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植物病毒载体系统研究进展 被引量：4
1
作者 卢雅薇 沈文涛 +1 位作者 唐清杰 周鹏 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期29-36,共8页
植物病毒基因组一般较小,易于进行遗传操作而且感染过程简单,因而利用植物病毒载体表达外源基因在生物技术领域具有潜在的应用优势。文章主要介绍了抗原展示系统和多肽表达系统,并分别列举一些植物病毒作为表达载体的研究进展情况以及... 植物病毒基因组一般较小,易于进行遗传操作而且感染过程简单,因而利用植物病毒载体表达外源基因在生物技术领域具有潜在的应用优势。文章主要介绍了抗原展示系统和多肽表达系统,并分别列举一些植物病毒作为表达载体的研究进展情况以及应用前景。 展开更多
关键词 植物病毒 外源基因 抗原展示系统 多肽表达系统 病毒载体
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纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽的制备及其对DIC大鼠的治疗作用 被引量：1
2
作者 邹起练 郭江睿 +3 位作者 陈小芳 黄美娟 吴勇 陈元仲 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2010年第3期698-703,共6页
本研究利用酵母表达系统制备纤维连接蛋白(fibronectin,FN)N端肝素结合域多肽,检测多肽的生物学活性,进行多肽治疗DIC大鼠的实验研究。利用PCR技术从FNcDNA中扩增FN N端肝素结合域序列,将获得的目的基因片段克隆至T载体,筛选后转移至酵... 本研究利用酵母表达系统制备纤维连接蛋白(fibronectin,FN)N端肝素结合域多肽,检测多肽的生物学活性,进行多肽治疗DIC大鼠的实验研究。利用PCR技术从FNcDNA中扩增FN N端肝素结合域序列,将获得的目的基因片段克隆至T载体,筛选后转移至酵母表达pAo815SM载体进行选择,再构建重组酵母表达pPIC9K载体,线性化重组载体并转染GS115酵母细胞,在GS115酵母细胞表达目的多肽。发酵液经80%硫酸胺沉淀,沉淀物过S-100柱分离纯化,纯化物再经过SP柱纯化,测定多肽结合肝素等生物学活性。股静脉注射内毒素脂多糖(LPS)50mg/kg建立大鼠DIC模型。建立的DICSD大鼠40只,随机分2组,每组20只,一组为rhFNHN-29多肽治疗组,另一组为生理盐水对照组。治疗组分别于注射LPS前半小时、注射后2小时、4小时尾静脉注射rhFNHN-29多肽(10mg/kg);生理盐水对照组注射等体积生理盐水。另设正常对照组SD大鼠20只,注射等体积生理盐水作为正常对照组。各组大鼠于股静脉注射LPS后6小时,对侧股静脉抽血测血常规,分离血浆检测血浆TNFa和凝血象。于注射LPS后72小时处死大鼠,取肝、肾、脾、肺、心、脑组织进行病理组织学检查。结果表明:成功地在酵母表达系中表达了目的多肽,其表达量达到30mg/L,所表达的多肽具有结合肝素活性。在多肽抗DIC作用的动物实验中发现多肽治疗组的血浆TNFa水平、血常规指标、凝血象和病理组织学的改变都较生理盐水对照组更接近正常对照组。结论:成功地制备了rhFNHN-29多肽,这种多肽能在一定程度上预防和治疗DIC。 展开更多
关键词 纤维连接蛋白 肝素结合域多肽 酵母表达系统 弥漫性血管内凝血
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纤维连接蛋白肝素结合域多肽在昆虫表达系中表达及活性鉴定
3
作者 邹起练 陈元仲 +3 位作者 陈小芳 吴勇 陈萍 黄美娟 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第S1期32-38,共7页
目的:将纤维连接蛋白N端和C端两个肝素结合域基因片断克隆至昆虫表达系统中进行表达,分离纯化所表达多肽并进行多肽结合肝素、FN抗原性和抗血小板减少内毒素血症活性鉴定。方法:用高保真PCR技术从FNcDNA中扩增目的基因片段,将目的基因... 目的:将纤维连接蛋白N端和C端两个肝素结合域基因片断克隆至昆虫表达系统中进行表达,分离纯化所表达多肽并进行多肽结合肝素、FN抗原性和抗血小板减少内毒素血症活性鉴定。方法:用高保真PCR技术从FNcDNA中扩增目的基因片段,将目的基因片段克隆至昆虫表达系的Bac-to-Bac HT Vector,在E.coliDH5α中抗氨苄青霉素选择,挑选阳性菌斑通过PCR、酶切鉴定和DNA序列测定,确定无误,再扩增提取质粒,进一步转染MAX Efficiency DHIOBac^(TM)Competent E.coli,经三种抗菌素(卡那、庆大、四环素)联合IPTG、X-gal蓝白斑选择,挑取阳性白色菌斑提取质粒,PCR、酶切鉴定和DNA序列测定,确定无误,转染Sf 9昆虫细胞获取重组杆状病毒,重组杆状病毒再次转染Sf9昆虫细胞表达多肽。裂解Sf9昆虫细胞,SDS-PAGE分析裂解上清,镍离子亲和树脂分离纯化表达的多肽,Western blot鉴定多肽结合肝素和FN抗原性活性。动物实验探讨rhFNHC-36多肽抗血小板减少内毒素血症的作用。结果:纤维连接蛋白N端和C端两个肝素结合域多肽均在昆虫表达系统中得到表达,所表达的多肽具有与肝素结合的能力而不具FN抗原性。动物实验初步显示rhFNHC-36多肽具有抗血小板减少内毒素血症的作用。结论:在昆虫表达系统中表达纤维连接蛋白N端和C端两个肝素结合域多肽是可行的,所表达多肽具生物活性,但表达量尚较低,有待进一步优化表达以提高表达量。 展开更多
关键词 纤维连接蛋白 肝素结合域 多肽 昆虫表达系统
原文传递
纤维连接蛋白细胞结合区功能多肽在杆状病毒表达系统中的表达与纯化
4
作者 陈小芳 陈元仲 +1 位作者 邹起练 陈显凌 《生物技术通讯》 CAS 2008年第4期515-517,共3页
