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过表达miR-18a-5p对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制 被引量:5
1
作者 玛依努尔.达吾提 胡尼其古丽.阿巴克 +2 位作者 阿依努尔.玉苏普 祖丽胡玛尔.阿卜杜合力力 依米提.热合曼 《山东医药》 CAS 2018年第8期10-13,共4页
目的探讨过表达miR-18a-5p对结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法将结肠癌SW480细胞随机分为miR-18a-5p-e GFP组、NC-e GFP组、空白对照组,miR-18a-5p-e GFP组、NC-e GFP组分别转染含miR-18a-5p-e GFP、NC-e GFP... 目的探讨过表达miR-18a-5p对结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法将结肠癌SW480细胞随机分为miR-18a-5p-e GFP组、NC-e GFP组、空白对照组,miR-18a-5p-e GFP组、NC-e GFP组分别转染含miR-18a-5p-e GFP、NC-e GFP的质粒DNA,空白对照组不予转染。转染48 h,采用MTT法检测各组细胞增殖抑制率,采用流式细胞术检测各组早期凋亡率和晚期凋亡率,采用qRT-PCR法检测各组miR-18a-5p靶基因DUSP5、FZD3、CCND2表达。结果 miR-18a-5p-e GFP组、NC-e GFP组细胞增殖抑制率分别为(66.02±0.51)%、(23.81±0.64)%,两组比较P<0.05。miR-18a-5p-e GFP组、NC-e GFP组早期凋亡率和晚期凋亡率均高于空白对照组,且miR-18a-5p-e GFP组高于NC-e GFP组(P均<0.05)。miR-18a-5p-e GFP组miR-18a-5p靶基因DUSP5、FZD3表达明显高于NC-e GFP组,CCND2表达明显低于NC-e GFP组(P均<0.05)。结论过表达miR-18a-5p能够抑制结肠癌SW480细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能与调控靶基因DUSP5、FZD3、CCND2表达有关。 展开更多
关键词 结肠癌 微小RNA-18a-5p 质粒转染 细胞增殖 细胞凋亡
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组织因子对肝癌细胞侵袭能力的影响 被引量:3
2
作者 陈宁 张同琳 姚宏伟 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第11期909-913,共5页
组织因子(tissue factor,TF)是机体外源性凝血途径的启动因子,发挥生理性止血的重要作用.近来研究表明,TF除凝血功能外尚与多种恶性肿瘤的血管生成,侵袭转移及预后密切相关.为了探讨TF对人类肝癌细胞的影响,将成功构建带有正义/反义TFc... 组织因子(tissue factor,TF)是机体外源性凝血途径的启动因子,发挥生理性止血的重要作用.近来研究表明,TF除凝血功能外尚与多种恶性肿瘤的血管生成,侵袭转移及预后密切相关.为了探讨TF对人类肝癌细胞的影响,将成功构建带有正义/反义TFcDNA的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-TF(+)/(-)转染人肝癌细胞系HepG2,经药物筛选后获得稳定细胞克隆;应用RT-PCR和Western印迹检测内源性TF mRNA及蛋白质表达水平的变化;通过体外侵袭实验进一步分析对细胞侵袭能力所造成的影响.结果显示,转染pcDNA3.1-TF(+)质粒的细胞TF表达水平明显升高,相应的其侵袭能力明显增强,而转染pcDNA3.1-TF(-)质粒的细胞TF表达水平及体外侵袭能力显著下降.研究结果表明,TF可以增强人类肝癌细胞体外侵袭和转移能力,与肝癌的进展相关,可作为原发性肝癌治疗的一个新靶点进行研究. 展开更多
关键词 组织因子 质粒转染 肝细胞癌 肿瘤侵袭
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天马颗粒通过FLI-1/Klotho通路对结肠癌细胞HCT116增殖抑制的作用机制研究 被引量:3
3
作者 王华帅 谢彪 +1 位作者 罗敏 何永恒 《湖南中医药大学学报》 CAS 2022年第10期1656-1662,共7页
目的研究天马颗粒通过FLI-1/Klotho途径对结肠癌细胞(HCT116)增殖抑制的作用机制。方法将HCT116细胞分为blank组、shRNA组、shTMKL组、TMKL组。blank组为空白对照,shRNA组为HCT116细胞瞬时转染FLI-1 shRNA,shTMKL组为shRNA组基础上加入... 目的研究天马颗粒通过FLI-1/Klotho途径对结肠癌细胞(HCT116)增殖抑制的作用机制。方法将HCT116细胞分为blank组、shRNA组、shTMKL组、TMKL组。blank组为空白对照,shRNA组为HCT116细胞瞬时转染FLI-1 shRNA,shTMKL组为shRNA组基础上加入天马颗粒血清干预,TMKL组为天马颗粒血清干预HCT116细胞。各组细胞培育24 h后,进行后续实验检测。qPCR检测各组细胞FLI-1 mRNA和Klotho mRNA表达;Western blot法检测各组细胞FLI-1蛋白和Klotho蛋白相对表达;流式细胞术检测各组细胞周期及凋亡,并计算S期细胞比值(S-phase fraction,SPF);CCK-8法检测各组细胞增殖。