目的利用成簇的规律间隔短回文重复序列和相关蛋白9(clustered regular interval short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除长白猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)的PIN1基...目的利用成簇的规律间隔短回文重复序列和相关蛋白9(clustered regular interval short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除长白猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)的PIN1基因,以构建PIN1基因敲除长白猪胎儿成纤维细胞系。方法对人和猪的PIN1基因进行同源性分析。利用在线工具设计2个靶向猪PIN1基因第二个外显子区的sgRNAs,并克隆至pX330骨架质粒中。将构建成功的打靶质粒和Neomycin抗性质粒共转染至PFFs中,用G418药物筛选出抗性单细胞克隆,测序鉴定其基因型并从转录和翻译水平鉴定PIN1的表达。结果同源性分析显示人和猪PIN1蛋白的氨基酸序列一致性和相似性均为98%,二者三维结构的均方根偏差(RMSD)值为0.014。获得15个PIN1基因敲除的纯合单克隆细胞系,并且证实PIN1蛋白在翻译水平被完全敲除。结论利用双sgRNAs引导的CRSIPR/Cas9系统在PFFs中高效实现PIN1基因的双等位基因敲除,成功建立PIN1基因敲除的长白猪胎儿成纤维细胞系。展开更多
文摘目的利用成簇的规律间隔短回文重复序列和相关蛋白9(clustered regular interval short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除长白猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)的PIN1基因,以构建PIN1基因敲除长白猪胎儿成纤维细胞系。方法对人和猪的PIN1基因进行同源性分析。利用在线工具设计2个靶向猪PIN1基因第二个外显子区的sgRNAs,并克隆至pX330骨架质粒中。将构建成功的打靶质粒和Neomycin抗性质粒共转染至PFFs中,用G418药物筛选出抗性单细胞克隆,测序鉴定其基因型并从转录和翻译水平鉴定PIN1的表达。结果同源性分析显示人和猪PIN1蛋白的氨基酸序列一致性和相似性均为98%,二者三维结构的均方根偏差(RMSD)值为0.014。获得15个PIN1基因敲除的纯合单克隆细胞系,并且证实PIN1蛋白在翻译水平被完全敲除。结论利用双sgRNAs引导的CRSIPR/Cas9系统在PFFs中高效实现PIN1基因的双等位基因敲除,成功建立PIN1基因敲除的长白猪胎儿成纤维细胞系。