目的:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纤维连接蛋白(FN)细胞结合区功能多肽(CBD),并对其进行纯化和鉴定。方法:经PCR获得人血浆FN-CBD基因,酶切后定向克隆到T载体上,经测序正确后插入pFastBacHTB载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞... 目的:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纤维连接蛋白(FN)细胞结合区功能多肽(CBD),并对其进行纯化和鉴定。方法:经PCR获得人血浆FN-CBD基因,酶切后定向克隆到T载体上,经测序正确后插入pFastBacHTB载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞;用抗生素平板筛选重组杆粒,脂质体介导重组杆粒转染sf9昆虫细胞并进行蛋白表达;经Ni-NTA层析柱对重组多肽进行纯化,对纯化的多肽行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果:得到融合6个组氨酸残基的FN-CBD,SDS-PAGE显示其相对分子质量约为36000,Western-blot表明该多肽能与FN的多克隆抗体结合。结论:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统能成功表达出人血浆FN-CBD,且表达产物具有良好的免疫原性,为后续结构、功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 纤维连接蛋白 细胞结合区功能多肽 杆状病毒表达系统 蛋白纯化
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B族G蛋白偶联受体PAC1可调控表达体系的建立
5
作者 李梅 余榕捷 +3 位作者 钟佳萍 崔泽凯 杨延旭 张华华 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期636-643,共8页
PAC1是神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽(Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)的特异受体,属于B族G蛋白偶联受体,介导PACAP的神经递质、神经调质、神经保护、抗神经损伤及调控神经再生等功能,PAC1高表达和神经损... PAC1是神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽(Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)的特异受体,属于B族G蛋白偶联受体,介导PACAP的神经递质、神经调质、神经保护、抗神经损伤及调控神经再生等功能,PAC1高表达和神经损伤、肿瘤等生理病理过程密切相关。为了深入了解PAC1的功能,构建PAC1可调控表达的细胞系,通过优化的四环素控制表达系统实现PAC1在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞的强力霉素(doxycycline,Dox)依赖的可控表达。首先通过双酶切将编码PAC1和增强型黄色荧光蛋白(EYFP,enhanced yellow fluorescent protein)的融和基因PAC1-EYFP克隆到pTRE-Tight载体上,获得重组载体pTRE-PAC1-EYFP;基因测序鉴定正确后将新型的四环素调节元件载体pTet-on advanced和反应元件载体pTRE-PAC1-EYFP分别转入CHO细胞中,G418和潮霉素(Hygromycin)双抗筛选阳性克隆PAC1-Tet-CHO,使用梯度浓度四环素类似物强力霉素Dox诱导PAC1-EYFP表达,48 h后检测受体表达水平,并通过MTT法检测不同PAC1表达水平的细胞增殖活性。荧光检测和Western印迹结果显示,成功获得了具有良好诱导性的Dox依赖的PAC1可控表达的细胞系,这些细胞株在传10代后仍能稳定地可控表达PAC1。MTT结果显示PAC1表达水平越高,细胞增殖活性越强。成功所构建的Dox依赖的PAC1可控表达细胞系,为PAC1的生物学功能的深入研究奠定了基础。 展开更多
关键词 垂体腺苷酸环化酶激活多肽 受体 PAC1 四环素表达调控系统 强力霉素
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人APOBEC3H hap Ⅱ在昆虫表达系统中的表达及其纯化
6
作者 李婷 王虹 +4 位作者 张晓红 董燕 王涛 于晓方 韩雪 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第3期262-265,269,共5页
目的构建重组人APOBEC3H hapⅡ(A3H hapⅡ)杆状病毒表达载体,在昆虫细胞表达系统中表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化。方法采用PCR方法扩增A3H hapⅡ基因并加入His标签后,克隆至杆状病毒转移载体p Fast Bac1中,转化E.coli DH10Bac... 目的构建重组人APOBEC3H hapⅡ(A3H hapⅡ)杆状病毒表达载体,在昆虫细胞表达系统中表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化。方法采用PCR方法扩增A3H hapⅡ基因并加入His标签后,克隆至杆状病毒转移载体p Fast Bac1中,转化E.coli DH10Bac感受态细胞进行重组,构建质粒Bacmid-A3H hapⅡ-His。将质粒转染昆虫细胞sf9获得P1病毒,扩增后获得P3病毒,感染sf9细胞表达目的蛋白,并进行Western blot鉴定。经Ni-NAT树脂亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化,并通过免疫共沉淀试验检测A3H hapⅡ-His与其相互作用蛋白HIV-1 Vif之间的特异性结合。结果成功构建了质粒Bacmid-A3H hapⅡ-His;P3病毒感染sf9细胞后成功表达出相对分子质量约20 000的目的蛋白,且能够与HIV-1 Vif特异性结合。结论成功建立A3H hapⅡ昆虫表达体系,为进一步研究A3H hapⅡ与HIV-1 Vif之间的相互作用机制,并针对其相互作用位点设计抗HIV药物奠定了基础。 展开更多
关键词 APOBEC3H hapⅡ Vif基因 昆虫表达系统 基因表达 纯化
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