结果与blank组相比,shRNA组、shTMKL组FLI-1、Klotho蛋白及mRNA表达量降低(P<0.05),TMKL组FLI-1、Klotho蛋白及mRNA表达量升高(P<0.05);与shRNA组相比,shTMKL组FLI-1、Klotho蛋白及mRNA表达量差异无统计学意义(P>0.05),TMKL组FLI-1、Klotho蛋白及mRNA表达量升高(P<0.05);与shTMKL组相比,TMKL组FLI-1、Klotho蛋白及mRNA表达量升高(P<0.05)。与blank组相比,shRNA组HCT116细胞增殖能力增强(P<0.05)、SPF值升高(P<0.05)、凋亡率下降(P<0.05),shTMKL组、TMKL组HCT116细胞增殖能力受到抑制(P<0.05)、SPF值降低(P<0.05)、凋亡率升高(P<0.05);与shRNA组相比,shTMKL组、TMKL组HCT116细胞增殖能力受到抑制(P<0.05)、SPF值降低(P<0.05)、凋亡率升高(P<0.05);与shTMKL组相比,TMKL组HCT116细胞增殖能力受到抑制(P<0.05)、SPF值降低(P<0.05)、凋亡率升高(P<0.05)。结论天马颗粒可通过FLI-1基因调控Klotho蛋白表达,进而抑制HCT116细胞增殖、诱导凋亡。 展开更多
关键词 天马颗粒 FLI-1/Klotho通路 结肠癌 细胞增殖 质粒转染 中药血清 机制研究
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SREBP-1基因过表达促进人肾小管上皮细胞甘油三酯形成 被引量:2
4
作者 郝军 郑书深 +5 位作者 赵建德 刘青娟 赵松 刘淑霞 刘巍 段惠军 《中国组织化学与细胞化学杂志》 CAS CSCD 2010年第3期252-256,共5页
目的 SREBP-1重组质粒转染人肾小管上皮细胞(HKC)检测SREBP-1基因表达和细胞内脂滴的关系。方法体外培养人肾小管上皮细胞并随机分为空白对照组、pcDNA3.1空质粒对照组和pcDNA3.1-SC1重组质粒转染组,采用阳离子脂质体法将SREBP-1特异性... 目的 SREBP-1重组质粒转染人肾小管上皮细胞(HKC)检测SREBP-1基因表达和细胞内脂滴的关系。方法体外培养人肾小管上皮细胞并随机分为空白对照组、pcDNA3.1空质粒对照组和pcDNA3.1-SC1重组质粒转染组,采用阳离子脂质体法将SREBP-1特异性质粒pcDNA3.1-SC1及pcDNA3.1空质粒转染到细胞内并培养48小时,半定量RT-PCR和Westernblot分析目标基因表达丰度的变化,并采用油红O染色检测细胞内脂滴。结果 pcDNA3.1-SC1重组质粒转染的细胞内SREBP-1mRNA表达呈现明显升高,扩增条带积分光密度值分别是空白对照组和阴性对照组的6.158倍和4.194倍,SREBP-1蛋白也出现明显上调,条带积分光密度值为3.092±0.254。空白对照组和pcDNA3.1阴性对照组细胞内均未见有红染脂滴颗粒,而pcDNA3.1-SC1重组质粒转染组中出现了清晰的红染颗粒。结论 SREBP-1表达可增加人肾小管上皮细胞脂肪合成证实HKC细胞中SREBP-1表达和脂滴形成之间存在有直接关系。 展开更多
关键词 固醇调节元件结合蛋白-1 人肾小管上皮细胞 脂滴形成 质粒转染
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比较不同频率低频超声联合微泡促进脂质体介导的pEGFP质粒转染人前列腺癌细胞的实验研究 被引量:2
5
作者 张蔚 白文坤 +4 位作者 寿文德 王玉 陈旖旎 杨雨 胡兵 《临床超声医学杂志》 2015年第3期145-148,共4页
目的比较不同频率低频超声联合微泡促进脂质体介导的p EGFP质粒转染人前列腺癌PC3细胞。方法实验共分7组:空白对照组仅人前列腺癌PC3细胞株,不进行任何处理;质粒组每毫升细胞悬液中加入1μg质粒;脂质体组每毫升细胞悬液中加入100μl转染... 目的比较不同频率低频超声联合微泡促进脂质体介导的p EGFP质粒转染人前列腺癌PC3细胞。方法实验共分7组:空白对照组仅人前列腺癌PC3细胞株,不进行任何处理;质粒组每毫升细胞悬液中加入1μg质粒;脂质体组每毫升细胞悬液中加入100μl转染液;脂质体+微泡组每毫升细胞中悬液加入100μl转染液和200μl微泡,低频超声联合脂质体+微泡组每毫升细胞悬液中加入100μl转染液和200μl微泡,同时采用声功率为400 m W/cm2的脉冲超声波辐照模式,辐照时间240 s,占空比设为1∶1,依据辐照频率不同又分3个亚组,分别为20 k Hz超声组、500 k Hz超声组和1 MHz超声组。每组设6个复孔。各组经处理后继续培养24 h,荧光显微镜观察转染情况;流式细胞仪检测各组转染率。结果荧光显微镜下,低频超声联合脂质体+微泡组PC3细胞胞质内可见大量绿色荧光蛋白表达,明显多于其他各组,各亚组间又以20 k Hz超声组绿色荧光蛋白较多;脂质体组和脂质体+微泡组绿色荧光蛋白表达量亦多于空白对照组和质粒组。流式细胞仪检测显示,低频超声联合脂质体微泡组转染率高于质粒组,其中20 k Hz超声组转染率最高,明显高于其他各组,差异有统计学意义(P<0.05)。脂质体组与脂质体+微泡组之间、500 k Hz超声组与1 MHz超声组之间转染率比较差异无统计学意义。结论低频超声辐照微泡可显著促进脂质体介导的p EGFP质粒转染人前列腺癌PC3细胞。在相同声功率、相同辐照面积下,随着辐照频率的升高,转染率呈现下降趋势。 展开更多
关键词 超声检查 低频 微泡 质粒转染 前列腺癌细胞
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乳腺癌细胞HMGA1稳定株构建及对细胞增殖的影响 被引量:2
6
作者 胡芳琳 钟小林 +1 位作者 陈亚军 钟警 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2019年第11期1729-1734,共6页
