 王赟 楚元奎 +2 位作者 杨春荣 王华岩 窦忠英 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期83-86,共4页
目的寻找胰腺干细胞扩增方法，为研究糖尿病的细胞治疗提供种子细胞。方法无菌采集胎猪胰腺，经胰酶消化，以含10％血清的RPM11640培养基培养。细胞长满皿底85％时，用胰酶消化传代，传代5～6次后细胞活力下降，细胞大量死亡漂浮，留下... 目的寻找胰腺干细胞扩增方法，为研究糖尿病的细胞治疗提供种子细胞。方法无菌采集胎猪胰腺，经胰酶消化，以含10％血清的RPM11640培养基培养。细胞长满皿底85％时，用胰酶消化传代，传代5～6次后细胞活力下降，细胞大量死亡漂浮，留下少数贴壁的小圆细胞。将培养基中的血清浓度提高到15％，贴壁的小圆细胞能快速增殖并形成细胞克隆，4～6d便可融汇成单层。采用免疫组织化学方法对所获得的的细胞进行胰腺干细胞特征检测。结果经上述方法处理的细胞具有旺盛的增殖能力，可以连续传代，目前已传至64代。采用免疫组织化学检测细胞表达胰腺干细胞特征性标志物，胰肠同源域因子1（PDX-1）、葡萄糖转运子2（GLUT-2）、巢蛋白、波形蛋白；经诱导后细胞表达胰腺内分泌细胞的标志为胰高血糖素、胰岛素、生长抑素、胰多肽。结论通过该方法可以获得大规模扩增的胰腺干细胞，该细胞在体外诱导可分化形成胰腺内分泌部4种主要细胞。 展开更多
关键词 胰岛 胰腺干细胞 糖尿病 免疫组织化学 胎猪
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脂质体介导抗猪瘟病毒基因转染猪胎儿成纤维细胞的条件优化
7
作者 曲洪磊 李方正 +2 位作者 张莉平 周婧 宋学雄 《青岛农业大学学报（自然科学版）》 2012年第3期176-180,共5页
本研究以组织块法分离大白猪胎儿成纤维细胞(Porcine fetus fibroblasts,PFF),通过脂质体将含有抗猪瘟病毒基因及绿色荧光蛋白基因(GFP)的重组质粒转入猪胎儿成纤维细胞,探讨转染猪胎儿成纤维细胞的影响因素,如DNA质量、脂质体用量及转... 本研究以组织块法分离大白猪胎儿成纤维细胞(Porcine fetus fibroblasts,PFF),通过脂质体将含有抗猪瘟病毒基因及绿色荧光蛋白基因(GFP)的重组质粒转入猪胎儿成纤维细胞,探讨转染猪胎儿成纤维细胞的影响因素,如DNA质量、脂质体用量及转染时间。实验发现脂质体2.5uL、质粒1.2μg、转染时间6h时转染率最高,为32.5%。过量的脂质体、质粒及过长的转染时间(>6h)会引起细胞的皱缩及死亡。本研究旨在为构建抗猪瘟病毒转基因克隆猪提供核供体。 展开更多
关键词 脂质体 抗猪瘟病毒 猪胎儿成纤维细胞
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脂质体介导抗乙脑病毒载体转染猪胎儿成纤维细胞条件的优化
8
作者 唐元凤 李方正 +4 位作者 张莉平 周婧 曲洪磊 张文平 宋学雄 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2013年第4期9-11,14,I0002,共5页
本试验旨在探索脂质体Lipofectamine TM2000介导抗猪乙脑病毒(Anti-JEV)载体转染猪胎儿成纤维细胞(PFF)的最适条件,为构建Anti-JEV转基因胚胎提供供核细胞。从妊娠大白母猪获取10～15cm猪胎儿,采集背部皮肤用于组织块法培养分离PFF。结... 本试验旨在探索脂质体Lipofectamine TM2000介导抗猪乙脑病毒(Anti-JEV)载体转染猪胎儿成纤维细胞(PFF)的最适条件,为构建Anti-JEV转基因胚胎提供供核细胞。从妊娠大白母猪获取10～15cm猪胎儿,采集背部皮肤用于组织块法培养分离PFF。结果显示,细胞培养至P7代,生长曲线正常;P5-7代细胞用于抗猪乙脑病毒载体转染,当质粒DNA量设定为0.35、0.7、1.05μg和1.4μg时,转染率分别为12.75%、36.82%、24.12%和8.85%;当脂质体量设定为0.7、1.4、2.1、2.8μL和3.5μL时,转染率分别为13.08%、21.71%、37.15%、24.21%和9.21%;当转染时间设定为2.5、4.5、6.5h和8.5h时,转染率分别为3.97%、38.48%、17.54%和12.47%。这些结果表明,2.1μL脂质体介导0.7μg质粒DNA转染4.5h转染效率最高。 展开更多
关键词 抗乙脑病毒载体 猪胎儿成纤维细胞 脂质体 转染
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妊娠中期猪胎儿神经干细胞分离培养及分化
9
作者 刘军 李艳艳 郑月茂 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期399-401,共3页
从妊娠中期猪胎儿(胎龄60 d)脑组织分离培养神经干细胞并诱导其贴壁分化,采用RT-PCR技术检测干细胞及其分化细胞的表面标志。结果显示,神经干细胞中DCX、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog、Sox2和Nestin表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化... 从妊娠中期猪胎儿(胎龄60 d)脑组织分离培养神经干细胞并诱导其贴壁分化,采用RT-PCR技术检测干细胞及其分化细胞的表面标志。结果显示,神经干细胞中DCX、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog、Sox2和Nestin表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2)。结果表明,从妊娠中期猪胎儿脑组织可以分离神经干细胞,神经干细胞具有自我更新和分化潜能。 展开更多
关键词 神经干细胞 细胞分化 妊娠中期猪胎儿
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