目的:构建高迁移率族蛋白A1(HMGA1)表达载体及乳腺癌MCF7和T47D细胞HMGA1高表达稳定株,并检测HMGA1高表达对MCF7和T47D细胞增殖的影响。方法:通过PCR扩增HMGA1基因编码框,将HMGA1编码框连接于GV219[pcDNA3.1(-)]载体,经测序确认后,将pcD... 目的:构建高迁移率族蛋白A1(HMGA1)表达载体及乳腺癌MCF7和T47D细胞HMGA1高表达稳定株,并检测HMGA1高表达对MCF7和T47D细胞增殖的影响。方法:通过PCR扩增HMGA1基因编码框,将HMGA1编码框连接于GV219[pcDNA3.1(-)]载体,经测序确认后,将pcDNA3.1(-)/HMGA1分别转染至MCF7和T47D细胞中,再经遗传霉素(G418)筛选单克隆株并扩大培养。通过Western blot检测各稳定细胞株HMGA1的表达,从而筛选出HMGA1稳定高表达的细胞株。实验进一步采用MTT比色法和细胞克隆形成实验检测HMGA1高表达对细胞增殖能力的影响。结果:成功构建pcDNA3.1(-)/HMGA1载体;成功建立稳定高表达HMGA1的MCF7和T47D细胞株;MTT实验结果表明MCF7和T47D细胞HMGA1高表达稳定株增殖能力比对照组明显增强(P<0.001);克隆形成实验结果显示HMGA1高表达稳定株克隆形成率明显高于对照组(P<0.001)。结论:HMGA1稳定高表达可明显促进乳腺癌MCF7和T47D细胞的增殖。 展开更多
关键词 乳腺癌 HMGA1 细胞增殖 质粒转染
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固醇调节元件结合蛋白基因的过表达对促进牛胎儿成纤维细胞脂肪形成的影响 被引量:1
7
作者 徐丽 郭立平 +5 位作者 朱淼 高雪 张路培 高会江 李俊雅 许尚忠 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第5期133-139,共7页
为了研究固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding factor 1,SREBP1)基因的表达与细胞脂肪形成的关系,本研究构建了pEGFP-C1-SREBP1重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒pEGFP-C1-SREBP1及pEGFP-C1空质粒转染至牛胎儿... 为了研究固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding factor 1,SREBP1)基因的表达与细胞脂肪形成的关系,本研究构建了pEGFP-C1-SREBP1重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒pEGFP-C1-SREBP1及pEGFP-C1空质粒转染至牛胎儿骨骼肌成纤维细胞培养48h,实时荧光定量PCR和Western blotting分析目标基因表达水平的变化,并采用油红O染色检测细胞内脂滴。结果发现,pEGFP-C1-SREBP1重组质粒转染细胞内SREBP1mRNA的表达水平显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05);SREBP1蛋白也出现明显上调;空白对照组和pEGFP-C1阴性对照组细胞内均未见有红染细胞,而pEGFP-C1-SREBP1重组质粒转染组中出现了清晰的红染细胞。说明SREBP1的表达可促进牛胎儿骨骼肌成纤维细胞脂肪合成,证实牛胎儿成纤维细胞中SREBP1表达和脂滴形成之间存在直接关系。 展开更多
关键词 固醇调节元件结合蛋白 过表达 牛胎儿成纤维细胞 脂滴形成 质粒转染
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软骨终板细胞印度刺猬蛋白表达对软骨终板退变的意义 被引量:1
8
作者 张健 宋洁富 +5 位作者 王小健 秦德安 安奇君 赵中涛 梁庆元 安雪军 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期2004-2007,共4页
目的探讨细胞内印度刺猬蛋白(Ihh)表达水平变化对软骨终板细胞的影响与意义。方法2018年5月至12月手术收集山西医科大学附属山西省人民医院骨科31例软骨终板(CEP)组织标本,体外分离人CEP细胞培养至P3代,随机分为过表达组、空载体组和敲... 目的探讨细胞内印度刺猬蛋白(Ihh)表达水平变化对软骨终板细胞的影响与意义。方法2018年5月至12月手术收集山西医科大学附属山西省人民医院骨科31例软骨终板(CEP)组织标本,体外分离人CEP细胞培养至P3代,随机分为过表达组、空载体组和敲减组,分别添加Ihh信使RNA质粒、空载体和Ihh沉默RNA质粒,质粒转染培养48 h后,使用蛋白质印迹法(Western blot)和实时定量聚合酶链反应法(RT-qPCR)检测标本Ihh及相关指标的蛋白和mRNA表达,免疫荧光和原位杂交染色观测细胞表型。3组实验数据因方差不齐,呈正态性分布,选择Welch检验,Games-Howell法组间多重比较。结果质粒干预CEP软骨细胞Ihh水平表达,Westernblot结果显示过表达组、空载体组和敲减组3组细胞中Ihh(0.79±0.09,0.31±0.20,0.04±0.03)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)(0.18±0.08,0.49±0.14,1.13±0.27)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)(0.78±0.17,0.51±0.12,0.37±0.06)灰度值差异有统计学意义(F=176.670、37.650、26.070,P<0.01)。RT-qPCR结果显示过表达组、空载体组和敲减组3组细胞中Ihh mRNA(3.13±1.21,0.92±0.18,0.39±0.22)、ColⅡmRNA(0.66±0.13,1.03±0.24,1.64±1.32)和MMP-13 mRNA(9.17±2.35,1.04±0.27,3.56±0.26)相对表达水平差异有统计学意义(F=17.170、15.890、34.732,P<0.01)。免疫荧光和原位杂交结果显示与空载体组比较,Ihh和MMP-13在过表达组最强,敲减组最弱,而ColⅡ在敲减组中最强,过表达组最弱。结论下调软骨细胞内Ihh表达可明显增加ColⅡ,减少MMP-13,维持细胞表型,进一步延缓CEP软骨细胞退变。 展开更多
关键词 印度刺猬蛋白 软骨终板 Modic退变 质粒转染
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人类mtDNA D-Loop区位点变异对基因表达的影响 被引量:1
9
作者 龚丽景 胡扬 +1 位作者 李燕春 梅涛 《体育科学》 CSSCI 北大核心 2014年第5期3-8,共6页
Case-Control研究表明,人线粒体基因(mtDNA)D-Loop区mt235、mt514-515、mt16183、mt16290和mt16319多态位点与有氧运动能力有关。拟从下游基因表达做进一步的研究,以探讨上述多态位点的分子调控机理。方法:采用全基因组合成法合成包含... Case-Control研究表明,人线粒体基因(mtDNA)D-Loop区mt235、mt514-515、mt16183、mt16290和mt16319多态位点与有氧运动能力有关。拟从下游基因表达做进一步的研究,以探讨上述多态位点的分子调控机理。方法:采用全基因组合成法合成包含上述多态位点的DNA序列,分别连接到pGL3-promoter载体构建重组质粒,将重组质粒转染至293T细胞,观察携带5对mtDNA质粒对下游双荧光素酶报告基因的表达及荧光素酶mRNA表达的影响。结果:携带mt235A、mt514-515CA、mt16183A和mt16319G的载体转染细胞的双荧光素酶基因表达量显著高于mt235G、mt514-515Del、mt16183C和mt16319A(P<0.01);携带mt16290两种基因型的质粒转染细胞报告基因表达没有明显差异。与pGL3-promoter载体相比,携带mt16319A的质粒转染细胞荧光素酶mRNA极显著下降(P<0.01),携带mt16290位点的两种质粒对报告基因mRNA的影响没有差异。结论:mt235、mt514-515、mt16183和mt16319多态位点影响荧光素酶基因表达,mt235A、mt514-515CA和mt16183A上调基因转录和翻译,mt16319A下调基因转录。这些基因表达上的差异可能是影响人有氧运动能力的重要调控因素。 展开更多
关键词 基因多态性 线粒体基因 基因表达 D-LOOP区 质粒转染
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细胞信号转导抑制因子3影响青少年特发性脊柱侧凸畸形软骨内的成骨活性 被引量:1
10
作者 孙锦鹏 刘军 +4 位作者 白云峰 华峰 王浩然 郑宏瑞 吴涛 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2022年第26期4160-4165,共6页
背景:已有相关研究报道,瘦素与细胞信号转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)表达异常在青少年特发性脊柱侧凸畸形发病中起重要作用。目的:探讨SOCS3是否通过瘦素信号传导通路调节软骨细胞内成骨活性。方法:①将人... 背景:已有相关研究报道,瘦素与细胞信号转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)表达异常在青少年特发性脊柱侧凸畸形发病中起重要作用。目的:探讨SOCS3是否通过瘦素信号传导通路调节软骨细胞内成骨活性。方法:①将人棘突软骨细胞分别以0(对照组),100μg/L瘦素刺激24 h,免疫组化染色观察Ⅱ型胶原表达。②将人棘突软骨细胞分9组培养,分别为空白对照组、转染pcDNA3.1-NC组、转染pcDNA3.1-SOCS3组、转染siRNA-NC组、转染siRNA-SOCS3组、瘦素+转染pcDNA3.1-NC组、瘦素+转染pcDNA3.1-SOCS3组、瘦素+转染siRNA-NC组、瘦素+转染siRNA-SOCS3组。置于培养箱中培养24 h后,实时荧光定量PCR法检测SOCS3 mRNA的表达量,MTT法检测细胞抑制率。结果与结论:①免疫组化染色显示,瘦素刺激组软骨细胞Ⅱ型胶原表达多于对照组。②实时荧光定量PCR检测显示,转染pcDNA3.1-SOCS3可显著提高软骨细胞SOCS3 mRNA表达量,转染siRNA-SOCS3可显著降低软骨细胞SOCS3 mRNA表达量,转染pcDNA3.1-NC、siRNA-NC对软骨细胞的SOCS3 mRNA表达量无影响;瘦素预刺激可提高转染pcDNA3.1-SOCS3、siRNA-SOCS3软骨细胞的SOCS3 mRNA表达量,对转染pcDNA3.1-NC、siRNA-NC软骨细胞的SOCS3 mRNA表达量无影响。MTT检测显示,转染pcDNA3.1-SOCS3可抑制软骨细胞内成骨活性,转染siRNA-SOCS3可增强软骨细胞内成骨活性;瘦素预刺激可提高转染pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-SOCS3、siRNA-NC、siRNA-SOCS3软骨细胞内成骨活性。③结果表明,瘦素刺激可提高软骨细胞内成骨活性,SOCS3表达上调可通过瘦素抵抗抑制软骨细胞内成骨活性。 展开更多
关键词 瘦素 细胞信号转导抑制因子3 软骨细胞 青少年 脊柱侧凸畸形 质粒转染
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RNAi技术体外沉默肌肉环指蛋白1的研究
11
作者 朱志祥 梁炳生 +4 位作者 冯勇 达志峰 丁洁 韦建 贾英伟 《中华细胞与干细胞杂志(电子版)》 2013年第2期20-24,共5页
目的探讨RNAi技术体外抑制大鼠肌肉环状指蛋白1(MuRF-1)基因表达的效果,筛选出针对MuRF-1基因最有效的siRNA重组质粒。方法根据大鼠MuRF-1基因的mRNA序列,设计4组干扰序列,即siRNA MuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,利用lipofactamine2000转染试剂... 目的探讨RNAi技术体外抑制大鼠肌肉环状指蛋白1(MuRF-1)基因表达的效果,筛选出针对MuRF-1基因最有效的siRNA重组质粒。方法根据大鼠MuRF-1基因的mRNA序列,设计4组干扰序列,即siRNA MuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,利用lipofactamine2000转染试剂将siRNA重组质粒转染大鼠成肌细胞系L6,于转染后48 h与72 h,采用实时定量PCR和Western blot或免疫印迹检测其对MuRF-1表达的抑制效果。MuRFl基因siRNA重组质粒瞬时转染后mRNA和蛋白质数据以x±s表示。对照组与四组实验组的比较用单因素方差分析;多个样本均数的两两比较用LSD检验。结果(1)实时定量PCR显示四组干扰质粒MuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对基因MuRF-1的mRNA的抑制率在转染后48 h分别为67﹪、31﹪、11﹪,20﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=4.527,P=0.024);72 h分别为79﹪、59﹪、50﹪和61﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=19.088,P<0.001),与48 h相比,抑制效应更为明显,但以siRNA MuRF1-Ⅰ的抑制效果最为明显(t=8.201,P<0.001)。(2)使用Western印迹灰度分析显示四组干扰序列对基因MuRF-1的蛋白的抑制率在转染后48 h分别为61﹪、40﹪、9﹪和15﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=4.286,P=0.028);72 h分别为70﹪、54﹪、30﹪和46﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=3.731,P=0.042);与48 h相比,MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ抑制效应与对照组相比有显著性差异(tⅠ=3.256,P=0.009;tⅡ=2.512,P=0.03),但MuRFl-Ⅲ和MuRFl-Ⅳ与对照组相比仍无显著性差异(P>0.05)。四对序列中,以siRNAMuRF1-Ⅰ的抑制效果最为明显。蛋白水平的抑制效果与mRNA水平基本一致。结论成功筛选出对MuRF-1基因有效的siRNA重组质粒,即siRNA MuRF1-Ⅰ,为通过RNAi技术进一步研究其功能以及基因靶向治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 成肌细胞 L6 MuRF-1 质粒转染 RNA干扰
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稳定高表达MT-1E基因人肾小管上皮HK-2细胞株的构建
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作者 李莎 罗磊 +4 位作者 黄邵玲 李继猛 熊艳艳 朱雪芹 谢颖 《广东医学》 CAS 2022年第4期416-421,共6页
目的成功构建高表达金属硫蛋白MT-1E基因的人肾小管上皮HK-2细胞株。方法利用转染技术将测序鉴定后的质粒转染至HK-2细胞,使用嘌呤霉素筛选转染的HK-2细胞,荧光显微镜观察并记录,通过western blot技术对阴性对照细胞组和高表达MT-1E组进... 目的成功构建高表达金属硫蛋白MT-1E基因的人肾小管上皮HK-2细胞株。方法利用转染技术将测序鉴定后的质粒转染至HK-2细胞,使用嘌呤霉素筛选转染的HK-2细胞,荧光显微镜观察并记录,通过western blot技术对阴性对照细胞组和高表达MT-1E组进行MT-1E蛋白表达量鉴定。结果转染后的质粒测序结果包含MT-1E基因序列,嘌呤霉素筛选最小致死浓度为4μg/mL,高表达MT-1E组蛋白相对表达量为2.79±0.16,与阴性对照细胞组比较,差异有统计学意义(t=15.89,P=0.016)。结论本研究完成高表达MT-1E基因的HK-2细胞株构建,可用于后续相关分子生物学实验。 展开更多
关键词 人肾小管上皮细胞 金属硫蛋白 质粒转染
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心肌组织稳定过表达Hotair的新生小鼠模型建立及验证
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作者 费乔曼 邱曼曼 +3 位作者 贾子恒 王雯雯 杨冰 张玲 《山东医药》 CAS 2020年第23期25-29,共5页
目的建立一种心肌组织稳定过表达Hotair的新生小鼠模型并进行验证。方法采用改良后的重叠延伸PCR法从小鼠基因组中获取目的基因Hotair,构建过表达Hotair的慢病毒质粒,并采用高分子聚合物转染法进行包装及浓缩纯化,测序结果显示构建的慢... 目的建立一种心肌组织稳定过表达Hotair的新生小鼠模型并进行验证。方法采用改良后的重叠延伸PCR法从小鼠基因组中获取目的基因Hotair,构建过表达Hotair的慢病毒质粒,并采用高分子聚合物转染法进行包装及浓缩纯化,测序结果显示构建的慢病毒质粒Hotair序列正确。将18只P0期(出生24 h内)小鼠随机分为Hotair过表达组、阴性对照组、空白对照组,每组6只。Hotair过表达组于左侧胸腔第五肋间隙注射浓缩后的Hotair慢病毒10μL,阴性对照组和空白对照组分别注射等量空载病毒和生理盐水;各组注射4 d后处死小鼠,取心脏组织。采用实时定量荧光PCR法检测Hotair及受Hotair协同调控的赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)mRNA表达,Western blotting法检测LSD1调控的下游蛋白即组蛋白H3二甲基化的赖氨酸4(H3K4me2)表达。结果Hotair过表达组心肌组织Hotair表达高于阴性对照组和空白对照组,H3K4me2蛋白表达低于阴性对照组和空白对照组(P均<0.01)。Hotair过表达组与阴性对照组心肌组织LSD1 mRNA相对比表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功应用慢病毒载体建立心肌组织稳定过表达Hotair的新生小鼠模型;该模型构建方法简便快捷、Hotair过表达效果明显,为后续研究Hotair参与心脏疾病的相关机制提供了可靠的动物模型。 展开更多
关键词 Hotair 质粒转染 去甲基化 慢病毒载体 心肌组织 小鼠
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HEK293T细胞中NLRP3炎性小体活化体系的构建
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作者 罗玲 赵锴 《激光生物学报》 CAS 2022年第4期331-336,共6页
NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性小体是一种蛋白复合体,在机体抵抗感染以及无菌性炎症中发挥了至关重要的作用。在HEK293T细胞中构建NLRP3炎性小体活化体系有助于研究其活化及调节机制。将质粒NLRP3、凋亡相关点样蛋白(ASC)... NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性小体是一种蛋白复合体,在机体抵抗感染以及无菌性炎症中发挥了至关重要的作用。在HEK293T细胞中构建NLRP3炎性小体活化体系有助于研究其活化及调节机制。将质粒NLRP3、凋亡相关点样蛋白(ASC)、胱冬肽酶-1(Caspase-1)以及pro-1β转染至HEK293T细胞中,随后加入尼日利亚菌素(Nigericin),并利用Western blot以及酶联免疫吸附试验(ELISA)测定成熟的IL-1β。试验结果表明:转染了完整NLRP3炎性小体组分的细胞蛋白和上清中均可检测到IL-1β的成熟体,反之,未转染完整组分的细胞蛋白及上清中不能检测到IL-1β成熟体;同时,随着NLRP3转染量的增加,可检测到的IL-1β的成熟体增加。本研究在HEK293T细胞中成功构建了NLRP3炎性小体活化体系,为后续研究奠定了基础。 展开更多
关键词 NLRP3炎性小体 HEK293T细胞 质粒转染 IL-1β成熟体 抗感染
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DLC-3表达对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响
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作者 武文 焦玮 +1 位作者 周沛红 李建国 《中华实用诊断与治疗杂志》 2019年第8期732-735,共4页
目的探讨外源性过表达DLC-3对乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移及凋亡活动的影响。方法对数生长期乳腺癌MCF-7细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组,实验组细胞转染DLC-3基因过表达质粒,阴性对照组细胞转染空白质粒,空白对照组细胞仅进行... 目的探讨外源性过表达DLC-3对乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移及凋亡活动的影响。方法对数生长期乳腺癌MCF-7细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组,实验组细胞转染DLC-3基因过表达质粒,阴性对照组细胞转染空白质粒,空白对照组细胞仅进行换液处理。3组采用实时PCR法检测细胞DLC-3mRNA相对表达量;转染12、24h后,采用细胞划痕实验检测细胞划痕愈合率;转染48h后,采用CCK-8实验检测细胞增殖率,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果实验组DLC-3mRNA相对表达量(17563.57±2880.85)高于空白对照组(0.56±0.43)和阴性对照组(1.00±0.00)(P<0.05),空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);转染48h后,实验组细胞增殖率[(31.47±5.57)%]低于阴性对照组[(36.27±3.71)%]和空白对照组[(37.90±5.70)%],但差异无统计学意义(P>0.05);转染12、24h后,实验组划痕愈合率[(32.769±4.349)%、(38.237±4.286)%]低于空白对照组[(37.506±1.836)%、(49.052±4.090)%](P<0.05),阴性对照组[(35.659±3.970)%、(48.724±5.092)%]与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);转染48h后,实验组细胞凋亡率[(15.893±1.597)%]高于阴性对照组[(10.277±1.947)%]和空白对照组[(11.973±1.564)%](P<0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论提高MCF-7细胞中DLC-3表达可降低细胞增殖水平,抑制其迁移能力,并促进细胞凋亡。 展开更多
关键词 乳腺癌 DLC-3 质粒转染 细胞划痕实验 流式细胞术
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糖皮质激素受体在白血病CYP3A5耐药中的信号转导作用
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作者 丁昭珩 王婷 +4 位作者 王海嵘 钟济华 沈莉菁 赵劲秋 陈芳源 《上海交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期950-952,共3页
目的探讨糖皮质激素受体在白血病CYP3A5耐药中的信号转导作用。方法采用DNA重组技术构建ptracer-hGR重组质粒,并用报告基因检测方法研究糖皮质激素受体对CYP3A5药物代谢酶转录、表达调控中的信号转导作用。结果菌落PCR及测序证实成功构... 目的探讨糖皮质激素受体在白血病CYP3A5耐药中的信号转导作用。方法采用DNA重组技术构建ptracer-hGR重组质粒,并用报告基因检测方法研究糖皮质激素受体对CYP3A5药物代谢酶转录、表达调控中的信号转导作用。结果菌落PCR及测序证实成功构建ptracer-hGR重组质粒。经阿糖胞苷、甲氨蝶呤和长春新碱三种化疗药物加药后共转染ptracer-hGR质粒的实验组荧光素酶相对活性显著高于单纯转染CYP3A5报告基因质粒的对照组,差异具有统计学意义(P=0.0362、0.0034和0.0164);而卡铂和米托蒽醌加药后,荧光素酶相对活性无明显增高趋势。结论阿糖胞苷、甲氨蝶呤和长春新碱三种化疗药物可能通过激活糖皮质激素受体这一信号途径而上调CYP3A5 mRNA的转录。 展开更多
关键词 CYP3A5基因 糖皮质激素受体 耐药 质粒转染 报告基因
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干预Wip1基因对人肝癌细胞系Huh-7的影响
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作者 李哲 刘军 +4 位作者 李晓明 赵丽娟 路健 吴灵潼 李秉寿 《中国临床研究》 CAS 2016年第10期1297-1302,共6页
目的干预人肝癌细胞系Huh-7的野生型p53诱导的磷酸酶1(Wip1)基因的表达,并观察其细胞生物学特性的变化。方法采用转染法,将促进Wip1基因表达的质粒和抑制Wip1基因表达的小干扰RNA(siRNA)分别转染Huh-7细胞。质粒转染的Huh-7细胞为... 目的干预人肝癌细胞系Huh-7的野生型p53诱导的磷酸酶1(Wip1)基因的表达,并观察其细胞生物学特性的变化。方法采用转染法,将促进Wip1基因表达的质粒和抑制Wip1基因表达的小干扰RNA(siRNA)分别转染Huh-7细胞。质粒转染的Huh-7细胞为质粒转染组,未经质粒转染的为未转染组,siRNA转染的为siRNA干扰组,用Negative Control siRNA转染的为NC组。转染后,行Western blot、CCK-8、细胞划痕、Transwell实验,检测各组细胞生物学特性的变化。结果质粒转染后,Huh-7细胞Wip1蛋白的表达上调,细胞增殖促进,增殖率在107.42%-176.36%之间。未转染组在0-24 h、-48 h、-72 h时的迁移距离分别小于质粒转染组:[(34.78±4.77)μm vs(61.60±2.02)μm,(33.98±3.48)μm vs(64.75±4.67)μm,(35.49±0.90)μm vs(67.89±4.23)μm,P均〈0.01]。未转染组3次Transwell实验的细胞迁移数均少于质粒转染组:[(90.00±3.00)vs(178.67±5.77),(74.33±26.95)vs(209.00±32.91),(79.33±20.74)vs(208.67±73.24),P均〈0.01]。siRNA转染后,Huh-7细胞Wip1蛋白的表达下调;细胞抑制率在12.37%-40.81%之间;NC组在0-24 h、-48 h、-72 h时的迁移距离分别大于siRNA干扰组:[(31.24±4.42)μm vs(16.04±6.21)μm,(31.33±2.13)μm vs(18.20±5.67)μm,(32.45±3.08)μm vs(18.99±5.32)μm,P均〈0.01];NC组3次Transwell实验的细胞迁移数均多于siRNA干扰组:[(74.00±12.17)vs(33.00±10.44),(77.00±5.00)vs(32.67±2.08),(81.33±17.16)vs(29.30±2.51),P均〈0.01]。结论促进Huh-7细胞Wip1基因表达后,其Wip1蛋白的表达上调,细胞增殖、迁移、侵袭能力增强。抑制Huh-7细胞Wip1基因表达后,其Wip1蛋白的表达下调,细胞增殖、迁移、侵袭能力被抑制。 展开更多
关键词 肝癌 磷酸酶1基因 质粒转染 小干扰核糖核酸 细胞生物学特性
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针对HP450基因shRNA真核表达载体的质粒转染
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作者 赖静 夏爱军 杨天燕 《中国医药导报》 CAS 2013年第29期4-6,F0003,共4页
目的以pGPH1/GFP/Neo质粒为载体,构建特异性针对HP450基因shRNA真核表达载体,并通过脂质体介导转染正常的大鼠肝细胞株(BRL),以探讨靶向干扰HP450基因对BRL细胞生长的影响。方法构建pGPH1/GFP/NeoHP450真核表达载体。应用脂质体转染技术... 目的以pGPH1/GFP/Neo质粒为载体,构建特异性针对HP450基因shRNA真核表达载体,并通过脂质体介导转染正常的大鼠肝细胞株(BRL),以探讨靶向干扰HP450基因对BRL细胞生长的影响。方法构建pGPH1/GFP/NeoHP450真核表达载体。应用脂质体转染技术,将重组的pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表达载体转染至大鼠肝细胞株(BRL),并于转染后6、12、24 h在荧光倒置显微镜下观察细胞状态。结果成功构建针对HP450基因shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450,通过脂质体介导转染大鼠肝细胞株BRL,在荧光倒置显微镜下可观察到细胞转染后的荧光现象。结论成功构建的HP450 shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450,可通过质粒转染方法转染至BRL细胞。 展开更多
关键词 HP450基因 质粒转染 BRL细胞株
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siRNA沉默人组织因子基因对大肠癌侵袭转移能力影响的观察
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作者 陈宁 张同琳 姚宏伟 《中华肿瘤防治杂志》 CAS 2009年第2期101-104,共4页
目的:应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)的手段抑制人类结肠癌细胞内组织因子(tissue factor,TF)基因表达,从而探讨对其侵袭转移能力的影响。方法:首先构建携带有针对TF基因有效的siRNA序列的真核细胞表达质粒pSU-PER-TF,用此质粒转... 目的:应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)的手段抑制人类结肠癌细胞内组织因子(tissue factor,TF)基因表达,从而探讨对其侵袭转移能力的影响。方法:首先构建携带有针对TF基因有效的siRNA序列的真核细胞表达质粒pSU-PER-TF,用此质粒转染人类结肠转移癌细胞系LoVo,应用RT-PCR和蛋白质印迹法从RNA及蛋白质水平检测证实细胞内源性TF基因被敲减后的表达水平变化,通过Matrigel体外侵袭实验进一步考证对细胞侵袭转移能力所造成的影响。结果:RT-PCR及蛋白质印迹法结果显示,与转染pSUPER质粒的LoVo细胞相比,转染重组干扰质粒pSUPER-TF-1的细胞其内源性TF基因的表达水平被显著敲减。Matrigel体外侵袭实验证实,转染pSUPER质粒的LoVo穿膜细胞均数为(220±7.0)个,而转染pSUPER-TF-1质粒的LoVo穿膜细胞均数为(102±4.0)个,两组差异有统计学意义,t=25.293,P=0.008。结果表明,转染pSU-PER-TF-1质粒的LoVo细胞侵袭转移能力显著下降。结论:以TF基因作为靶点应用RNA干扰技术敲减其表达可以明显降低LoVo细胞体外侵袭转移能力,为结肠癌的临床治疗提出新的思路,可以作为结肠癌治疗的一个新靶点。 展开更多
关键词 组织因子 RNA干扰 质粒转染 结肠癌转移
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GIP受体激动剂类药物筛选模型的构建
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作者 周海燕 吴艳阳 +1 位作者 刘东波 谢红旗 《激光生物学报》 CAS 2017年第6期534-539,共6页
目的:GIP受体激动剂类药物筛选模型的构建。方法:GIP受体激动剂能刺激胰岛素分泌,可作为治疗Ⅱ型糖尿病的潜在药物,因此,GIP受体激动剂的筛选模型十分重要。本研究采用PCR的方法扩增GIPR基因,将扩增产物酶切回收后与表达载体pCMV6-AC-GF... 目的:GIP受体激动剂类药物筛选模型的构建。方法:GIP受体激动剂能刺激胰岛素分泌,可作为治疗Ⅱ型糖尿病的潜在药物,因此,GIP受体激动剂的筛选模型十分重要。本研究采用PCR的方法扩增GIPR基因,将扩增产物酶切回收后与表达载体pCMV6-AC-GFP连接,构建pCMV6-AC-GIPR-GFP重组质粒,转化大肠杆菌DH5α经菌落扩增、质粒提取及序列测序重组质粒;利用脂质体lipofectamine2000转染重组质粒到RIN-m5F细胞中,通过抗生素G418筛选,挑单克隆得到稳定的RIN-m5F/GIPR-GFP细胞株。结果:结果表明PCR扩增获得长度为1 319 bp的GIPR基因,克隆至pCMV6-AC-GFP真核表达载体,经菌落PCR酶切鉴定及序列分析后,证实质粒pCMV6-AC-GIPR-GFP构建成功;通过荧光显微镜观察到细胞内荧光分布均匀,表明重组质粒成功转到RINm5F细胞中。该细胞株经阳性对照(D-Ala^2)GIP处理后,与对照组对比,具有荧光斑点聚集。结论:因此,GIP受体激动剂筛选模型RIN-m5F/GIPR-GFP成功构建,可用于筛选新的GIP受体激动剂,为糖尿病药物开发提供新的筛选模型。 展开更多
关键词 GIP受体激动剂 药物筛选模型 GFP RIN-m5F 质粒转染
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